單克隆抗體制備全攻略(一)

1、一、單克隆抗體的概念抗體是機(jī)體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。常規(guī)的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生的，因而抗血清通常含有針對其他無關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成分。一般的抗原分子大多含有多個不同的抗原決定簇，所以常規(guī)抗體也是針對多個不同抗原決定簇抗體的混合物。即使是針對同一抗原決定簇的常規(guī)血清抗體，仍是由不同B 細(xì)胞克隆產(chǎn)生的異質(zhì)的抗體組成。因而，常規(guī)血清抗體又稱多克隆抗體（polyclonal antibody ），簡稱多抗。由于常規(guī)抗體的多克隆性質(zhì)，加之不同批次的抗體制劑質(zhì)量差異很大，使它在免疫化學(xué)試驗(yàn)等使用中帶來許多麻煩。因此，制備針對預(yù)定抗原的特異性

2、均質(zhì)的且能保證無限量供應(yīng)的抗體是免疫化學(xué)家長期夢寐以求的目標(biāo)。隨著雜交瘤技術(shù)的誕生，這一目標(biāo)得以實(shí)現(xiàn)。1975年，Kohler 和Milstein 建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，他們把用預(yù)定抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞與能在體外培養(yǎng)中無限制生長的骨髓瘤細(xì)胞融合，形成B 細(xì)胞雜交瘤。這種雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征，既像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能無限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴細(xì)胞那樣合成和分泌特異性抗體。通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細(xì)胞的單克隆系，即雜交瘤細(xì)胞系，它所產(chǎn)生的抗體是針對同一抗原決定簇的高度同質(zhì)的抗體，即所謂單克隆抗體（monoclonal antibody ），簡稱單抗。與多抗相比

3、，單抗純度高，專一性強(qiáng)、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。單抗技術(shù)的問世，不僅帶來了免疫學(xué)領(lǐng)域里的一次革命，而且它在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個領(lǐng)域獲得極廣泛的應(yīng)用，促進(jìn)了眾多學(xué)科的發(fā)展。Kohler 和Milstein 兩人由此杰出貢獻(xiàn)而榮獲1984年度諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。二、雜交瘤技術(shù)（一）雜交瘤技術(shù)的誕生淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的誕生是幾十年來免疫學(xué)在理論和技術(shù)兩方面發(fā)展的必然結(jié)果，抗體生成的克隆選擇學(xué)說、抗體基因的研究、抗體結(jié)構(gòu)與生物合成以及其多樣性產(chǎn)生機(jī)制的揭示等，為雜交瘤技術(shù)提供了必要理論基礎(chǔ)，同時，骨髓瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)、細(xì)胞融合與雜交細(xì)胞的篩選等提供了技術(shù)貯備。1975年8月7日，Kohler

4、和Milstein 在英國自然雜志上發(fā)表了題為“分泌具有預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity ）的著名論文。他們大膽地把以前不同骨髓瘤細(xì)胞之間的融合延伸為將喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase ，HGPRT ）的骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。融合由仙臺病毒介導(dǎo)，雜交細(xì)胞通過在含有次黃嘌呤（hypoxanthine ，

5、H ）、氨基喋呤（aminopterin ，A ）和胸腺嘧啶核苷（thymidine ，T ）的培養(yǎng)基（HAT ）中生長進(jìn)行選擇。在融合后的細(xì)胞群體里，盡管未融合的正常脾細(xì)胞和相互融合的脾細(xì)胞是HGPRT ，但不能連續(xù)培養(yǎng)，只能在培養(yǎng)基中存活幾天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞不能在HAT 培養(yǎng)基中存活，只有骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞因得到分別來自親本脾細(xì)胞的HGPRT 和親本骨髓瘤細(xì)胞的連續(xù)繼代特性，而在HAT 培養(yǎng)基中存活下來。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果完全像起始設(shè)計的那樣，最終得到了很多分泌抗綿羊紅細(xì)胞抗體的克隆化雜交瘤細(xì)胞系。用這些細(xì)胞系注射小鼠后能形成腫瘤

6、，即所謂雜交瘤。生長雜交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同質(zhì)的抗體，即單克隆抗體。這一技術(shù)建立后不久，在融合劑和所用的骨髓瘤細(xì)胞系等方面即得到改進(jìn)。最早仙臺病毒被用做融合劑，后來發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG ）的融合效果更好，且避免了病毒的污染問題，從而得到廣泛的應(yīng)用。隨后建立的骨髓瘤細(xì)胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成輕鏈又不合成重鏈的變種，所以由它們產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系，只分泌一種針對預(yù)定的抗原的抗體分子，克服了骨髓瘤細(xì)胞MOPC-21等的不足。再后來又建立了大鼠、人和雞等用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞系，但其基本原理和方法是一樣的。（二）基本程序和方法雜交瘤技術(shù)在具體

