分子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)綜合性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告小麥鈣依賴型蛋白激酶ZmC PK1(CD PK基表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)因的克隆、姓名:姚建學(xué)號:0941021 年級：09 級 - - -專業(yè):生物科學(xué)指導(dǎo)教師徐小靜2012年5月13日小麥鈣依賴型蛋白激酶 ZmCPK11 ( CDPK )基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)摘要 ：目的：學(xué)習(xí)并掌握完整的 DNA 重組技術(shù)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)從 DNA 到蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化。方法 ：本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用生物信息學(xué)的方法，利用Genbank 查找基因序列，利用 DNAman 查找酶 切位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)引物，從小麥中提取 RNA ， RT-PCR 擴(kuò)增之后測序檢驗(yàn)基因

2、序列的正確性，SDS-PAGE 分離蛋并構(gòu)建基因表達(dá)載體，將載體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞大腸桿菌，表達(dá)出蛋白，用結(jié)果：得到表達(dá)小麥鈣依賴型蛋白，并用親和層析法純化蛋白質(zhì)最后用免疫印跡鑒定蛋白。白激酶的大腸桿菌，并分離得到鈣依賴型蛋白激酶。結(jié)論 ：實(shí)現(xiàn)了基因的克隆及從 DNA 到蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程。關(guān)鍵字 ：小麥鈣依賴型蛋白激酶；克??；表達(dá)載體構(gòu)建；蛋白表達(dá)純化前言在植物細(xì)胞中 , 鈣離子作為第二信使 , 通過鈣依賴蛋白激酶 (CDPKs) 發(fā)揮功能是其傳遞信號的主要途徑之一。 CDPKs 廣泛存在于植物體內(nèi), 是目前植物體內(nèi)研究最深入的蛋白激酶。在植物體內(nèi) , CDPKs 廣泛分布于根、莖、葉、花和種子中

3、, 在分生細(xì)胞、木質(zhì)部細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、花粉細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞和胚細(xì)胞中。CDPKs 具有三個(gè)功能區(qū) , 從 N 端到 C 端依次為催化區(qū)、連接區(qū)和調(diào)控區(qū)。催化區(qū)由 300 多個(gè)氨基酸組成 , 具有典型的 Ser/Thr 蛋白激酶的亞結(jié)構(gòu)域 , 催化區(qū)結(jié)構(gòu)域的同源性較高 , 一般在 80% 以上。連接區(qū)由 20 30 個(gè)氨基酸組成 , 是蛋白激酶活性自抑制的區(qū)域 , 也是最為保守的區(qū)域。 在無 Ca2+ 存在時(shí), CDPKs 催化區(qū)可能與連接區(qū)結(jié)合 , 使其激酶活性被抑制。 調(diào)控區(qū)是鈣結(jié)合區(qū) , 也是 CDPKs有別于其它類激酶的特有區(qū)域。 此結(jié)構(gòu)域與典型的 CaM 序列的同源性大于 40%。由于

4、CDPKs 自身含有類似鈣調(diào)素的序列 , 因此其活性僅依賴于鈣而不依賴于鈣調(diào)素。有人甚至認(rèn)為 CDPKs 基因是由 Ca2+ -CaM 依賴的蛋白激酶基因與 CaM基因融合而成 , 這樣有利于它更快地對 Ca2+ 濃度變化作出反應(yīng)。該區(qū)域是CDPKs 中最不保守的結(jié)構(gòu)域 , 大多數(shù) CDPKs 有 4 個(gè)保守的 EF 手性結(jié)構(gòu) , 但 有些 CDPKs 卻只有 3 個(gè) EF 手性結(jié)構(gòu)。 CDPKs 的催化區(qū)前端 , 即 N 末端帶有 一段長短不一的序列 , 稱為可變結(jié)構(gòu)域。各類 CDPKs 在此結(jié)構(gòu)域上很少有同源 關(guān)系。許多 CDPKs 與 CaM 有一個(gè)共性 , 即可與疏水的基質(zhì)結(jié)合 , 如

