天然產(chǎn)物香菇的提取

1、2021/8/21武漢大學(xué)化學(xué)學(xué)院應(yīng)用化學(xué) 武漢大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)及提取2006220301342021/8/22l1. 香菇概述l2. 香菇主要成份l3. 香菇的營養(yǎng)價值及藥用價值l4. 香菇多糖的提取工藝l5. 多糖含量的測定方法2021/8/23l我國是世界上最早食用香菇的國家，距今已有4000多年的悠久歷史。從春秋時期，就有關(guān)于香菇的記載，從漢朝開始就有了人工栽培，延至宋、元、明、清時代，文獻(xiàn)中更是常見香菇的蹤跡。據(jù)說遠(yuǎn)自秦始皇時代便將它當(dāng)作長壽的妙藥；明朝的名醫(yī)吳瑞，也曾在他所住的醫(yī)書中提到香菇具有養(yǎng)氣、防饑、治風(fēng)、及破血的效果。現(xiàn)在東方民族則仍視其為高級的天然健康食品，價格昂貴。在美

2、國被譽(yù)為“上帝食品”，我國則譽(yù)為“山珍”。香菇所含的營養(yǎng)物質(zhì)對人體健康是非常有益的。 2021/8/24l拉丁文：Lentinus edodes (Berk.) Pegler.別 名：香菌、香蕈、平莊菇（廣東）、椎茸（日本）、花菇 （特種）。英文名：Shiitake; Forest mushroom; Black forest mushroom; Dried mushroom.l香菇隸屬于擔(dān)子菌綱、傘菌目、口蘑科、香菇屬。具有獨(dú)特的香味，優(yōu)良的質(zhì)地，高營養(yǎng)價值和藥用價值。素有（山珍）之稱，被視為“菇中之王”。香菇可預(yù)防血管硬化，可降低人的血壓。香菇含有獨(dú)特香味，肉質(zhì)嫩滑，可與雞、鴨、火腿燉湯，

3、清炒。由于它味道鮮美，香氣沁人，營養(yǎng)豐富，是一種有益于人類健康的食品，素有“山珍之王”、“植物皇后”之美譽(yù)。2021/8/252021/8/26l香菇也是我國一種著名的藥用菌，歷代的醫(yī)藥學(xué)家對香菇的藥性及功用均有著述。l本草綱目認(rèn)為香菇“甘、平、無毒”；l醫(yī)林纂要認(rèn)為香菇“甘、寒”，“可托痘毒”；l日用本草認(rèn)為香菇“益氣、不饑、治風(fēng)破血”；l本經(jīng)逢原認(rèn)為香菇“大益胃氣”；l現(xiàn)代實(shí)用中藥認(rèn)為香菇“為補(bǔ)償維生素D的要劑，預(yù)防佝僂病，并治貧血”。l總之，香菇具有： 抗病毒、抗腫瘤、快速增強(qiáng)人體免疫功能和刺激干擾素形成的作用；另可增加人體對鈣的利用；糾正人體酶缺乏癥。 2021/8/27l香菇是一種木

4、腐菌，主要腐生在屬于殼斗科、樺木科和金縷梅科的闊葉林倒木上，其分布受環(huán)境條件和自身生長條件限制。l香菇原先野生于我國北方的闊葉林地，連鄰近的韓國與日本，也在飲食文化的熏陶下，漸起食用香菇的風(fēng)潮。隨著科學(xué)研究的不斷深入，香菇人工栽培技術(shù)得到成功普及，不但產(chǎn)量增多，栽培方法也很簡易，進(jìn)而使得香菇更加名噪一時。在我國主要分布于云南、貴州、四川、湖北、江西、福建、廣西、廣東、安徽、陜西等地，分布十分廣泛。2021/8/28l香菇是目前世界上第二大宗人工栽培的食用菌。世界上生產(chǎn)香菇最多的國家是日本， 1981年全世界鮮香菇的年產(chǎn)量約19.2萬噸(鮮：干=7:1)；其中日本干香菇14,735噸，占世界干香

5、菇產(chǎn)量90%(共l6385噸，其中中國700噸，南朝鮮950噸)；鮮菇78,000噸，幾乎占全世界量的100%。l據(jù)一九八三年的統(tǒng)計，該年日本生產(chǎn)鮮菇七萬余公噸，干菇萬余公噸。臺灣干菇生產(chǎn)僅兩千余公噸，不足供應(yīng)市場需要，需從國外大量進(jìn)口。日本鮮菇消費(fèi)較干菇多，我國則相反。隨著科枝交流和亞洲移民的增多。目前歐洲和美國香菇的需求量激增。對香菇的引種也十分興趣。2021/8/29l市面上的香菇有“新鮮香菇”和“干香菇”兩種，新鮮香菇多為本地生產(chǎn)的人工栽培品種。香菇應(yīng)以菇傘肥厚，傘緣曲收，內(nèi)側(cè)為乳白色，皺褶明顯，菇柄短而粗，菇苞未開且菇肉厚實(shí)者較為美味。有些菇面呈裂開狀，購買時應(yīng)認(rèn)清其裂痕是否為天然生

