醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料課件

1、醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料中國藥科大學新藥篩選中心此材料僅供中心內(nèi)部使用最終解釋權歸新藥篩選中心醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料細胞培養(yǎng)基本介紹 血清 培養(yǎng)基 其他產(chǎn)品醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料體外培養(yǎng)細胞的分型 貼壁細胞：細胞貼附在支持物表面生長，只有依賴貼附才能生長的細胞叫做貼附型細胞 懸浮細胞：培養(yǎng)時不貼附于底物而成懸浮狀態(tài)生長，主要來自血，脾或骨髓醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料體外培養(yǎng)細胞 原代培養(yǎng)：直接從體內(nèi)取出的細胞進行第一次培養(yǎng)，其優(yōu)點是組織細胞剛脫離機體，生物性

2、狀尚未發(fā)生較大變化，在一定程度上能夠反應體內(nèi)的狀態(tài)；缺點是細胞生長較為緩慢，生長條件要求高 傳代培養(yǎng)：將細胞從一個培養(yǎng)瓶按照一定比例轉(zhuǎn)移到另外的培養(yǎng)瓶即為傳代培養(yǎng)，其目的是將高密度的細胞進行稀釋擴大培養(yǎng)，以避免營養(yǎng)枯竭，影響細胞生長醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料貼壁細胞培養(yǎng)基本流程基礎培養(yǎng)基+FBS+添加劑+抗生素去除Media用PBS或Trypsin清洗加入Trypsin以分離貼壁細胞將部分細胞傳代到新的Media中醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料細胞培養(yǎng)主要成分血清基本培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)試劑（抗生素、細胞解離，生長因子等）平衡鹽溶液醫(yī)學中國藥科大學新藥

3、篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料血清產(chǎn)品及FAQ醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料血清的作用 血清提供：營養(yǎng)和能量來源生長和粘附因子肽和類固醇激素載體蛋白 保護細胞：免受蛋白酶、毒性物質(zhì)、pH值波動、機械剪切力、氧化及自由基的損傷。醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料血清 血清的來源目前國內(nèi)可以銷售HyClone來自澳大利亞、新西蘭、南美的胎牛血清，并且均提供血清來源說明及質(zhì)量檢測報告 血清類型胎牛血清新生牛血清及小牛血清其他血清：成牛血清、馬血清、豬血清等 檢測體系每批產(chǎn)品都經(jīng)過嚴格的細菌、支原體、病毒、內(nèi)毒素、血紅蛋白等檢測醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞

4、培養(yǎng)基礎知識培訓材料如何保存和解凍血清？ a. 血清應該在-20保存。如果一次無法用完一瓶，應該無菌分裝后冷凍保存。注意：避免反復凍融。 b. 解凍時將血清首先置于冰箱2-8中12-24小時使之緩慢部分溶解，然后再放在室溫下使之全溶。注意：溶解過程中要每隔一段時間（2小時）緩慢地搖動血清使之混勻。醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料血清出現(xiàn)沉淀？1.纖維蛋白：是常出現(xiàn)的較大的沉淀物。因為血清都是在低溫下進行收集和快速處理的，一些纖維蛋白原（形成絮狀纖維蛋白的可溶性前體）在處理過程中仍處于溶解狀態(tài)，在經(jīng)過最后的過濾后發(fā)生凝結(jié)，形成纖維蛋白沉淀。2.磷酸鈣：是一種常見的沉淀物，通常

5、會使血清出現(xiàn)渾濁，并且在37培養(yǎng)時會增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點，這些小黑點由于布朗運動看上去可以活動，因此經(jīng)常被誤認為是微生物污染3.其他的脂類和蛋白4.血清中的沉淀物是難以預測和預防的，但通常沉淀不會影響血清的質(zhì)量醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料如何避免血清出現(xiàn)嚴重沉淀？ 血清有輕微絮狀物，但產(chǎn)品比較澄清或略顯渾濁是正常現(xiàn)象，但下屬操作會致使血清出現(xiàn)嚴重沉淀，應盡量避免 a.儲存不當：反復凍融；長期儲存在2-8；在室溫下放置時間過長 b.不正確地解凍操作，融化時沒有混勻。 c.熱滅活血清 d.37培養(yǎng)血清 e.射線輻照醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基

