患腹水綜合癥肉雞的肺動脈轉錄組學研究

1、JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 畢 業(yè) 論 文（設 計）題目： 患腹水綜合癥肉雞的肺動脈轉錄組學研究 學 院： 動物科學技術學院 姓 名： 學 號： 專 業(yè)： 動物醫(yī)學 年 級： 二0 15 年 5 月摘要 為了探討肉雞腹水綜合癥與肺動脈生物學變化的關系，從轉錄組生物信息的水平上對肉雞肺動脈進行分析。本實驗選取了75羽15日齡健康AA肉雞隨機分成對照組（20羽）和造病組（55羽），造病組（D）飼喂含0.3% Nacl的高鹽水，對照組（N）飲正常水。在飼養(yǎng)過程中肉雞出現(xiàn)明顯腹水綜合癥臨床癥狀后頸靜脈放血致死，并取RV/TV0.29的雞肺動脈于液氮速凍，再放置

2、-80保存，備用于轉錄組測序技術（RNA-seq）檢測。結果表明：（1）腹水雞和正常雞相比，發(fā)現(xiàn)了895個差異表達基因。（2）根據(jù)GO富集分析，895個差異表達基因主要參與Ribosome，Translation，Chemokine and cytokine activity，Immune system等多個代謝通路以及可導致它們發(fā)生生物學變化。本實驗結果揭示了患腹水綜合癥肉雞的肺動脈與正常的肉雞相比，基因轉錄水平現(xiàn)出了顯著的差異。因此，其結果為肉雞腹水綜合癥的發(fā)病機制提供了更新的信息，也為研發(fā)肉雞腹水綜合癥新的藥物靶點篩選提供一定依據(jù)和臨床價值。關鍵詞：肉雞；肉雞腹水綜合癥；RNA-seqI

3、IIAbstract An experiment was carried out to investigate the pulmonary artery changes of broilers with Ascites Syndrome on transcriptome biological level. 75 15-days Arbor Acre commercial broilers were randomly divided into control group (20) and disease group (55), and the control group broilers (N)

4、 was raised with tap water while disease group broilers(D) was given 0.3% Nacl water. During the trail, birds were killed when they showed obvious clinical symptoms, and the pulmonary arterys were collected and stored in -80 for RNA-seq test if the RV:TV of the bird was over 0.29 . Results presented

5、 that: compared to control group, (1) the disease groups have 895 differential expressed genes. (2)According to GO analysis, 895 differential expressed genes enriched to these biological progress such as Ribosome, Translation, Cytokinecytokine etcr multiple metabolic pathways and cause them to occur

6、 biological changes. The experiment demonstrated that gene transcript level of pulmonary artery of the broiler with ascites syndrome had a remarkable difference compared to the normal broiler. Therefore, our results provided updated information for the pathogenesis research of broiler ascites syndro

7、me, and also offered evidence and clinical value for exploiting new drug targets against ascites syndrome.Key words：broiler; Ascites syndrome; RNA-seqIV目 錄摘要IIAbstractIII前 言11 實驗材料與方法21.1 試驗動物和分組管理21.2 試驗日糧21.3 樣品收集與保存21.4 主要儀器和試劑21.5 實驗耗材31.6 RNA-seq 檢測樣品的收集與準備31.6.1 RNA提取操作步驟31.6.2 DEG測序的實驗室準備41.6

8、.3 序列分析51.6.4 RNA-seq 檢測數(shù)據(jù)分析52 結果72.1 RNA樣品檢測結果72.1.1 RNA電泳結果72.2 樣本間相關性102.3 基因表達Density圖112.4 差異表達基因篩選112.5 差異基因GO Terms分析123 討論143.1 RNA樣品質量143.2 樣本選擇的可靠性143.3 差異基因GO Terms富集分析154 結論15參考文獻16附錄18致謝19V前 言 肉雞腹水綜合癥(Ascites syndrome，AS）也稱為肺動脈高壓綜合癥(改為中文格式pulmonary hypertension，PH），是由多種致病因子共同作用而引起的一種營養(yǎng)代