5、苯基 -Sepharose;polypropylaspartamide gel; 固定化的酚噻嗪等，根據(jù)此特點(diǎn)，我們可以利用親和 層析的方法分離純化 CDPK。、實(shí)驗(yàn)原理1.利用 GenBank 查找基因序列，設(shè)計(jì)引物。2.提取總 RNA ， RT-PCR 擴(kuò)增該基因真核細(xì)胞絕大部分 RNA為rRNA （主要為28S、18S、5.8S和5S四種）（占80 85%）、tRNA 與小分子 RNA （占 1015%）和 mRNA （占 1 5%）。植物 RNA 的提取，主要包括以下 4 個(gè)步驟： 用機(jī)械研磨等方法破碎植物組織細(xì)胞； 加人蛋白質(zhì)變性劑，使核蛋白與 RNA分離，釋放出RNA ; 抑制內(nèi)源

6、和外源RNase活性; 將RNA、DNA、蛋白質(zhì)及其他細(xì)胞物質(zhì)分開。現(xiàn)在已有多種較為成熟的分離總RNA 的方法，其中 3 種最為常用，它們分別是苯酚法、胍鹽法和氯化鋰沉淀法。苯酚法是用SDS變性蛋白并抑制RNase活性，經(jīng)多次酚氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用 NaAc 和乙醇沉淀 RNA。胍鹽法是用異硫氰酸胍（或鹽酸胍）和巰基乙醇變性蛋白并抑制RNase活性，經(jīng)酚/氯仿抽提后.再沉淀 RNA。氯化鋰沉淀法是Li"在一定pH下時(shí)使RNA 沉淀。實(shí)驗(yàn)采用胍鹽法。逆轉(zhuǎn)錄PCR（ RT-PCR）包括逆轉(zhuǎn)錄（RT）和PCR兩個(gè)基本過程，逆轉(zhuǎn)錄是以mRNA為模板合成互補(bǔ)的 cDNA（com

7、plement DNA ）的過程；PCR是以逆轉(zhuǎn)錄得來的cDNA作為模板而進(jìn)行的PCR過程。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式 進(jìn)行。兩步法RT-PCR比較常見，在使用一個(gè)樣品檢測或克隆多個(gè)基因的 mRNA 時(shí)比較有用。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行 PCRo而一步法RT-PCR中，cDNA合成和擴(kuò)增反應(yīng)在同一管中進(jìn)行，不需要打開管蓋和轉(zhuǎn)移， 有助于減少污染。還可以得到更高的靈敏度，最低可以達(dá)到0.1 pg總RNA，因 為整個(gè)cDNA樣品都被擴(kuò)增。對于成功的一步法 RT-PCR, 般使用基因特異性 引物

8、（GSP）起始cDNA的合成。3. 重組表達(dá)載體的構(gòu)建將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及原核表達(dá)載體 P ET-30a經(jīng)Hi nd m、EcoRV雙酶切后, 以T4DNA連接酶連接，16C , 2h,轉(zhuǎn)化受體菌DH5a,篩選重組子后，Hind m、EcoRV雙酶切鑒定，篩選陽性克隆測序。4. 轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5a 菌株中實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌 DH5a 菌株為受體細(xì)胞，用 CaCl2 處理，使其處于感受態(tài)，然后與重組質(zhì)粒共保溫，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于 PET-30a質(zhì)粒帶有卡那霉素抗性基因，可 通過卡那霉素 抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入 PBS 質(zhì)粒，則在含卡那 霉素的培養(yǎng)基上不能生長。能在含 卡那霉素 培養(yǎng)基上

9、生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子） 肯定已導(dǎo)入了重組質(zhì)粒。5. 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化大腸桿菌中重組蛋白的表達(dá)主要有兩種模式組成型及誘導(dǎo)型， 主要由表達(dá) 載體本身決定。 在大腸桿菌中表達(dá)的外源蛋白對大腸桿菌本身的生長來說， 多為有害的，因此，目前常用的都是誘導(dǎo)表達(dá)型載體，如 pET 系列。在大腸桿菌增 殖階段，外源蛋白不表達(dá)，然后改變培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)條件也 有多種，比如加入 IPTG 或者乳糖，或通過溫度變化誘導(dǎo)表達(dá)。目前常用的多為IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)載體。DH5a誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，經(jīng)煮沸處理后，取上清，SDS PAGE分離目的蛋白。利用CDPK與疏水的基質(zhì)結(jié)合的特點(diǎn)，使用苯基-Sep