6、成，若是人為切割則為膺品。 l保存香菇l新鮮香菇可用透氣膜包裝后，置于冰箱冷藏，可保鮮一星期左右，或直接冷凍保存。干香菇則應(yīng)放在密封罐中保存，并最好每個月取出，放置陽光下曝曬一次，可保存半年以上；亦可直接冷藏、冷凍保存，以避免腐敗或生蟲。 2021/8/210l香菇的鮮味成分，是一群水溶性物質(zhì)，其主要成分是5-GMP，5-AMP，5-CMP和5-UMP等核酸構(gòu)成成分，均含0.1左右。l香菇中含有抗腫瘤成分香菇多糖，含有降血脂成分香菇太生、香菇腺嘌呤及其衍生物，還含有干擾素的誘發(fā)劑雙鏈核糖核酸，是不可多得的保健食品之一。l香菇多糖以1，3葡聚糖為主，還含有少量的木糖和甘露糖，具有抗病毒、抗腫瘤、

7、調(diào)節(jié)免疫功能和刺激干擾素形成等功能，從而抑制癌細(xì)胞的生長；l香菇含有六大酶類的40多種酶，可以糾正人體酶缺乏癥；香菇中有豐富的維生素D原，對預(yù)防小兒佝僂病和老人骨質(zhì)疏松癥有效。2021/8/211l香菇多糖為白色粉末狀固體，對光和熱穩(wěn)定。在水中最大溶解度為3毫克/毫升，能溶解于0.5摩爾/升氫氧化鈉，溶解度可達(dá)50一100毫克/毫升，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。香菇多糖具有吸濕性，在相對濕度為92.5%的室溫環(huán)境(25)中放置15天，吸水量可達(dá)40%。l香菇多糖是極性大分子化合物，其特定的結(jié)構(gòu)與免疫活性有密切關(guān)系。因此，香菇多糖的提取大多采用不同溫度的水和稀堿溶液，并盡量避免在過于酸性的

8、條件下操作。因?yàn)閺?qiáng)酸性能引起多糖普鍵的斷裂。2021/8/2122021/8/213l香菇多糖為一種-D13葡萄糖殘基為主鏈，側(cè)鏈為(16)葡萄糖殘基的葡聚糖。重復(fù)結(jié)構(gòu)單位一般含有7個葡萄糖殘基，其中2個殘基在側(cè)鏈上，化學(xué)結(jié)構(gòu)如附圖所示。2021/8/214l傳統(tǒng)香菇多糖的提取方法有水提醇沉法、稀堿浸提法、稀酸浸提法和酶法等，隨著對香菇研究的不斷深入，又出現(xiàn)超濾法、微波輔助浸提法以及超聲波法等。水提醇沉法為最經(jīng)典的提取香菇多糖的方法，以工藝簡單、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)為人們所接受。2021/8/215l香菇經(jīng)烘干后粉碎，過40目篩，以水提浸，過濾，濃縮浸提液，接著用 sevag 試劑去除游離蛋白，再用

9、乙醇處理，沉淀物經(jīng)洗滌干燥后，得到香菇多糖粗品，并測定其純度。對水浸提的溫度、時間、加水量進(jìn)行中一因素摸索以確定各因素的水平，用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出最佳浸提工藝條件。2021/8/2162021/8/217l劉樹興等將香菇(子實(shí)體)經(jīng)水浸提液浸提，再經(jīng)減壓濃縮，Sevag法去除游離蛋白、乙醇沉淀得到香菇多糖蛋白粗品。通過正交實(shí)驗(yàn)分別得到制備浸提液的最優(yōu)工藝條件：溫度85，時間5h，加水量150m1；除蛋白的最優(yōu)工藝條件：樣液:氯仿-正丁醇(體積比)=3，氯仿:正丁醇(體積比)=5；而乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時可沉淀出較多的糖蛋白。經(jīng)過純度鑒定可得到純度為86. 3%的糖蛋白粗品。2021/8/218l超

10、聲提取技術(shù)的應(yīng)用原理是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的溶出，另外超聲波的次級效應(yīng)，如機(jī)械振動、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速欲提取成分的擴(kuò)散釋放并充分與溶劑混合，有利于提取。其優(yōu)點(diǎn)是可以大幅度地提高有效成分的提取率，簡化提取操作步驟，節(jié)省溶劑。該技術(shù)已用于構(gòu)祀多糖、芍藥苷(Paeoniflorin)的提取。2021/8/2192021/8/220l超聲處理的方式采用：不同超聲功率提取相同時間；相同超聲功率提取不同時間；一定的超聲功率和時間，作用于不同的浸提時刻。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同時刻(提取開始、中間和末期三個時段)超聲處理的效果有所不同，提取開始時刻處理效果最差，中間和最后時刻處理效