9、謝病，在肉雞養(yǎng)殖業(yè)中頻繁發(fā)生，據(jù)統(tǒng)計，其發(fā)病率為5-10%，并且照成了巨大的經(jīng)濟損失1要上標，所有參考文獻。肉雞腹水綜合癥的發(fā)病表現(xiàn)為呼吸困難，精神沉郁，并且很快死亡，解剖發(fā)現(xiàn)腹腔和心包有大量積液，并且右心室顯著腫大2.。 去掉對于肉雞腹水綜合癥的發(fā)病原因，國內外一些研究發(fā)現(xiàn)，肉雞腹水綜合癥發(fā)病的主要原因是肺動脈高壓。由于肉雞生長速度過快，在短時間內就可以達到一定的體重，尤其是快大型肉雞，但是這時肉雞的器官并沒有發(fā)育完成，特別是心血管系統(tǒng)。為了維持機體的活動以及對氧氣的需求，心臟就會泵出足夠的血液來維持，這時過多的血液流到有限的肺血管中，血液壓力過大，肺動脈高壓情況就出現(xiàn)。此時，血液流速過快，

10、并沒有攜帶足夠的氧氣，造成了體內氧氣供求不平衡。為了緩解這一情況，右心室會代償出更多的血液，出現(xiàn)了右心室壁顯著增厚的情況3。實際上，國內外很多報道已經(jīng)證實缺氧，低溫，高能量日糧等外界因素都會使肉雞發(fā)生肉雞腹水綜合癥4。很多研究把肉雞心臟指數(shù)AHI超過0.29和血容量升高當作指示肉雞腹水綜合癥的重要指標5, 6.研究報道通過限飼，長時間基因選育以及藥物預防等方法來來緩解肉雞腹水綜合癥對養(yǎng)雞業(yè)造成的損失的效果并不顯著，故對于肉雞腹水綜合癥的研究值得眾多科研工作者投更多的精力7。事實上，對于肉雞腹水綜合癥的研究，目前國內外大多數(shù)都是停留在水平和生化水平上，對于基因水平研究少之又少，有基因方面的研究也

11、是個別基因，并不全面。故下一步的研究應當從整個基因組水平來分析。隨著科學的進步，高通量測序方法深受研究者的青睞，特別是在人醫(yī)研究中，其優(yōu)點是能鑒別組疾病發(fā)生過程中差異基因的表達以及差異基因參與的代謝通路，這就為后續(xù)的研究提供了非常好的鋪墊。本實驗的研究目的就是用seq-RNA的方法在整個基因水平來分析肉雞腹水綜合癥的發(fā)病機理。據(jù)報道，肺動脈血管的變化與肉雞腹水綜合癥的發(fā)生有關，已經(jīng)證實發(fā)生肉雞腹水綜合癥時肉雞的肺動脈血管會發(fā)生重塑，而且肺動脈中的缺氧誘導因子表達會顯著增高8。故改為：因此，本實驗選取的是發(fā)生肉雞腹水綜合癥的肉雞肺動脈做轉錄組分析，找出與肉雞腹水綜合癥相關的所有差異表達基因和這些

12、基因參與的生物過程，從而為更好的治療和預防肉雞腹水綜合癥做出鋪墊。1 實驗材料與方法1.1 試驗動物和分組管理本實驗選取的是AA肉雞（Arbor Acre commercial broiler chickens）75羽。所有肉雞按常規(guī)免疫程序進行免疫。所有肉雞人工籠養(yǎng)至21日齡，然后隨機分為，造病組55羽和對照組20羽。在21日齡前均正常飼喂和飲水，第22日齡，其中造病組飼喂含0.3%的Nacl水，對照組正常飲水。對照組和造病組都給予相同飼料，自由采食。所有肉雞均按規(guī)定免疫程序進行免疫，驅蟲。對照組、造病組隔離籠養(yǎng)。試驗持續(xù)6周。1.2 試驗日糧本試驗中肉雞基礎日糧來源于南昌某公司肉仔雞飼料。