7、操作上，各實(shí)驗(yàn)室使用的程序不盡一致。本節(jié)中介紹的方法是作者所在實(shí)驗(yàn)室采用的、實(shí)踐證明成熟的程序，該程序適合國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。在開展雜交瘤技術(shù)制備單抗之前，培養(yǎng)骨髓瘤和雜交瘤細(xì)胞必須具備下列主要儀器設(shè)備：超凈工作臺、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-70）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子，4000r/min）、37水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml 、50ml 、25ml 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，10ml 、1ml 刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml 、250ml 、100ml 鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml 、5ml 、1ml

8、注射器等，96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，融合管（50ml 圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細(xì)胞計數(shù)板，可調(diào)微量加樣器（50ul，200ul，1000ul），彎頭針頭，200目篩網(wǎng)，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細(xì)胞的篩選與檢測的儀器設(shè)備，依據(jù)檢測單抗的方法不同而各異，請參閱本節(jié)有關(guān)部分。淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的主要步驟包括：動物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選與單抗檢測、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等，圖6-1概括了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)研制單抗的主要過程。1、動物免疫(1抗原制備制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會增加，同時可以減輕篩

9、選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應(yīng)根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時易變性，或其免疫原性很強(qiáng)，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強(qiáng)時，則必須對抗原進(jìn)行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。(2免疫動物的選擇根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因?yàn)?，所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來源于LOU/c大鼠，所以

10、一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進(jìn)行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩(wěn)定，因?yàn)槿旧w容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。(3免疫程序的確定免疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B 淋巴細(xì)胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機(jī)會。因此在設(shè)計免疫程序時，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時間、佐劑的應(yīng)用及動物對該抗原的應(yīng)答能力等。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原?，F(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參照制備常規(guī)多克隆抗體

11、的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點(diǎn)眼。最后一次加強(qiáng)免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者，因?yàn)榭墒箍乖瓕ζ⒓?xì)胞作用更迅速而充分。在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾融合為好，許多實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果表明，初次免疫和再次免疫應(yīng)答反應(yīng)中，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應(yīng)答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM 抗體，再次免疫應(yīng)答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG 抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關(guān)系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達(dá)到最高的雜交瘤形成

12、率需要有盡可能多的漿母細(xì)胞，這在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾進(jìn)行融合較適宜。已有人報道采用脾內(nèi)免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應(yīng)性，且節(jié)省時間，一般免疫3天后即可融合。表6-1不同免疫抗原的免疫程序免疫原特性、抗原量、接種次數(shù)、間隔時間、單抗的特性106-106個細(xì)胞或1-10ug 、抗體滴度、親和性2-42-4周高中等免疫原性強(qiáng)（如細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等）至強(qiáng)免疫原性中等免疫原性弱10-100ug A.20-400ugB.10-50ugC.10-100ug 2中等2-42-4其后其后2-4周隨后2-3每月中等或高中等或強(qiáng)強(qiáng)每天中等中等每月10天1-2月2-3月中等4每月200-400ug 24其后

13、其后“休息”最后加強(qiáng)中等或強(qiáng)體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、來源充分的抗原，對于免疫原性很弱或?qū)C(jī)體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不大可能采用體內(nèi)免疫法。因此，針對這些情況，可采用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細(xì)胞（或淋巴結(jié)細(xì)胞，或外周血淋巴細(xì)胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。其基本方法是取4-8周齡BALB/c小鼠的脾臟，制成單細(xì)胞懸液，用無血清培養(yǎng)液洗滌2-3次，然后懸浮于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中，再加入適量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，細(xì)胞抗原105-106個細(xì)胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清

14、液；在37，6%CO2濃度下培養(yǎng)3-5天，再分離脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。2、細(xì)胞融合（1）主要試劑的配制a 、細(xì)胞培養(yǎng)基雜交瘤技術(shù)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基主要有RPMI-1640或DMEM （Dulberco Modified Eagles Medium ）兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具體配制方法按廠家規(guī)定的程序，配好后過濾除菌（0.22um ），分裝，4保存。不完全RPMI-1640培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基原液96ml100L.G.溶液1ml雙抗溶液1ml 7.5%NaHCO3溶液1-2mlHEPES 溶液1ml 不完全DMEM 培養(yǎng)基：DMEM 13.37g超純水或四蒸水980mlNaHCO33.7

15、g 雙抗溶液10ml100L.G.溶液10ml 用1N HCl 調(diào)試PH 至7.2-7.4，過濾除菌，分裝4保存。完全RPMI-1640或DMEM 培養(yǎng)基：不完全RPMI-1640或DMEM 培養(yǎng)基80ml小牛血清15-20ml 用于骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和建株后的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)。HT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM 培養(yǎng)基99ml HT 貯存液1ml HAT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM 培養(yǎng)基98mlHT 貯存液1mlA 貯存液1ml b 、氨基喋呤（A ）貯存液（100，410-5mol/L）:稱取1.76mg 氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于9