10、harose親和層析柱，進(jìn)行純 化。蛋白質(zhì)免疫印跡可用于鑒定目的蛋白， 主要由四個(gè)步驟組成， 首先是蛋白質(zhì)的 凝膠電泳，然后將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上固定，然后是抗原抗體免疫反應(yīng)， 最后是顯色。 因?yàn)榭乖贵w反應(yīng)往往受蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)差別的影響較小， 主要與 蛋白質(zhì)氨基酸序列有關(guān)， 所以凝膠電泳常采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。 可以轉(zhuǎn) 移固定蛋白質(zhì)的膜有多種類型，主要有硝酸纖維濾膜（ NC 膜）、尼龍膜和聚偏氟乙烯濾膜（ PVDF 膜）。硝酸纖維素膜是免疫印跡中應(yīng)用最廣的濾膜，尼龍膜與之相比優(yōu)勢在于它們可用不同抗體進(jìn)行多次檢測， 但轉(zhuǎn)移到尼龍膜上的蛋白質(zhì) 不僅沒有合適的染色方法進(jìn)行監(jiān)測， 而且抗體

11、容易與濾膜非特異性結(jié)合， 造成背 景很高。 PVDF 膜與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力遠(yuǎn)高于硝酸纖維素膜，它常用于蛋白質(zhì)的 序列測定。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上后進(jìn)行抗原抗體免疫反應(yīng)。 首先利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白常為脫脂奶粉或標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白） 封閉膜上未結(jié)合蛋白質(zhì)的位點(diǎn)， 然后用已 知的抗體作為一抗與膜上相關(guān)抗原反應(yīng)， 洗滌除去未結(jié)合的游離抗體后， 再用帶 有顯色標(biāo)記的一抗的抗體 （也就是二抗） 再與一抗進(jìn)行免疫反應(yīng)， 洗滌除去未反 應(yīng)的二抗后，就可以對膜進(jìn)行顯色鑒定。 二抗上的顯色標(biāo)記一般為同位素或者酶， 常用的為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，然后再加入相應(yīng)酶的底物進(jìn)行顯色。Western免疫印跡可檢測到ng

12、級蛋白質(zhì)的存在。二、實(shí)驗(yàn)用品1、實(shí)驗(yàn)材料小麥、原核表達(dá)載體 PET-30a T4 DNA Ligase和Ex Taq DNA聚合酶、以Hind川、EcoRV內(nèi)切酶、大腸桿菌 DH5a等 2儀器設(shè)備高壓滅菌鍋、恒溫?fù)u床、超凈工作臺、分光光度計(jì)、冷凍高速離心機(jī)、恒溫 水浴鍋、 50 mL 離心管、 1.5 mL EPPendorf 離心管、移液器及槍頭、試管、培養(yǎng)皿、碎冰、超低溫冰箱、 水平電泳槽、 電泳儀、 紫外檢測儀、 凝膠成像系統(tǒng)、 PCR 儀、0.2 mL PCR、管電爐（或10 mg/mL溶菌酶）、垂直板電泳槽、脫色搖床、 轉(zhuǎn)移電泳槽、培養(yǎng)皿（直徑15 cm, 10 cm每組各一個(gè)）、濾

13、紙、硝酸纖維素膜（NC 膜）、乳膠手套、平頭鑷子等。3試劑及溶液（參見實(shí)驗(yàn)講義）、實(shí)驗(yàn)步驟一）利用 GenBank 查找基因序列，設(shè)計(jì)引物。1、 NCBI 查找 ZmCPK11 序列，結(jié)果如下：1 ccaatgcagc cggacccgag cgggaacgcc aatgcgaaga cgaaactgcc gcagctggtg61 acggcgccgg ctccgtcgtc ggggcgtccg gcgtccgtgc ttccgtacaa gacggcgaac121 gtgcgggacc actaccgcat cggcaagaaa ctggggcagg ggcagttcgg caccacgta

14、c181 cagtgcgtgg gcaaggcgga cggcgctgag tacgcatgca agtccatccc caagcgcaag241 ctgctgtgcc gggaggacta cgaggacgtc taccgcgaga tccagatcat gcaccacctc301 tccgagcacc ccaacgtcgt ccgcatccgc ggcgcctacg aggacgcgct cttcgtgcac361 atcgtcatgg agctctgcgc cggcggcgag ctcttcgacc gcatcgtcgc caagggccac421 tacagtgagc gcgcggct

15、gc gaagctcatc aagaccattg tcggggtcgt ggagggatgt481 cactcgctcg gcgtcatgca ccgggacctc aagccggaga attttctctt tgccagcacc541 gccgaggaag ccccactcaa ggccactgac tttgggcttt ccatgttcta caagcccggt601 gataaattct ctgatgtcgt tggaagtcca tactatgttg caccagaggt gcttcagaaa661 tgctatggtc cagaagctga tgtgtggagc gcaggagtaa