11、果較好，l兩種超聲處理結(jié)果如表1.2所示。2021/8/221l由表1,2可知，隨著超聲時間和功率的增加，提取率逐漸增大，但提取時間13 min及功率80 W之后，提取率增加很少?？紤]到經(jīng)濟(jì)性和超聲處理時間過長、功率過高會使多糖降解，降低多糖活性，實(shí)驗(yàn)最后將超聲處理時間確定為13 min，功率為80 W較為適宜。2021/8/222l超聲作用使提取液的粘度下降將近15%，表面張力也相應(yīng)降低10%12%，并且它們是隨著超聲處理強(qiáng)度的增加和時間的延長而逐漸降低；溫度和電導(dǎo)率都略有上升，將近3%10%。 這是因?yàn)樗谌芤褐黧w中是以締合態(tài)(H2O)n形式存在，而多糖分子、蛋白質(zhì)等溶出物是包含在締合分子

12、間，其相對運(yùn)動受到限制。在超聲作用下，激化了水分子，導(dǎo)致水分子締合鏈的斷裂，減低了締合度，減小了締合分子量，從而降低了提取液的粘度和表面張力。2021/8/223l圖1表明超聲作用使提取的料液比從常規(guī)提取的1：20以上降低到1：15左右。因?yàn)橄愎蕉嗵翘崛∵^程是多糖類物質(zhì)不斷地從香菇固相粉末，通過固液界面轉(zhuǎn)移到提取劑的液相主體中的復(fù)雜傳質(zhì)過程，引人超聲后，空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)以及超聲處理所引起體系溫度的上升，都增大了固液界面的湍動程度，同時空化效應(yīng)產(chǎn)生的微射流會促進(jìn)提取劑向固體表面擴(kuò)散以及固體微粒從固體主體向液相主體的傳質(zhì)，從而提高了液相體積的效能，降低了提取的料液比。2021/8/224l超聲作

13、用縮短了提取總時間，使提取終點(diǎn)從常規(guī)的3h以上提前到2 2. 2 h之間。這是由于超聲空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，不僅強(qiáng)化了固體微粒向液體的傳質(zhì)，而且促進(jìn)了提取劑向固液界面的擴(kuò)散。另外超聲空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)“粉碎”了固體微粒和締合水分子，使其變成更微小的質(zhì)團(tuán)，提高了溶出過程的速率，從而縮短了提取時間。2021/8/225l利用超聲波輔助熱水，從香菇中浸提香菇多糖，不僅能縮短提取時間，減小料液比，提高提取率，降低生產(chǎn)成本;而且能降低提取液枯度和表面張力，對降低此后的超濾分離的阻力和減少濃差極化的影響，都有經(jīng)濟(jì)上的積極意義。2021/8/226l1、浸提過程l 用95熱水浸提(熱水用量:香菇原料量=20:

14、1，體積比)4h，提取3次得粗多糖溶液。l2、超濾實(shí)驗(yàn)l 浸提液通過離心、過濾等分離過程。己初步除去其中微塵、粗纖維、膠質(zhì)等大分子物質(zhì).再經(jīng)超濾裝置進(jìn)行超濾.可得到濾液(透過液)和截留液。濾液為不含蛋白質(zhì)的低聚多糖(即小分子多糖).而截留液為含香菇大分子多糖和大分子蛋白的濃縮液。將超濾透過液減壓濃縮可得到香菇小分子多糖的粗品，而將截留液用BECM法除去蛋白，再用85%乙醇溶液進(jìn)行醇析，可得大分子香菇多糖粗品。醇析中乙醇濃度對醇析結(jié)果有重要影響。用80%、體積是浸提液3倍的乙醇進(jìn)行醇析效果最佳。2021/8/2272021/8/228l濃度l mg/ml的料液在0.15MPa壓力差和25 條件下

15、分別用兩種膜進(jìn)行超濾，其通量變化見圖2，截留情況見表2，不同截留分子量的膜，它們的超濾通量也不同，并隨截留分子量的增加而增加。但采用60 000的膜可獲得滿意的截留效果，這可能是香菇胞內(nèi)多糖的分子量在610萬。2021/8/229l同樣條件下，料液溫度高時的通量大于低溫時的通量，因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，溫度升高使粘度下降，擴(kuò)散系數(shù)和傳質(zhì)系數(shù)增大，且溶解度增大，即溶質(zhì)與水親合力也加大，相應(yīng)會減少濃差極化，故通量在高溫時較大;溫度提高導(dǎo)致了截留率的降低，這可能是因?yàn)闇囟壬邔?dǎo)致了膜截留性能和溶液理化性質(zhì)的改變，這需要進(jìn)一步研究。因此，對于溫度的選擇應(yīng)綜合考慮膜性能、預(yù)期截留率等多種因素。2021/8/2