13、字體不一樣1.3 樣品收集與保存 在造病組出現(xiàn)精神沉郁，呼吸困難，采食和飲水廢絕的肉雞時采樣，每次采樣挑選健康狀況最差的造病組雞5只，隨機挑選照組雞3只，剩余肉雞在第50日齡一次采完。采樣前一夜禁水禁料，采樣當天空腹稱重，頸靜脈放血致死，觀察組織病理變化。迅速取每羽雞肺動脈，用DEPC水清洗多次后，放于DEPC水處理過的1.5mLEP管中，迅速放入液氮中速凍，然后轉移到-80超低溫冰箱冷凍保存，用于RNA-seq檢測。段前空格多了，只要兩個漢字空格就可以了，字體大小不一致1.4 主要儀器和試劑ZDX-35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；DW-86L388海爾立式超低溫冷

14、凍冰箱（青島海爾特種電器有限公司）；電熱恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械七廠）；SZ-93自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮科學儀器有限公司）；全自動生化分析儀BS-380檢測（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；各種規(guī)格微量移液槍（芬蘭Labsystem公司）DF206電熱鼓風干燥箱（北京醫(yī)療設備二廠）普通冰箱（南昌齊洛瓦電器集團）；分析電子天平（Sartorius Groupe，Germany）；100萬單位鏈霉素，80萬單位青霉素，肝素鈉、NaCl、去掉等均為市售。字體不一1.5 實驗耗材 各種規(guī)格托盤，手術剪，眼科剪，眼科鑷，組織鑷，手術刀片，PE手套，封口膜，一次性口罩，保鮮膜，無脂紗布，自封袋，

15、牛皮紙，7.5cm濾紙，脫脂棉，稱量紙，擦鏡紙，蓋玻片，載玻片，玻片架，中性樹膠等。10mL、1mL和5mL注射器，1.5mL，5mL和10mLEP管，200L和1000L槍頭，50mL與100mL燒杯，100量筒和500mL量筒，液氮罐；。與上同樣的問題1.6 RNA-seq 檢測樣品的收集與準備 建庫測序的流程一般包括以下步驟（圖1）：總RNA樣品的檢測，mRNA的富集，雙鏈cDNA的合成，末端的修復、加poly-A和接頭，片段的選擇和PCR富集，文庫質量的檢測，上機測序15。從RNA樣品的提取到最終獲得數(shù)據(jù)，每一個環(huán)節(jié)（樣品檢測、建立文庫、測序）都會對最終數(shù)據(jù)的好壞產(chǎn)生巨大影響，而后續(xù)信

16、息分析又直接受到數(shù)據(jù)的好壞的影響。因此要對每一個生產(chǎn)步驟嚴格把控，產(chǎn)生高質量的數(shù)據(jù)，從而從源頭上確保結果的準確可靠。與上同樣的問題圖1 RNA-seq主要技術流程Fig要加點.1 The main technical process 1.6.1 RNA提取操作步驟 （1）取用液氮研磨后樣本20mg 左右加入1mL Trizol 中，震蕩，室溫靜置5min，12000rpm，離心10min，然后將上清轉移至新管。 （2）按照Trizol：氯仿=5:1 的比例加入氯仿，蓋緊管蓋，漩渦振蕩器上振蕩混勻，室溫靜置3-5min，自然分相。 （3）4C，12000g 離心10min，混合物會分成三層。 （

17、4）將上層水相轉入一新管，加入等體積氯仿，振蕩混勻，室溫靜置3-5min，自然分相，4C，13000g 離心15min。 （5）將上層水相轉入新的1.5mL EP 管（約400-500L），加入等體積的異丙醇，混勻后，80放置20min。 （6）4C，13000rpm 離心15min，棄掉上清。 （7）RNA 沉淀用1.0mL 75乙醇漂洗，4C，13000rpm 離心5min。 （8）重復步驟7。 （9）將沉淀置于超凈工作臺吹干，用適量DEPC 處理水溶解RNA 沉淀。RNA的定值與定量，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染，Nanodrop檢測RNA的純度（OD260/280比值