16、 ttctgtacattttgctttgt721 ggtgtgcccc cgttttgggc agaaactgag gctggaatct tcaggcagat tctgcgaggc781 aaacttgatt ttgaatctga accctggcct agtatttctg atagtgctaa ggatctggtc841 tgcaatatgc ttacacggga tcctaaaaag agatttagtg ctcatgaggt tctctgtcac901 gcatggattg ttgacgatgc cgtggcacct gataagccta ttgattctgc tgttctctca961

17、 aggctgaagc atttttcggc aatgaacaag ctcaagaaga tggcattaagggttattgct1021 gaaagcctgt ctgaggaaga gattggaggt ctcaaggagt tgttcaagat gattgatact1081 gacagtagtg ggactataac atttgatgag ctgaaagatg gcttgaaaag ggtaggctct1141 gaattaacag agaacgaaat ccaggctcta atggaagcag ctgatattga taacagcgga1201 accatcgact acggcgaat

18、t cattgcagct acgttgcaca tgaacaaact ggagagggag1261 gaaaacttgg tttcagcatt ctcgtttttt gacaaagatg gaagtggctttataaccatc1321 gatgagctgt cacaagcatg tcgcgaattt ggtctcgatg acctccacct cgaggatatg1381 attaaagatg ttgaccagaa caatgatggc caaatcgact acagcgagtt cacggcgatg1441 atgaggaagg gcaatgctgg tgcaacagga aggagaac

19、ca tgaggaacag cttgcacttg1501 aatctcggcg aactcttgaa tcccagcaaa acctagcgcg ttactggaaggccttgtcag1561 gtacattccc atggcatctg aagtttttgg atgcgttgtc gatctgctgg cctattctga1621 gatgttgagt ggttatcctg tggtattact aagatgctgg acaattttcgtagtgctggt1681 ggtatcagct agagaagagg gatggctggc acaatgtggc tactatcgcc aactgctt

20、2、根據(jù)該序列，用DNAMAN進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，查看該序列上沒有的酶切位點(diǎn)，結(jié)果如下:20BstD102l333EheI397Sa pl1216EcoRI43BSC91I335BbeI403DrdI1276BsmI43BbvII355Sa pl429BssHII1319ClaI54P vuII355Alw44I637Eco57I1343NruI64NarI355Ap aLI676AlwNI1343Sp ol65EheI372Ecl136II704Bsp1407I 1357 Eco31I66Eco56I372EcoICRI 744 Eco57I1369 XhoI67BbeI374SstI745A

21、lwNI1371；SciI68NaeI374SacI771AlwNI1402XcmI186PflMI379Eco56I772Ap aBI1409MscI218Sp hI379SgrAI858BamHI1409BalI269AatII381NaeI882BspHI1551StuI328Mlu113I390Ecl136II 985 Eco57I1569 NcoI330SacII390EcoICRI1030 EcoNI1599 Eco57I330SstII392SacI1054Eco31I1715DraIII332NarI392SstI1180PvuII選取合適的酶切位點(diǎn)3、結(jié)合將要使用的質(zhì)粒的酶切

22、位點(diǎn)以及以上酶切位點(diǎn),進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，得到兩個(gè)引物為:P1:5' CCAATGCGAAGACGAAAC'Tm=57.7 C 添加酶切位點(diǎn)EcoR VP2:5'GGTGCTGGCAAAGAGAA' Tm=57.4 C 添加酶切位點(diǎn)Hind 川4、根據(jù)兩個(gè)Tm值，可得退火溫度為57.5C（二）提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增該基因1、總 RNA 的制備1)用干凈剪刀剪取 1 cm 長新鮮小麥幼苗葉片 23 片，立即放入無菌的1.5 mL 離心管中，加液氮后迅速用干凈鑷子搗碎成粉末，期間注意避免被液氮凍脆的葉片由于解凍而發(fā)生潮解，從而引起溶液 500 fL。RNA 的降解