6、礎知識培訓材料血清常見問題 如想去除這些絮狀沉淀物，可將血清分裝到無菌離心管中，以400g離心，上清液即可直接加入到培養(yǎng)液內(nèi) 不要以過濾的方式去除這些絮狀沉淀物，因為這可能阻塞濾膜醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料血清選擇？a. 盡量使用同批次的血清；如果需要更換血清批次，則需事先驗證3代以上，因此建議客戶單次購買大量血清； b.原代細胞或ES細胞，提供澳洲或新西蘭的FBS不同批次進行試用，選擇使用效果好的批次；醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料培養(yǎng)基產(chǎn)品及FAQ醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料培養(yǎng)基 培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植

7、物和動物細胞生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物 (糖)、氨基酸、無機鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。細胞培養(yǎng)液= 基礎培養(yǎng)基+10%FBS+營養(yǎng)添加劑+抗生素細胞培養(yǎng)液= 減血清培養(yǎng)基+2%FBS+營養(yǎng)添加劑+抗生素細胞培養(yǎng)液= 無血清培養(yǎng)基+營養(yǎng)添加劑+抗生素醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料培養(yǎng)基和相關產(chǎn)品 普通液體培養(yǎng)基（Liquid Media，LM） 普通干粉培養(yǎng)基（Dry Powder Media，DPM） 減血清培養(yǎng)基（Reduce Serum Media） 無血清培養(yǎng)基（Serum-Free Media，SFM） 營養(yǎng)成分添加劑（Nutri

8、ent Media Supplements） 試劑和輔助產(chǎn)品（Reagents and Cell Culture Support）醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料普通培養(yǎng)基的應用BME ( Basal Medium Eagle):是由Eagle發(fā)明的，是最簡單的培養(yǎng)基，只有11種氨基酸和鹽及一些維生素。最先用于培養(yǎng)小鼠的L 細胞和人類HeLa細胞，現(xiàn)在廣泛用于各種細胞的培養(yǎng)MEM or EMEM (Eagles Minimum Essential Medium):是BME的升級版，氨基酸濃度是BME的兩倍，適用于更多的細胞DMEM or DME (Dulbeccos Mod

9、ification of Eagles Medium)是Dulbecco改進的MEM. 氨基酸和維生素濃度是BME的4倍.最先葡萄糖的濃度是 1g/L，稱為低糖DMEM, 后來增加到4.5g/L，稱為高糖DMEM，廣泛用于各種貼壁細胞培養(yǎng)。IMDM（IscovesModified Dulbeccos Medium) 由DMEM發(fā)展而來，用B淋巴細胞的培養(yǎng)醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料普通培養(yǎng)基的應用RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute # 1640):是 McCoys 5A 的改進版，含有高濃度的肌醇。廣泛用于懸浮細胞的培養(yǎng)

10、。 如人類白細胞，骨髓瘤細胞，雜交瘤細胞等血液來源的細胞M 199 (Medium 199):是一種比較古老的，配方復雜的，含有核苷酸，核酸等成分的培養(yǎng)基。最初用于雞胚肌細胞的培養(yǎng)，還用于各種細胞的維持和病毒生產(chǎn)Hams F10 (Hams Nutrient Mixture F10):由Ham發(fā)明，用于人類2倍體細胞和倉鼠細胞的培養(yǎng)。Hams F12 (Hams Nutrient Mixture F12):F10 的升級版，含有更多的維生素，肌醇，氨基酸。用于培養(yǎng)大鼠，兔子和雞胚細胞，還用于中國倉鼠卵巢細胞以及肺細胞的培養(yǎng)醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料普通培養(yǎng)基 5大常用

11、培養(yǎng)基RPMI 1640Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)Minimum Essential Medium (MEM)Iscoves Modified Dulbeccos Medium (IMDM)Medium 199培養(yǎng)基提供形式干粉液體醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料培養(yǎng)基的選擇？a. 查詢ATCC或文獻，參照該細胞之前的培養(yǎng)方案b.實驗室常用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細胞培養(yǎng)；醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料干粉培養(yǎng)基的配制？a. 建議當開封一個包裝后，請立即將其一次性全部配置； b. 我們

12、不建議將干粉培養(yǎng)基或者鹽類物質(zhì)配置成為濃縮液，這樣可能會導致某些鹽類混合物難融而導致其它沉淀物的增多； c.其它的添加劑可以選擇在最終配置和無菌過濾之前加入；如果添加劑是無菌的，則可以直接添加到無菌的培養(yǎng)基。醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料如何儲存培養(yǎng)基？a.液體培養(yǎng)基分裝后不可以在-20 下保存; 因為培養(yǎng)基中的鹽容易析出，而再次融化后，有的鹽可能無法重新溶解，從而導致培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和滲透壓改變，培養(yǎng)細胞時，容易細胞破裂而死亡； b. 培養(yǎng)基開瓶后盡快用完，不宜長時間保存，因為時間過長會導 致液體培養(yǎng)基中鹽分的析出和pH值的改變；醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知