18、），Qubit對RNA濃度進行精確定量，Agilent 2100精確檢測RNA的完整性。 1.6.2 DEG測序的實驗室準備 每個RNA樣品輸入3g。按照NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina （NEB, USA）使用說明書建立序列庫，并在每個樣品的屬性序列中加入索引編碼。方法是用多聚T微鏈接磁珠將mRNA 從總RNA中純化出來。將碎片用二價離子在高溫NEBNext首鏈合成反應液（5X）中提取出來。首鏈cDNA 用隨機六聚體引物和M-MuLV 反轉錄酶（RNase H-）合成。隨后，次鏈cDNA用DNA聚合酶I和RNA酶H合成。末端通過核

19、酸外切酶/聚合酶活性轉換成鈍端。DNA碎片3末端腺苷酰化作用后，綁結上帶發(fā)夾結構的NEBNext Adaptor 為雜交做準備。用AMPure XP system （Beckman Coulter, Beverly，USA）純化庫碎片，以選擇150200 bp長度cDNA 碎片。在大小適當，并加入適配器的cDNA中加入3 l應是L，全文要統(tǒng)一 USER Enzyme （NEB，USA）， 37C，15分鐘，95C，5分鐘，然后在Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶，通引和指引下進行PCR，最后，用AMPure XP系統(tǒng)純化PCR產(chǎn)物，并用Agilent Bioanalyz

20、er 2100系統(tǒng)評定建庫質量。 獲得Sequenced Reads 后，在有相關物種參考序列或基因組的情況下，進行生物信息分析，其流程如圖2。GO富集分析蛋白互作網(wǎng)絡分析蛋白互作網(wǎng)絡分析原始測序數(shù)據(jù)參考序列比對分析基因表達水平分析RNA-seq整體質量評估基因差異表達分析測序數(shù)據(jù)質量評估圖 2 生物信息分析流程Fig. 2 Bioinformatic analysis process1.6.3 序列分析空格按照使用說明書，在cBot 集群生成系統(tǒng)上使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS （Illumia）進行引物編碼樣本的聚類，集群生成后，在Illumina H

21、iseq 2000/2500平臺上進行庫準備工作和并制定100 bp/50bp單端磁珠。1.6.4 RNA-seq 檢測數(shù)據(jù)分析1.6.4.1 RNA質量檢測項目RNA質量檢測項目如表1。表 1 RNA檢測項目Table 1 RNA test items樣品類型RNA備注檢測項目初步檢測瓊脂糖凝膠電泳定量；Nanodrop初步檢測是必檢環(huán)節(jié)，合格后才可以進行濃度、完整性、純度的檢測。濃度Nanodrop完整性Agilent 2100純度Nanodrop 1.6.4.2 Reads質量控制 Fastq形式的數(shù)據(jù)首先通過原始數(shù)據(jù)內部腳本編程，去掉帶接頭的reads，包含多聚N的reads，以及低質

22、量的reads得到clean reads。同時，計算clean data的Q20，Q30和 GC含量。所有的后續(xù)分析都基于高質量的clean data。1.6.4.3 Reads比對參考基因 基因組和基因模型注釋文件直接從基因組站點下載。參考基因組索引用Bowtie v2.0.6建造和單端clean reads用TopHat v2.0.9匹配參考基因組。選擇 TopHat 作為比對工具，對于unigene DGE，單端clean reads用Bowtie v0.12.9匹配the unigene序列。1.6.4.4 基因表達水平的定量分析 用HTSeq v0.6.1計算比對到每個基因的read

23、s數(shù)。然后基于基因的長度比對到這個基因的reads數(shù)計算每個基因的RPKM。對于unigene DGE，用RSEM 計算比對到每個unigene的reads數(shù)。1.6.4.5 差異表達分析 對于有生物重復的DESeq，兩種條件/兩組（每種條件下兩個個生物重復）的差異表達分析用DESeq R 包（1.10.1）進行。結果P-values用Benjamini 和Hochbergs 方法調整以控制錯誤率。DESeq中調整后P-value 0.05的基因被認為是差異基因。1.6.4.6 差異表達基因的GO分析 差異表達基因的GO富集分析通過GOseq R包進行，同時糾正基因長度的偏差，修正后P值小于0