23、。加入 RNA 提取緩沖(2)依次加入50 fL 2 mol/L乙酸鈉氯仿/異戊醇( 49：1)，充分混勻后置冰上(pH 4.0), 500也水飽和酚，100也10 min。解。3)4)5)6)9)4C下12 000 r/min離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。 加等體積異丙醇，20C沉淀0.5 ho4C下12 000 lymin離心15 min，收集沉淀。加500 L 75%乙醇洗滌沉淀，晾干沉淀，注意不能太干，否則不易溶沉淀的RNA溶于50 L DEPC處理的無菌水中。 取 10 fL 用 1%普通瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。在紫外燈下觀察結(jié)果。注意觀察總RNA 的 1 8S、28S

24、 特征條帶。2、RT-PCR1 ) 取高質(zhì)量的總 RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)在 0.5 mL 滅菌離心管中進(jìn)行，10f l 逆轉(zhuǎn)錄體系包括：滅菌去離子水總 RNA4此(總量1卩g)oligo dT (16) (10 卩 mol/L)0.5丄5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液逆轉(zhuǎn)錄酶0.5讓在加入后兩種成分前，混合物先在65°C加熱5 min后，迅速放置冰上,使 RNA 充分變性并和引物充分結(jié)合。加入逆轉(zhuǎn)錄酶后， 槍頭在反應(yīng)混合液中反復(fù)吸吐幾下，使得酶能夠完全加入到反應(yīng)體系中。酶從冰箱取出后放置在冰上，使用完畢，應(yīng)立即放回冰箱。(2)在逆轉(zhuǎn)錄酶指定的溫度下(一般為 42 C左右)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間一

25、般為90 min。反應(yīng)完畢后，70C下10 min，對酶進(jìn)行滅活。反應(yīng)產(chǎn)物于-20r凍存。(3)以上述逆轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)?？傮w積為50 uL,在 0.2 mL 滅菌的 PCR 管中依次加入：37.5滅菌的重蒸水 10>Taq buffer2.5 mmolL dNTPactin P1 (10 卩 moKL)kLactin P2(10 k mol L)kLcDNAkLkL加入Taq酶后，槍頭在反應(yīng)混合液中反復(fù)吸吐幾下，使得酶能夠完全加Taq酶0.5入到反應(yīng)體系中。 酶從冰箱取出后放置在冰上， 使用完畢， 應(yīng)立即放回冰箱。(4)將上述PCR管放入PCR儀中，設(shè)計(jì)程序：94C

26、預(yù)變性3 min，然后將下列三個(gè)步驟進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：94C變性1 min,62.9C退火1 min,72C延伸1 min,最后于72C下保溫10 min。3、測序確認(rèn)1)取 10 kL PCR 產(chǎn)物，用濃度為 0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。2)經(jīng)電泳鑒定大小正確后， 可繼續(xù)交送公司測序。 將測序的序列與 NCBI上的序列進(jìn)行比較，確定是否為玉米鈣依賴型蛋白激酶ZmC PK11 (CD PK)基因。三)重組表達(dá)載體的構(gòu)建1.取2個(gè)0.5 mL無菌小離心管，用 EcoR V和Hindm兩種限制性內(nèi)切酶同時(shí)對質(zhì)粒pET30a和PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，總體系均為50kL。滅菌重蒸水34 kL內(nèi)切酶反應(yīng)

27、緩沖液(10%5 kL質(zhì)?；蚰康?DNA 片段10 kL總量約 2 k)gEcoR V0.5kLHind m0.5kL加入限制性內(nèi)切酶后，槍頭在反應(yīng)混合液中反復(fù)吸吐幾下，使得酶能夠完全加入到反應(yīng)體系中，并能與其它成分充分混勻。酶從冰箱取出后放置在冰上，使用完畢，應(yīng)立即放回冰箱。2. 將上述酶切產(chǎn)物全部上樣，分別經(jīng) 0.8瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下用 刀片切下含目的 DNA 條帶的凝膠。盡量去掉不含 DNA 的多余凝膠。3從凝膠中回收 DNA ，操作步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。4將回收的兩種 DNA 片段進(jìn)行連接。在 0.5 mL 無菌小離心管中依次加入下列 溶液，總體積為 20 uL：2.5(

28、L滅菌的重蒸水 10 連接酶緩沖液 pET30a酶切片段目的基因酶切片段10kLkL加入連接酶后，槍頭在反應(yīng)混合液中反復(fù)吸吐幾下，使得酶能夠完全加T4 DNA 連接酶0.5入到反應(yīng)體系中，并能與其它成分充分混勻。16E連接過夜。四)轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5a 菌株中1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)取大腸桿菌DH5a菌株在LB平板上劃線，37E倒置培養(yǎng)12 h。(2)挑取單菌落接種于含5 mL LB培養(yǎng)基的試管中，在37C振蕩培養(yǎng)12 h,直至對數(shù)生長后期。3)取上述培養(yǎng)菌液 0.5 mL 菌液接種于含 50 mL LB 培養(yǎng)基的 250 mL 三角瓶中，在37E振蕩(240 r/min)培養(yǎng)約2至