13、識培訓材料培養(yǎng)基PH值偏高？a.干粉配置中調(diào)好pH后使用負壓過濾；- 請使用正壓b. 液體培養(yǎng)基啟封后長時間無法用完；- 請盡量快用，或用之前用小體積容器分裝（不能在液面上留有太多空氣）；c. 如結(jié)果已經(jīng)造成；-客戶接種前請將裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶在CO2溫箱孵育（甚至過夜），直到pH恢復正常；d.不建議用HCl 調(diào)節(jié)，增加污染風險和高滲透壓結(jié)果；醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料碳酸氫鈉的作用及含量？1. 與CO2一起形成緩沖系統(tǒng)，保持培養(yǎng)基PH值穩(wěn)定；2. 不同的培養(yǎng)基要求添加NaHCO3的量不一樣，如DMEM要求添加3.7g/L，為了保持PH值穩(wěn)定，必須用高濃度的CO2平衡

14、，一般不低于8%，而1640等要求添加NaHCO3 2.2g/L，還有些培養(yǎng)基要求添加更少，那么這些培養(yǎng)基就要求較低的濃度平衡，一般是5%；醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料HEPES的作用及含量？1.培養(yǎng)基中最常用的Buffer system是碳酸氫鈉，它可提供營養(yǎng)，但卻在生理PH值條件下會降低緩沖能力。而HEPES是一種很強的Buffer，加入HEPES能使細胞培養(yǎng)基在PH7.2-7.6條件下緩沖能力增強； 2. Hepes在培養(yǎng)基中的終濃度通常為25mM；非必須，根據(jù)實驗要求 進行添加；醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料丙酮酸鈉的作用？丙酮酸鈉可以作為

15、細胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源。但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。保證細胞更好地生長，但非必需成分；醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料谷氨酰胺的作用？a.幾乎所有的細胞對谷氨酰胺都有較高的要求。谷氨酰胺脫掉氨基后，可作為培養(yǎng)細胞的能量來源，參與蛋白質(zhì)的合成和能量代謝。在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。但同時L谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性； b. 谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基4度冰 箱儲存兩周以上時，應重新加入原來量的谷氨酰胺；醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料是否含有酚

16、紅？1. 酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色2. 酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）3. 由于酚紅干擾檢測，在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料無血清培養(yǎng)基 Serum-Free Medium （SFM）成分更加清晰消除因血清批次不同而帶來的不確定性 保持實驗的連續(xù)性易于純化和下游處理優(yōu)化特殊細胞及其功能的培養(yǎng)條件越來越多的無血清培養(yǎng)基 用非動物/人來源的原料制造有利于準確闡述細胞功能, 更好控制生理反應降低成本，控制污染醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料無血清培

17、養(yǎng)基產(chǎn)品體系五大細胞培養(yǎng)平臺：CHO Cell (倉鼠卵巢細胞)Hybridoma and Myeloma Cell (雜交瘤和骨髓瘤細胞)HEK 293 and PER.C6 Cell CultureInsect Cell Culture (昆蟲細胞）Viral Vaccine Cell Culture(病毒生產(chǎn)用細胞)醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料細胞培養(yǎng)添加劑1.谷氨酰胺 & 丙酮酸鈉2.抗生素-青霉素/鏈霉素溶液 SV300103.非必需氨基酸-根據(jù)細胞而定4.胰酶5.平衡鹽溶液6. HEPES7.酚紅醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料胰

18、酶 Trypsin 用途：用于貼壁細胞的消化，使貼壁生長的細胞重新懸浮起來，以便傳代 -含或不含EDTA, 根據(jù)細胞和實驗要求選擇醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料平衡鹽溶液 平衡鹽溶液主要是由無機鹽、葡萄糖組成； 它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)； 用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等PBS 磷酸鹽緩沖液DPBS（Dulbeccos Phosphate-Buffered Salines）Earles 平衡鹽Hanks 平衡鹽醫(yī)學中國藥科大學新藥篩選中心細胞培養(yǎng)基礎知識培訓材料常見問題處理1. 如果細胞培養(yǎng)基偶然被凍，應該融化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。2. 當在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。3.大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。4. 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4冰箱中的