24、.05的GO terms 被認為顯著富集差異表達基因。2 結果2.1 RNA樣品檢測結果2.1.1 RNA電泳結果從圖3可以看出28s和18s條帶的亮度差不多，無雜帶。樣品的濃度分別達到N1：172ng/L，N2：284ng/L，D1：252ng/L，D2：274ng/L，RIN均為7以上，樣品質量均達到A級（表2）。 圖3 肺動脈總RNA PCR電泳結果M：Marker（Trans 2K Plus）；D1，D2：造病組；N1，N2：正常組 Fig. 3 RNA electrophoretic results of the pulmonary arteryM：Marker（Trans 2K P

25、lus）；D1，D2：Disease group；N1，N2：control group表 2 兩組（N/D）的總RNA檢測結果Table 2 Total RNA testing result of two group (N/D)樣品編號濃度（ng/L）OD260/280OD260/23028S/18SRIN值檢測結果N11721.871.5930.97.5AN22841.8931.5270.97.7AD12521.9381.1051.17AD22741,.8772.0451.27.2AA:樣品質量滿足建庫測序要求，且總量滿足2次或者2次以上建庫需要2.1.2 測序數(shù)據(jù)質量及Reads與參考基

26、因組比對情況樣品測序產(chǎn)出數(shù)據(jù)質量評估情況：從圖4、5可以看出四個樣本都只有前6個堿基錯誤率偏高，之后的堿基錯誤率均在0.01%以下。從表3也說明單個堿基位置的測序錯誤率均為0.01%，Q20，Q30值分別得到97%，95%以上，GC含量均在50%左右。圖4 對照組測序錯誤率分布Fig 4. The testing result of error rate distribution of control group圖5 造病組測序錯誤率分布Fig 5. The testing result error rate distribution of disease group 表.3 測序數(shù)據(jù)質量情況

27、Table 3 Quality status of the sequencing dataSample nameRaw readsClean readsClean basesError rate(%)Q20(%)Q30(%)GC content(%)N113172095129218320.650.0197.9395.9148.61N215908860156746750.780.0197.9495.9349.01D113818353134937940.670.0198.2496.6050.26D213992954137353610.690.0198.2396.6050.42注：Sample na

28、me: 樣品名；Raw reads: 統(tǒng)計原始序列數(shù)據(jù)，以四行為一個單位，統(tǒng)計每個文件的測序序列的個數(shù)；Clean reads: Clean reads的個數(shù)乘以長度，并轉化為以G為單位；Error rate: 通過公式：Qphred = -10log10(e) 計算得到；Q20，Q30：分別計算Phred數(shù)值大于20、30的堿基占總體堿基的百分比；GC content: 計算堿基G和C的數(shù)量總和占總的堿基數(shù)量的百分比。 Reads與參考基因組比對情況：如果參考基因組選擇合適并且相關實驗不存在污染的情況下，實驗所產(chǎn)生的測序序列的定位的百分比正常情況下會高于70%，其中具有多個定位的測序序列占總

29、體的百分比通常不會超過10%。在本實驗中，total reads 與參考基因組的比對均達到89%以上，Multiple mapped 均在2%以下（表4）。表4 Reads與參考基因組比對情況Table 4 The situation of reads mapping to reference genomeSample nameN1N2D1D2Total reads12921832156746751349379413735361Total mapped11687676(90.45%)14161568(90.35%)12120029(89.82%)12315378(89.66%)Multiple

30、 mapped218094(1.69%)228240(1.46%)210695(1.56%)250856(1.83%)Uniquely mapped11469582(88.75%)13933328(88.89%)11909334(88.26%)12064522(87.84%)Reads map to +5734482(44.38%)6963551(44.43%)5955487(44.14%)6029451(43.9%)Reads map to -5735100(44.38%)6969777(44.47%)5953847(44.12%)6035071(43.94%)Non-splice read