29、3小時(shí)，至OD6oo = 0.40.6左右。4)取1 mL培養(yǎng)液放入1.5 ml離心管，冰上放置10 min，使培養(yǎng)物冷卻至 0E。5)在4E下，4 000 r/min離心10 min，去上清。6)用600 k冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液將菌體輕輕懸浮起來，再在冰上放置20 min。在4E下，4 000 r/min離心10 min,去上清。8)用200 k冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液將菌體輕輕懸浮起來，感受態(tài)細(xì)胞可在冰浴中放置， 24 h 之內(nèi)直接用于轉(zhuǎn)化。也可加入占總體積 15的甘油，混勻后，將菌液分裝到 1.5 mL 的離心管中，每管 中備用。100 L放入70

30、 r冰箱2細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（1）取100 L感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍,（2）加入PTE重組質(zhì)粒溶液10此（總量不超過解凍后立即置冰上。50 ng）,輕輕搖勻，冰上放置30 min。另取100 jL感受態(tài)細(xì)胞懸液，加入同體積的滅菌水代替質(zhì)粒 DNA , 作為對照組。（3） 42r水浴中熱激90 S,熱激后迅速置于冰上冷卻35 min。（4）向管中加入400丄LB液體培養(yǎng)基（不含Amp）,混勻后，37r振蕩培養(yǎng)45 min1 h,使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基 因（ Amp r ）。（5）將上述菌液搖勻后取100涂布于含卡那霉素的LB平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培

31、養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37r培養(yǎng)1416 h。對照組一取100此 菌液涂布于含相應(yīng)抗生素的平板上；對 照組二稀釋100倍后涂布于不含抗生素的 LB 平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。五）目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化一）蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)1）將含有 pET 重組質(zhì)粒的 DH5a 菌種（轉(zhuǎn)化子）在 LB 固體培養(yǎng)基 （含50 jZmL Kan）上劃線,37r 培養(yǎng) 1224 h。（ 2）用無菌牙簽挑取單菌落接種到含 5 mL LB 液體培養(yǎng)基 （含 50 jZg mLKan）的試管中，37 r振蕩培養(yǎng)過夜。（ 3）按照 1 ：100 比例分別接種到兩瓶含 50 mL 液體 LB 培養(yǎng)基 （含 5

32、0 jg/mL Kan）的三角瓶中，37r培養(yǎng)3 h。（4）取一瓶菌液加入IPTG至終濃度1 mM ,誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h,另一瓶不加IPTG繼續(xù)培養(yǎng)3 h,作為對照。4）分別取誘導(dǎo)及對照菌液 1.5 mL 于 1.5 mL 小離心管中， 5 000 rmin, 10min 離心收集菌體。（5） 用100 L1X樣品緩沖液懸浮菌體，沸水煮 5 mi n,冷卻。（6）12 000 rZmin離心10 min,上清液用于電泳。(二) SDS-P AGE1.電泳槽的安裝目前國內(nèi)大多數(shù)學(xué)生實(shí)驗(yàn)室用的是國產(chǎn)電泳槽。首先要將兩個(gè)洗凈擦干的玻璃板夾在一個(gè)硅膠套上，其中一個(gè)玻璃板上面高于另外一個(gè)玻璃板23 cm，上

33、面高的玻璃板下面與膠條之間有一個(gè)狹縫。然后將硅膠套連同雙層玻璃板夾在兩個(gè)有機(jī)玻璃制成的半電泳槽上，注意有狹縫的一邊在下面，矮玻璃板那面對著陰極。然后均勻用力將固定兩個(gè)半電泳槽的四個(gè)螺絲擰緊，保證兩個(gè)有機(jī)玻璃板中加入電極緩沖液后不漏溶液。稱取 2 g瓊脂粉加入100 mL電極緩沖液，在電爐上使瓊脂化開，然后用膠頭滴管吸取化開的瓊脂，沿著膠條讓瓊脂溶液順著玻璃板與膠條間的狹縫向下流，直到瓊脂溶液流到高的玻璃板下與膠條間的狹縫處,用瓊脂溶液將下面的狹縫封好。注意掌握瓊脂溶液沿著雙層玻璃板間上升的高度，最好控制在2mm左右，這樣既保證狹縫不漏溶液，又可避免丙烯酰胺凝膠F面高低不平。待瓊脂凝固后進(jìn)行下步