16、0ml 超純水或四蒸水中，滴加1mol/LNaOH 0.5ml 中和，再補(bǔ)加超純水或四蒸水至100ml 。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20保存。c 、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT ）貯存液(100,H:10-2mol/L，T ：1.610-3mol/L:稱取136.1mg 次黃嘌呤(Hypoxanthine,MW136.1 和38.8mg 胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW242.2 ，加超純水或四蒸水至100ml ，置45-50水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20凍存。用前可置37加溫助溶。d 、L-谷氨酰胺（L.G. ）溶液（100，0.2mol/L）:稱

17、取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine ，MW 146.15），用100ml 不完全培養(yǎng)液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20凍存。e 、青、鏈霉素（雙抗）溶液（100）:取青霉素G （鈉鹽）100萬單位和鏈霉素（硫酸鹽）1g ，溶于100ml 滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20凍存。f 、7.5%NaHCO3溶液:稱取分析純NaHCO37.5g ，溶于100ml 超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4保存。g 、HEPES 溶液（1mol/L）:稱取23.83g HEPES （N-2-Hydro

18、xyethylpiperazine-N ，-2-ethanesulfonic acid ，N-2-羥乙基哌嗪-N ，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶于100ml 超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4保存。h 、8-氮鳥嘌呤貯存液（100）:稱取200mg 8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine ，MW 152.1），加入4mol/LNaOH 1ml ，待其溶解后，加入超純水或四蒸水99ml ，過濾除菌；分裝小瓶，-20凍存。使用時按1%濃度加入到培養(yǎng)液中（即終濃度為20ug/ml）。g. 用新配制的10%Giemsa 染液染色10-20分鐘，然后用自來水洗去染液，自然

19、干燥。（Giemsa 染液配方：Giemsa 粉0.5g ，甘油33ml ，55-60保溫2小時，加甲醇33ml 混勻，保存于棕色瓶內(nèi)作為原液；取原液1份，加1/15mol/LPH6.8PBS 9份，即成10%Giemsa 染液）。h. 鏡檢：選擇染色體分散好，無重疊，無失散的細(xì)胞進(jìn)行觀察分析。每份標(biāo)本應(yīng)計數(shù)100個完整的中期核細(xì)胞，并注意觀察是否有標(biāo)志染色體。i 、50%PEG:稱取PEG 1000或400020-50g 于三角瓶中，蓋緊，60-80水浴融化，0.6ml 分裝于青霉素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘，-20存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養(yǎng)基，用少許7.5%NaHC

20、O3調(diào)PH 至8.0，或購買Sigma 或Gibco 公司現(xiàn)成產(chǎn)品。髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備融合前骨髓瘤細(xì)胞維持的方式，對成功地得到雜交瘤是最為重要的。目標(biāo)是使細(xì)胞處于對數(shù)生長的時間盡可能長，融合前肯定不能少于1周。凍存的細(xì)胞在復(fù)蘇后要2周時間才能處于適合于融合的狀態(tài)，長過了的骨髓瘤細(xì)胞至少幾天才可能恢復(fù)。在實(shí)驗(yàn)室中處于對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞維持在含10%小牛血清的培養(yǎng)基中，方法是用6個裝5ml 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細(xì)胞。1周后到細(xì)胞相當(dāng)密而又未長過的一瓶重新移植。典型的倍增時間為14-16小時。骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備方法如下：a 、于融合前48-36小時，將骨髓細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)（一般按一

21、塊96孔板的融合試驗(yàn)約需2-3瓶100ml 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)備）。b 、融合當(dāng)天，用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁瘤輕輕吹下，收集于50ml 離心管或融合管內(nèi)。c 、1000r/min離心5-10分鐘，棄去上清。d 、加入30ml 不完全培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于10ml 不完全培養(yǎng)基，混勻。e 、取骨髓瘤細(xì)胞懸液，加0.4%臺盼藍(lán)染液作活細(xì)胞計數(shù)后備用。細(xì)胞計數(shù)時，取細(xì)胞懸液0.1ml 加入0.9ml 臺盼藍(lán)染液中，混勻，用血球計數(shù)板計數(shù)。計算細(xì)胞數(shù)目的公式為：每毫升細(xì)胞數(shù)=4個大方格細(xì)胞數(shù)105/4；或每毫升細(xì)胞數(shù)=5個中方格細(xì)胞數(shù)106/2脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備取已經(jīng)免疫的BAL