31、s9790044(75.76%)11774512(75.12%)10000081(74.11%)10074221(73.35%)Splice reads1679538(13%)2158816(13.77%)1909253(14.15%)1990301(14.49%)注：Total reads: 測序序列經(jīng)過測序數(shù)據(jù)過濾后的數(shù)量統(tǒng)計（Clean data）；Total mapped: 能定位到基因組上的測序序列的數(shù)量的統(tǒng)計；Multiple mapped：在參考序列上有多個比對位置的測序序列的數(shù)量統(tǒng)計；Uniquely mapped: 在參考序列上有唯一比對位置的測序序列的數(shù)量統(tǒng)計；Reads

32、to+，Reads to-：測序序列比對到基因組上正鏈和負鏈的統(tǒng)計；Splice reads：分段比對到兩個外顯子上的測序序列的統(tǒng)計，Non-splice reads為整段比對到外顯子的測序序列的統(tǒng)計。2.2 樣本間相關性樣本間皮爾遜關聯(lián)顯示：對照組和造病組各組內比較R2均大于0.9，而兩組組間比較則都小于0.9（圖6）圖6樣本間相關性檢測Fig 6 Correlation test of RNA-seq2.3 基因表達Density圖圖7 樣本差異基因表達density圖Fig.7 The density figure of sample differential expressed gen

33、es從圖7可以看出對組和正常組的基因表達不能完全吻合，說明了腹水雞和正常雞基因表達有差異。2.4 差異表達基因篩選通過對基因表達進一步篩選出顯著差異基因，從火山圖可以看出造病組和正常組差異表達的基因共有895個，其中上調基因有437個，下調基因458個（圖8）。圖8 差異表達基因篩選Fig. 8 Volcano plot of differential expressed genes2.5 差異基因GO Terms分析 差異基因GO Terms富集柱狀圖，直觀的反映出在生物過程（Biological process）、細胞組分（Cellular component）和分子功能（Molecula

34、r function）富集的GO term上差異基因的個數(shù)分布情況。我們挑選了富集最顯著的30個GO term在圖中展示，本實驗結果表明：對照組與造病組之間所有差異基因GO富集柱狀圖中顯著富集到2個參與生物過程，3個參與細胞組分，7個參與分子功能的差異基因；顯著富集到1個生物過程，8個細胞組分及2個參與分子功能的下調差異基因；顯著富集到2個參與生物過程，5個參與分子功能的上調差異基（圖10）。圖 10 GO富集柱狀圖A，B：分別表示下調基因及上調基因GO富集柱狀圖，縱坐標為富集的GO term，橫坐標為該term中差異基因個數(shù)；不同顏色用來區(qū)分生物過程、細胞組分和分子功能；帶“”的為顯著富集的

35、GO+termsFig. 10 GO enrichment histogramA, B represent the down and up regulated gene GO enrichment histogram, the enrichment term is in vertical coordinates and the number of differential genes of the term is in horizontal axis; the classify Of biological process, cellular Component and molecular Fu

36、nction is depended on the color, the terms with a “” is notable enrichment GO terms.3 討論3.1 RNA樣品質量 從RNA電泳圖可以看出28s和18s條帶的亮度差不多一樣，無雜帶（圖3）。樣品的濃度分別達到N1：172ng/L，N2：284ng/L，D1：252ng/L，D2：274ng/L，RIN均為7以上，樣品質量均達到A級（表2），表明樣品質量滿足建庫測序要求，且總量滿足2次或者2次以上建庫需要。數(shù)據(jù)質量與Reads對比情況一般情況下，單個堿基位置的測序錯誤率應低于0.01%，前6個堿基測序錯誤率較高的