16、302021/8/231l水溶性多糖在pH中性條件下超濾通量最大，這可能與香菇多糖的提取方法和在不同pH值溶解度不同有關(guān);而在非中性條件下通量變化可能還因?yàn)樵诖藀H值范圍內(nèi)，溶液殘留的蛋白質(zhì)濃度加劇了凝膠的形成。2021/8/232l與其它提取工藝相比,該工藝具有工藝路線簡單、提取時間短及醇析所用的乙醇試劑用量少等特點(diǎn)，且可回收其他提取工藝都丟棄的低聚糖(小分子多糖)。同時，經(jīng)超濾后的透過液，根據(jù)超濾膜的截留分子量不必增加除蛋白與醇析這兩道工序使工藝流程變短。2021/8/233l1、復(fù)合酶解法：將菇柄粉浸脹加熱升溫至90 ,攪拌保溫1h后，降至46 ,調(diào)pH值至4. 5，加人1%復(fù)合酶制劑，

17、酶促反應(yīng)80min，中和，補(bǔ)水至1:60，升溫至90滅酶并保溫浸提80min，降至室溫，離心去沉淀，上清液濃縮，乙醇沉淀。l2、粗多糖的純化方法：取多糖提取液加鞣酸溶液與蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀，至無沉淀為止，加活性碳脫色，過D101吸附樹脂，透析，乙醇沉淀，60烘干，得白色純多糖。2021/8/234l酶解溫度l pH 4. 5，不同酶解溫度下，作用80min ，酶解后中和，加20倍dH20， 9 0 浸提80min ，結(jié)果如圖1。當(dāng)酶解溫度在44-46 時酶活力較高，其中以46 時酶活力最高，菇柄多糖提取率最大。2021/8/235l酶解pH值l 46 ，不同pH值，酶解80min ，酶解后中和，加

18、20倍dH20 ，90 浸提80min，結(jié)果如圖2。 當(dāng)酶解pH值在4. 55. 0時酶活力較大，其中以pH 4. 5為最佳，此時菇柄多糖的提取率最大。2021/8/236l酶解時間l 在46 ，pH4.5時，不同酶解時間作用后中和加20倍dH2O ，90 浸提80min，結(jié)果如圖3。菇柄多糖的提取率并不隨酶促反應(yīng)時間的延長而著增加，只有在作用80min時及時提高溫度進(jìn)人熱水浸提階段，才有利于菇柄多糖的溶出。2021/8/237l微波加熱固體物質(zhì)具有加熱速度快、均勻性好、節(jié)能高效、易于控制等多種特點(diǎn)，己經(jīng)廣泛用于有機(jī)合成反應(yīng)、催化化學(xué)反應(yīng)速度等。近十年來，微波輔助浸提已廣泛應(yīng)用于樣品中有機(jī)污染

19、物、大然化合物及生物活性成分的提取。特別是生物活性成分的提取已涉及到幾大類大然化合物(大然脂肪、生物堿、皂甙、甾類、鞣質(zhì)、菇類及揮發(fā)油)，引起廣大化學(xué)家的極大興趣。l微波爐 (SHAMP，家用)。所有試劑為分析純。l由于實(shí)驗(yàn)中采用的微波爐為家用型號，其功率和頻率都是固定的，所以在實(shí)驗(yàn)中主要是通過改變加熱的時間，使浸提液通過微波作用提高浸提溫度，從而影響浸提液中總糖的含量。2021/8/238l圖1表示加入150ml的超純水后，在不同微波加熱時間情況下，浸提液體積和總糖含量隨時間的變化曲線。2021/8/239l總之，微波輔助浸提以高回收率、高選擇性、快速加熱、易于控溫及設(shè)備尺寸減小，無污染能源的利用、減少廢物及產(chǎn)品的污染等一系列優(yōu)點(diǎn)，越來越引起人們的重視。利用該方法提取香菇多糖，操作方法簡單，而且利用補(bǔ)充浸提液體積與堿液相結(jié)合的方法可以提高多糖的得率，成為香菇多糖生產(chǎn)的一個實(shí)際可行的新穎方法。l但是這個方法還需進(jìn)步完善，例如對微波爐進(jìn)行改造，使微波的頻率、功率和加熱時間可以控制，同時可以完成浸提液的回流循環(huán)，提高浸提液的利用率。另外對工藝的連續(xù)性需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。2021/8/240l中