22、B/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分鐘，于解剖臺板上固定后掀開左側(cè)腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈臺中用無菌手術(shù)剪剪開腹膜，取出脾臟置于已盛有10ml 不完全培養(yǎng)基的平皿中，輕輕洗滌，并細(xì)心剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織。將脾臟移入另一盛有10ml 不完全培養(yǎng)基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml 注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用注射器內(nèi)芯擠壓脾臟），使脾細(xì)胞進(jìn)入平皿中的不完全培養(yǎng)基。用吸管吹打數(shù)次，制成單細(xì)胞懸液。為了除去脾細(xì)胞懸液中的大團(tuán)塊，可用200目銅網(wǎng)過濾。收獲脾細(xì)胞懸液，1000r/min離心5-10分鐘，用不完

23、全培養(yǎng)基離心洗滌1-2次，然后將細(xì)胞重懸于10ml 不完全培養(yǎng)基混勻，取上述懸液，加臺酚藍(lán)染液作活細(xì)胞計數(shù)后備用。通常每只小鼠可得1108-2.5108個脾細(xì)胞，每只大鼠脾臟可得5108-10108脾細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞（Feeder cells ）的制備在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時單個或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明了，一般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。常用的

24、飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞。其中以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細(xì)胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下：按上述采小鼠脾細(xì)胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml 不完全培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨后吸出注入的培養(yǎng)液。1000r/min離心5-10分鐘，棄上清。先用5ml HAT 培養(yǎng)基將沉淀細(xì)胞懸浮，根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，補(bǔ)加HAT 培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度為2105/ml，備用。通常對巨噬細(xì)

25、胞來說，96孔培養(yǎng)板每孔需2104個細(xì)胞，24孔板每孔需105細(xì)胞。每只小鼠可得3-5106個細(xì)胞，因此一只小鼠可供兩塊96孔板的飼養(yǎng)細(xì)胞。也可在細(xì)胞融合前1-2天制備并培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞，這樣使培養(yǎng)板孔底先鋪上一層飼養(yǎng)細(xì)胞層。做法是，將上述細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml （相當(dāng)于2滴），然后置376%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合的程序已報道的有很多種，這里介紹的是作者所在實(shí)驗(yàn)室常用的一種。A 、將1108脾細(xì)胞與2107-5107骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml 融合管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)基至30ml ，充分混勻。B 、1000r/min離心5

26、-10分鐘，將上清盡量吸凈。C 、在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻; 置40水浴中預(yù)熱。D 、用1ml 吸管在1分鐘左右（最佳時間為45秒）加預(yù)熱至40的50%PEG （PH 8.0）1ml ，邊加邊輕輕攪拌。E 、用10ml 吸管在90秒內(nèi)加20-30ml 預(yù)熱至37的不完全培養(yǎng)基；20-37靜置10分鐘。F 、1000r/min5分鐘；棄去上清。G 、加入5ml HAT 培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，然后補(bǔ)加含腹腔巨噬細(xì)胞的HAT 培養(yǎng)基至80-100ml 。H 、分裝96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.10-0.15ml ；分裝24孔板，每孔1.0-1.5ml ；然后將培養(yǎng)板置

27、37，6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。I 、5天后用HAT 培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基。J 、7-10天后用HT 培養(yǎng)基換出HAT 培養(yǎng)基；（第14天后可用普通完全培養(yǎng)基）。L 、經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。3、雜交瘤細(xì)胞篩選雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測?？贵w檢測的方法很多，通常根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、準(zhǔn)備、簡便，便于一次處理大量樣品等特點(diǎn)。因?yàn)橥袔装賯€樣品需要在短短幾個小時就報告結(jié)果，以便決定雜交瘤細(xì)胞的取舍。所以選用抗體檢

28、測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測方法，并克服可能存在的問題。另一個重要問題是抗體檢測方法所需要的“動力學(xué)范圍”，即檢出背景以上的最強(qiáng)與最弱信號之比，依所用的檢測抗原是否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質(zhì)抗原的，100%的抗原參與反應(yīng)，一個陽性/陰性判別系統(tǒng)就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對細(xì)胞表面微量的蛋白抗原，檢測系統(tǒng)可能需要能測出微弱信號，則動力學(xué)范圍至少應(yīng)為10：1，最好為100：1。另外，檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預(yù)定的用途的影響。結(jié)合補(bǔ)體的抗體可以用基于細(xì)胞毒性反應(yīng)的檢測方法來選出。如需結(jié)合A 蛋

29、白的雜交瘤抗體，就要用結(jié)合蛋白A 的檢測方法。下面簡要介紹幾種常用的抗體檢測方法：免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶對底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成的免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性強(qiáng)，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于篩選和鑒定單抗。A 、器材和試劑a. 包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/LNa2CO38ml ，0.2mol/LNaHCO317ml 混合，再加75ml 蒸餾水，調(diào)PH 至9.6。Tris-HCl 緩沖液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/LTris 100ml ，0.1mol/LHCl 58.4ml 混合，加蒸餾水至1000ml 。b. 洗滌緩沖液（