34、操作。2.制分離膠表7-2分離膠的配制分離膠濃丙烯酰胺凝分離膠緩蒸餾水TEMED10%過硫總體積度膠貯備液沖液(mL)(讓)酸銨（此）(mL)(mL)(mL)10%5.34.06.710801612.56.74.05.3108016%15%8.04.04.0108016按照表7-2在燒杯中配制12.5%分離膠溶液。當(dāng)加入10%過硫酸銨后，立即搖動(dòng)燒杯，使各溶液混勻，然后傾斜電泳槽，使燒杯臂靠在高玻璃板上，讓溶液順著高玻璃板流入雙層玻璃板之間，控制溶液高度距離矮玻璃板上緣23 cm，立即用膠頭滴灌在凝膠頂部加入 23 mm厚的水層，注意使水層順著玻璃板緩慢流到凝膠溶液表面，避免水溶液沖入凝膠溶液

35、中。然后在室溫（2030 r ）等待3060 min左右，凝膠凝固。3. 制濃縮膠表7-3濃縮膠的配制濃縮膠濃丙烯酰胺凝濃縮膠緩蒸餾水TEMED10 %過硫總體積度膠貯備液沖液(mL)(讓)酸銨（此）(mL)(mL)(mL)5%0.751.252.710305按照表7-3在燒杯中配制5%濃縮膠溶液。在加入過硫酸銨前，先將分離膠上面的水層倒掉，殘留水較多的時(shí)候可以用濾紙條把殘留的水吸去。 當(dāng)加入過硫酸銨后，立即搖動(dòng)燒杯，使各溶液混勻，然后傾斜電泳槽，使燒杯臂靠在高玻璃 板上，讓溶液順著高玻璃板流入雙層玻璃板之間， 直到將雙層玻璃板間的夾縫倒?jié)M濃縮膠，然后插入梳子，在室溫（2030C）等待3060

36、 min左右，凝膠凝固。4. 樣品準(zhǔn)備將制備好的蛋白質(zhì)樣品溶液4份加入1份上樣緩沖液，沸水浴煮沸5 min，然后離心（10 000 r/min, 5 min），上清液準(zhǔn)備點(diǎn)樣。標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白（Marker）按照商品說明書處理。5. 點(diǎn)樣首先將電泳槽中加入電極緩沖液，電極緩沖液液面在高玻璃板背面要超過電極線，在矮玻璃板一面要高過矮玻璃板。 然后用微量進(jìn)樣器進(jìn)行點(diǎn)樣，一個(gè)泳道點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，其余泳道點(diǎn)未知分子量蛋白，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度確定點(diǎn)樣體積,保證每個(gè)泳道蛋白質(zhì)在3050卩左右。6. 電泳接好電極線，注意黑色電極線接黑色插頭，紅色電極線接紅色插頭，也就是矮玻璃板那面接負(fù)極。接通電源。電泳儀采用穩(wěn)

37、壓的方式電泳，先用80100 V電壓（起始電流值不要超過15 mA），當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，提高電壓到 130160 V （起始電流值不要超過30 mA），當(dāng)溴酚藍(lán)前沿距離膠下面2 mm左右時(shí), 關(guān)閉電源，停止電泳。7. 卸膠先拔下電極線，然后放出電極液，擰開固定螺絲，打開電泳槽，取出雙層玻璃板，卸下玻璃板上的膠條，啟開雙層玻璃板，膠片粘在其中一個(gè)玻璃板上，先去掉濃縮膠，然后將分離膠膠片小心移入培養(yǎng)皿內(nèi)。8固定染色在培養(yǎng)皿內(nèi)加入染色液，注意液面超過膠片表面 2 mm 左右。然后將培養(yǎng)皿 放在搖床上振搖23 ho9脫色回收染色液 （可重復(fù)利用），用少量脫色液洗滌凝膠一遍， 然后加入脫色液， 液面超過膠片2 mm，然后將培養(yǎng)皿放在搖床上振搖，約6h換一次脫色液，換2 次以上。三）蛋白