37、原因為隨機引物和RNA模版的不完全結合，最高在0.06%左右可以接受。Reads的GC含量指標的警告閾值為15%的reads的GC含量偏離正態(tài)分的標準差13。本實驗中單個堿基位置的測序錯誤率均為0.01%，Q20，Q30值分別得到97%，95%以上，GC含量均在50%左右（表3），因此，本實驗的數(shù)據(jù)質量可靠。Reads與參考基因組比對情況：如果參考基因組選擇合適并且相關實驗不存在污染的情況下，實驗所產(chǎn)生的測序序列的定位的百分比正常情況下會高于70%，其中具有多個定位的測序序列占總體的百分比通常不會超過10%。在本實驗中，total reads 與參考基因組的比對均達到89%以上，有多個比對位置

38、的測序序列的定位的百分均在2%以下（表4），表明選擇的參考基因組可靠。3.2 樣本選擇的可靠性樣品間基因表達水平相關性是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標，相關系數(shù)越接近1，表明樣品之間的表達模式相似度越高14。從皮爾遜相關性可以看出在兩個對照組和兩個造病組之間相關性均大于0.9，而在對照組和造病組之間的相關系數(shù)則小于0.9，表明本實驗造病成功和樣本選擇合理；基因表達韋恩圖表達了各組表達的基因個數(shù)，以及其重疊關系，本實驗基因表達韋恩圖顯示對照組和造病組有明顯的基因表達差異?；鹕綀D可以反應出篩選后的差異基因整體分布情況，從圖7也反應出造病組的基因表達和對照組有顯著差異。 3.3 差異基因

39、GO Terms富集分析 差異基因GO富集柱狀圖，直觀反應出發(fā)病雞和正常雞在生物過程，細胞組分和分子功能方面的變化16。下調差異基因GO富集柱狀圖中顯示，顯著富集到的與生物過程有關的下調GO term翻譯，參與細胞組分的下調GO terms 核糖體，核糖核蛋白復合體，表明在腹水發(fā)生時機體的蛋白合成受到嚴重影響17，這可能是由于機體缺氧，以及細胞損傷等造成的；顯著富集到的GO terms無膜界限的細胞器，胞內無膜界限的細胞器，細胞質部分，細胞質，細胞外基質，核糖體的結構組分以及結構分子活性，胞外蛋白高分子配合物，表明發(fā)生腹水綜合癥時，機體的蛋白質含量大大減低，并且細胞核糖體等細胞器受到損傷，以及

40、細胞基質發(fā)生變化，腹水綜合癥發(fā)生時細胞的結構受到破壞16，富集到的和生物功能有關的上調基因GO terms有免疫反應和免疫系統(tǒng)過程，表明機體發(fā)生腹水綜合癥時，肉雞的免疫功能代償性上調，而富集到的和分子功能有關的上調基因包括趨化因子活性，趨化因子結合受體，細胞因子活性，細胞因子結合受體及G-蛋白偶聯(lián)受體，趨化因子是控制細胞定向遷移的一類細胞因子，趨化因子系統(tǒng)在清除病原體、炎癥反應、等方面都起著重要的作用，其增多可能是腹水發(fā)生時，機體的炎癥細胞大量增加，大量遷移的原因。細胞因子具有多種生物學活性，在機體內發(fā)揮重要的功能，機體細胞因子有關的分子功能GO terms 上調，也顯示機體內環(huán)境發(fā)生了嚴重的

41、失調9。4 結論本實驗通過高通量測序的方法在整個基因水平上研究了肉雞腹水綜合征發(fā)病過程中其肺動脈的變化，通過與正常雞對比，腹水雞出現(xiàn)了895個顯著差異表達基因，而根據(jù)GO term 的富集發(fā)現(xiàn)顯著下調的差異基因主要參與了核糖體，核糖體蛋白，轉錄，細胞外基質等生物過程，上調的差異基因主要富集到了免疫應答反應和趨化因子的活動等過程。根據(jù)結果可以推斷，肉雞在發(fā)生腹水綜合征的過程中，肺動脈細胞受到損失，為了保護機體，其免疫功能代償性上調。這些研究結果為肉雞腹水綜合癥的發(fā)病機制提供了更新的信息，也為研發(fā)肉雞腹水綜合癥新的藥物靶點篩選提供一定依據(jù)和臨床價值。參考文獻1. Che, XH, Park, EJ

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