30、PH7.2的PBS ）：KH2PO40.2g ，KCl 0.2g ，Na2HPO412H2O2.9g ，NaCl 8.0g ，Tween-200.5ml ，加蒸餾水至1000ml 。c. 稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（BSA ）0.1g ，加洗滌液至100ml ；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。d. 酶反應(yīng)終止液（2mol/LH2SO4）：取蒸餾水178.3ml ，滴加濃硫酸（98%）21.7ml 。e. 底物緩沖液（PH5.0，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取0.2mol/LNa2HPO425.7ml ，0.1ml/L檸檬酸24.3ml ，再加50ml 蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液

31、不穩(wěn)定，易形成沉淀，因此一次不宜配制過多。f. 底物使用液：OPD 底物使用液（測490nm 的OD 值）：OPD 5mg ，底物緩沖液10ml ，3%H2O20.15ml 。TMBS 或TMB 底物使用液（測450nm 的OD 值）：TMBS 或TMB （1mg/ml）1.0ml ，底物緩沖液10ml ，1%H2O225ul 。ABTS 底物使用液（測410nm 的OD 值）：ABTS 0.5mg ，底物緩沖液1ml ，3%H2O22ul 。g. 抗體對照：以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對照，以免疫鼠血清作為陽性血清。h. 抗原：可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。病毒感染的傳代細(xì)胞或全菌抗

32、原。淋巴細(xì)胞等懸液。i. 酶標(biāo)抗鼠抗體或酶標(biāo)SPA 或其他類似試劑。j. 細(xì)胞固定液：-20丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4100mg ，KH2PO4500mg ，蒸餾水150ml ，丙酮225ml ，甲醛125ml ；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20甲醇。k. 聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。l. 酶聯(lián)免疫閱讀儀；或光鏡。m. 吸管、加樣器及水浴箱、離心機(jī)等。B 、可溶性抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA ）a. 純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。b. 以50-100ul/孔量加入酶標(biāo)板孔中，置4過夜或37吸附2小時。c. 棄去孔內(nèi)的液體，同時

33、用洗滌液洗3次，每次3-5分鐘，拍干。d. 每孔加200ul 封閉液4過夜或37封閉2小時；該步驟對于一些抗原，可省略。e. 洗滌液洗3次；此時包被板可-20或4保存?zhèn)溆?。f. 每孔加50-100ul 待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時設(shè)立陽性、陰性對照和空白對照；37孵育1-2小時；洗滌，拍干。g. 加酶標(biāo)第二抗體，每孔50-100ul ，37孵育1-2小時，洗滌，拍干。h. 加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul ，3710-30分鐘。i. 以2mol/LH2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD 值。j. 結(jié)果判定：以P/N2.1，或P N 3D 為陽性。若陰性對照孔無色或接

34、近無色，陽性對照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結(jié)果。C 、全菌抗原的ELISASa. 新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌用蒸餾水或PBS 懸浮，并調(diào)整細(xì)菌濃度至1108個/ml。必須指出，對于人畜共患病病原體需注意安全操作，最好是滅活處理。b. 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/LNaHCO395ml 25%戊二醛溶液5ml ），37作用2小時，蒸餾水洗滌3次；加上述細(xì)菌懸液50ul/孔；37-56烘干；每孔加200ul 封閉液4過夜或372小時封閉。c. 步驟b 也可采用先每孔加50ul 細(xì)菌懸液，37-56烘干，然后用-20預(yù)冷的無水甲醇室溫作用15分鐘，蒸餾水洗滌3次；每孔加200ul 封閉

35、液4過夜或372小時封閉。d. 洗滌液洗3次；此時包被板可在-20或4保存?zhèn)溆?。e. 以下步驟同上法。D 、用全細(xì)胞抗原的ELISAa. 按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，接種病毒，收獲感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，用PBS 制成適當(dāng)濃度懸液。b. 淋巴細(xì)胞懸液的制備采用新鮮外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴細(xì)胞分離液之上，1500rpm 離心30分鐘，吸取界面細(xì)胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細(xì)胞懸液。該細(xì)胞懸液中若仍混有紅細(xì)胞，離心后加0.83%的氯化銨溶液，室溫10分鐘，洗滌一次即可。將該細(xì)胞懸液稀釋至適當(dāng)濃度。c. 每孔加100ul 上述a 或b 的細(xì)胞懸液，使每孔含細(xì)胞5104個；1500r/min15

36、分鐘，甩去上清；室溫干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4固定10分鐘；可4或-20保存?zhèn)溆谩. 以下步驟同上法。E 、抗體捕捉ELISA 試驗(yàn)本法用抗BALB/c小鼠Ig 的多克隆抗體捕捉待檢樣品中的McAb ，再依次加抗原、酶標(biāo)多克隆抗體及底物顯色。該法是常用的ELISA 中較理想的一種；其操作步驟如下：a. 以適當(dāng)濃度的純化抗鼠Ig 抗體包被酶標(biāo)板，每孔加100ul ，372小時或4過夜。b. 洗滌、拍干后加待測的McAb 樣品，371-2小時。c. 洗滌后加適量的抗原，371-2小時。d. 洗滌后加入酶標(biāo)多克隆抗體，371-2小時。洗滌后加底物顯色，判定結(jié)果。F 、ABC-ELISA

37、試驗(yàn)ABC-ELISA 是在常規(guī)ELISA 原理的基礎(chǔ)上，增加了生物素（Biot in ）與親和素（Avidin ）間的放大作用。親和素有4個亞單位組成，對生物素有高度的親合力。生物素很易與蛋白質(zhì)共價結(jié)合。因此，結(jié)合了酶的親和素與結(jié)合有抗體的生物素發(fā)生反應(yīng)即起到了多極放大作用。其操作步驟如下：a. 已知抗原的包被及加待檢McAb 樣品，同間接ELISA 試驗(yàn)。b. 加生物素化抗鼠Ig 抗體，每孔100ul ，371小時；洗滌。c. 加酶標(biāo)親和素，每孔100ul ，3730分鐘洗滌；加底物顯色，判定結(jié)果。G 、Dot-ELISA 試驗(yàn)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（Dot-ELISA ）是以硝酸纖維素膜或醋酸纖維

38、素膜為固相載體，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的免疫檢測手段。該法采用不溶性底物（如DAB ，或4-氯萘酚或AgNO3等），其與相應(yīng)標(biāo)記物（HRP 、AP 、膠體金）作用形成不溶性產(chǎn)物，呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀著色，從而易于判定結(jié)果。根據(jù)所用的標(biāo)記物不同，可分為HRP 免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)、AP 免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)和免疫金銀斑點(diǎn)法等。其操作步驟大致如下：a. 將抗原液2-5ul 點(diǎn)加于纖維素膜上，室溫37干燥。b. 將纖維膜浸入封閉液中，3730分鐘。c. 用洗滌液洗2次，吸干后加待檢McAb 樣品，371小時；用洗滌液振蕩洗滌三次，每次5分鐘，加HRP 或AP 或膠體金標(biāo)記的抗鼠Ig 抗體，37作用30分鐘。d. 同法洗滌，吸干，用

39、新配的相應(yīng)底物溶液顯色，然后水洗終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。H 、免疫組化染色法該法主要用于檢測針對細(xì)胞抗原成分的McAb ，常用的方法是間接免疫過氧化物酶試驗(yàn)（IIP ，indirect immunoperoxidase ）及APAAP 技術(shù)。其結(jié)果用光鏡或倒置顯微鏡檢查。免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)可用于多種抗原的雜交瘤抗體檢測，如細(xì)胞性抗原（包括細(xì)菌和動物細(xì)胞）、感染細(xì)胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作簡單、敏感性高，可直接觀察抗原定位等優(yōu)點(diǎn)，在McAb 的篩選與鑒定上具有重要的應(yīng)用價值。A 、器材和試劑a. 供檢測抗體用的抗原制備固定細(xì)胞片或板，活細(xì)胞懸液。b. PBS （PH7.2，0.01mol

40、/L）c. 待檢的McAb 樣品。d. 冷丙酮e. FITC （異硫氰酸熒光素）或TRITC （四甲基異硫氰酸羅丹明熒光素）標(biāo)記的抗鼠Ig 抗體等f. 熒光顯微鏡，磁力攪拌器，離心機(jī)，水浴箱等。B 、間接免疫熒光法a. 固定細(xì)胞片的制備：生長在蓋片上的細(xì)胞（接種或未接種病毒），可直接收獲蓋片，在PBS 中洗滌，用4丙酮固定10分鐘，空氣干燥，置密封容器于-20保存?zhèn)溆茫粏渭?xì)胞懸液可在蓋片上制成涂片，固定方法同上。細(xì)胞涂片的制備：將10ul 細(xì)菌懸液（1108個/ml）涂抹721mm蓋片上，自然干燥后，用-20丙酮固定10-15分鐘，于-20保存?zhèn)溆谩. 蓋片在去離子水中濕潤后置架上滴加10-

41、20ul 雜交瘤上清或其他待檢樣品；設(shè)立陽性、陰性對照；置37水浴孵育0.5-1小時。c. 取出蓋片置PBS 中用磁力攪拌器洗滌15分鐘。d 蓋片置架上，滴加工作濃度的抗鼠Ig 的熒光抗體10-20ul ，37孵育0.5-1小時。e 同法洗滌15分鐘；取出蓋片，用延緩熒光碎滅的封載劑（如緩沖甘油，9份甘油加1份PBS ）封于干凈載玻片上。f. 光顯微鏡上觀察，陽性結(jié)果可見特異性熒光（FITC 為黃綠色熒光，TRITC 為桔紅色熒光）。g. 細(xì)胞固定片的制備，也可改在培養(yǎng)板孔中進(jìn)行，其余步驟同上，在觀察結(jié)果時，將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)置于熒光顯微鏡下，判斷標(biāo)準(zhǔn)不變。C 、細(xì)胞的膜熒光染色完整的活細(xì)胞的細(xì)胞膜

42、，抗體不能透過。如果細(xì)胞在4操作，則熒光染色僅限于細(xì)胞膜。必須注意死細(xì)胞常以非特異性方式吸附大量熒光抗體，因此試驗(yàn)過程中要保證細(xì)胞的高活力?；罴?xì)胞的膜熒光染色大致步驟如下：a. 制備活性較好的細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度至107個/ml。b. 在小試管（550mm）中加入100ul 細(xì)胞懸液，再加入100ul 待檢McAb 的樣品，混勻，4作用30-90分鐘。c. 用洗滌液（PBS 900ml ，小牛血清50ml ，4%NaN350ml ）洗二次，每次加洗滌液1-5ml ，1000r/min離心5分鐘，棄上清。加入100ul 熒光抗體，4作用30-90分鐘。d. 同法洗滌，將細(xì)胞重新懸于20-30ul

43、含10%甘油和10-100ug 苯二胺/ml的溶液中；滴加于載玻片上，加蓋片封載。e. 立即在熒光顯微鏡上檢查。f. 細(xì)胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理鹽水固定，立即檢查，或至少在4可保存一周。間接血凝試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn)又稱被動血凝試驗(yàn)（PHA ），是目前應(yīng)用較廣的檢測方法之一。本試驗(yàn)是以包被可溶性抗原的紅細(xì)胞作為指示系統(tǒng)，當(dāng)被檢抗體與包被在紅細(xì)胞上的抗原產(chǎn)生特異性反應(yīng)時，導(dǎo)致紅細(xì)胞呈凝集現(xiàn)象?？梢?，該法具有靈敏、快速、容易操作和無需昂貴儀器等優(yōu)點(diǎn)，而且經(jīng)改用醛化紅細(xì)胞以后，克服原來重復(fù)性差的缺點(diǎn)。A 、器材和試劑a. 綿羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。b. 緩沖液：PBS （PH7.2）；醋酸緩

44、沖液。c. 甲醛，丙酮醛，NaN3，抗凝劑等。d. 血凝板，振蕩器等。B 、多糖抗原的間接血凝試驗(yàn)a. 甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：無菌采集綿羊頸靜脈血50ml ，用枸櫞酸鈉作抗凝劑；用5倍于紅細(xì)胞壓積的PH7.2PBS （Na2HPO412H2O3.58g ，KH2PO40.41g ，NaCl 8.01g ，蒸餾水1000ml ）充分洗滌5次，每次1500r/min5-10分鐘，直至上清測定無蛋白質(zhì)（用飽和硫酸銨滴定上清，觀察有無白色沉淀），再以相同緩沖液配成25%紅細(xì)胞懸液；將25%紅細(xì)胞懸液與20%甲醛以2.5：1的比例混勻，37水浴作用2小時，每15分鐘振蕩一次，紅細(xì)胞顏色逐漸由鮮紅色轉(zhuǎn)變

45、為棕色；以PH7.2PBS 洗滌4次，每次2000r/min10分鐘，再以同樣的PBS 制成25%紅細(xì)胞懸液；其后，重復(fù)醛化一次，方法同前；最后配成20%醛化綿羊紅細(xì)胞懸液，加甲醛至0.3%防腐，4保存?zhèn)溆?。b. 脂多糖抗原致敏甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：取脂多糖（LPS ），以0.2mol/LPH8.0PB 液，調(diào)整多糖濃度至120ug/ml，然后100水浴處理1小時；將冷卻至37的熱處理LPS 與6%醛化紅細(xì)胞等量混合，37攪拌作用45分鐘；取出離心2000r/min10分鐘，以0.01mol/LPH7.2PBS 洗滌4次；配制成4%致敏血球，分裝，保存于4備用，或凍干保存。c. McAb 的

46、篩選：取待測McAb 樣品25ul ，加入V 型微量血凝板孔中，同時設(shè)立陰性、陽性對照；再加入0.5-4%致敏紅血球懸液25ul ，在振蕩器上混勻30秒；置室溫或3730-60分鐘觀察結(jié)果。陰性對照孔應(yīng)呈緊縮的圓點(diǎn)。C 、可溶性蛋白抗原的間接血凝試驗(yàn)a. 紅細(xì)胞醛化：采用雙醛法。采綿羊或人“O”型抗凝血，每次加10倍于紅細(xì)胞壓積的PBS 洗滌4-6次，然后配成8%紅細(xì)胞懸液；向此8%紅細(xì)胞懸液緩慢加入等量含有3%丙酮醛和3%甲醛的PBS ，于室溫緩慢攪拌17小時；其后洗滌3次，配成20%雙醛化紅細(xì)胞懸液，加0.1%NaN3防腐，4保存?zhèn)溆?。b. 致敏紅細(xì)胞：取20%雙醛化紅細(xì)胞0.1ml ，1

47、500r/min10分鐘，棄上清，沉積紅細(xì)胞加0.2mol/LPH4.0醋酸-醋酸鈉緩沖液1ml ，并加最適濃度（應(yīng)預(yù)先測定，蛋白抗原為50ug/ml左右）的抗原1ml ，混勻，于45致敏30分鐘，有時輕輕搖動，使紅細(xì)胞不下沉。然后離心去上清，并用20倍于紅細(xì)胞壓積的PBS 洗3-4次，最后用PBS 配成0.5-1%致敏紅細(xì)胞，4保存?zhèn)溆?。c. McAb 測定：同上法。放射免疫測定放射免疫測定是用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體，以檢測相應(yīng)抗原或抗體的定量方法。在篩選和鑒定單抗時常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以檢測樣品中的McAb ，其操作步驟如下：a. 用碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至適宜的

48、濃度（1-100ug/ml），滴加聚乙烯微板孔內(nèi)，100ul/孔，4過夜或372小時。b. 棄去抗原液，每孔加100ul 含0.5-1%BSA 的PBS ，41-2小時封閉。c. 用BSA-PBS 洗滌3次，每次3分鐘。d. 加待檢樣品，每孔100ul ，設(shè)立陰性孔、陽性孔和空白孔；371-2小時，同法洗滌。e. 每孔加125I 標(biāo)記的抗鼠Ig 抗體工作液100ul ，371-2小時，同法洗滌。f. 用-射線閃爍計數(shù)儀分別測定各孔放射性。通常要求樣品孔和陽性對照孔的放射性脈沖分別超過本底5倍和10倍。若以空白孔的放射性為基準(zhǔn)，凡樣品孔與陰性孔放射性之比大于3的樣品定為陽性。4、雜交瘤細(xì)胞的克隆

49、化從原始孔中得到的陽性雜交瘤細(xì)胞，可能來源于二個或多個雜交瘤細(xì)胞，因此它們所分泌的抗體是不同質(zhì)的。為了得到完全同質(zhì)的單克隆抗體，必須對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。另一方面，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的能力。為了除去這部分已不再分泌抗體的細(xì)胞，得到分泌抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞系（又稱亞克?。?，也需要克隆化。另外，長期液氮凍存的雜交瘤細(xì)胞，復(fù)蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，因此也應(yīng)作克隆化，以檢測抗體分泌情況。通常在得到針對預(yù)定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進(jìn)行2-3次克隆化，有時還需進(jìn)行多次。所謂克隆化是指使單個細(xì)胞無性繁殖而獲得該細(xì)胞團(tuán)體的整個培養(yǎng)過程?？寺?/p>

50、化的方法很多，如有限稀釋法、軟瓊脂法、單細(xì)胞顯微操作法、單克隆細(xì)胞集團(tuán)顯微操作法和熒光激活細(xì)胞分類儀（FACS ）分離法。這里介紹最簡單也是使用最廣泛的前兩種方法。（1）有限稀釋法材料：a. 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板等；b. HT 培養(yǎng)基；c. 活力強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞；d. 小鼠腹腔細(xì)胞。方法：a. 制備小鼠腹腔細(xì)胞。同“細(xì)胞融合”一節(jié)中的方法。b. 制備待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液，用含20%血清的HT 培養(yǎng)基稀釋至每毫升含2.5、15和50個細(xì)胞3中不同的稀釋度。c. 按每毫升加入5104-1105細(xì)胞的比例，在上述雜交瘤細(xì)胞懸液中分別加入腹腔巨噬細(xì)胞。d. 每種雜交瘤細(xì)胞分裝96孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔量為0.2ml ，每孔的雜交瘤細(xì)胞數(shù)分別為0.5、3和10。e. 37、7.5%CO2濕潤培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。f. 取抗體檢測陽性孔的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存。g. 本法中（b ）、（c ）、（d ）也可簡化為將計數(shù)后的雜交瘤細(xì)胞準(zhǔn)確地進(jìn)行系列稀釋，直至每毫升含10個細(xì)胞，按每孔接種0.1ml 細(xì)胞懸液，即每孔含1個細(xì)胞。（2）軟瓊脂法材料：a