實驗-常規(guī)儀器的使用ppt課件

1、生物化學與分子生物學實驗技術20年代： 微量分析技術導致了維生素、激素和輔酶等的發(fā)現。 瑞典著名的化學家T.Svedberg奠基了“超離心技術的理論基礎，1924年制成了第一臺5000 RCF的離心機5000 r/min-8000 r/min，相對離心力“RCF的單位可表示為“g”)，并準確測定了血紅蛋白等復雜蛋白質的分子量，獲得了1926年的諾貝爾化學獎。1. 1 生物化學實驗技術發(fā)展簡史30年代： 電子顯微鏡技術打開了微觀世界，使我們能夠看到細胞內的結構和某些生物大分子的大致結構。 美國哈佛大學的Folin教授和中國的吳憲教授建立了不少生物化學常用的分析方法如血糖分析、蛋白質含量分析、氨基

2、酸測定等。 英藉德裔生物化學家Krebs，在1937年發(fā)現了三羧酸循環(huán)，對細胞代謝及分子生物學的研究作出了重要貢獻，他與美藉德裔生物化學家Lipmann共獲1953年諾貝爾生理醫(yī)學獎。40年代： 兩位英國科學家Martin和Synge發(fā)明了分配色譜層析），他們獲得了1952年的諾貝爾化學獎。由此，層析技術成為分離生化物質的關鍵技術。 電泳技術由瑞典的著名科學家Tisellius奠基，從而開創(chuàng)了電泳技術的新時代，他因此獲得了1948年的諾貝爾化學獎。 層析技術和電泳技術用于分析生物大分子的組成和代謝的中間產物，示蹤技術的應用推動了代謝的研究。 美國化學家Pauling確認氫鍵在蛋白質空間結構中以

3、及生物大分子間相互作用的重要性等，并因此而獲得了諾貝爾化學獎。50年代： 自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次將放射性同位素示蹤用于碳水化合物及類脂物質的中間代謝的研究以后，射性同位素示蹤技術50年代有了大的發(fā)展，為各種生物化學代謝過程的闡明起了決定性的作用。 1953年美國科學家Watson和英國科學家Crick提出DNA分子反向平行雙螺旋模型，1962年與英國科學家Wilkins分享諾貝爾生理醫(yī)學獎， Wilkins和Franklin通過對DNA分子的X-射線衍射研究為Watson和Crick的DNA模型提供了有力的實驗證據， DNA雙螺旋模型的提出開創(chuàng)了生物科學

4、的歷史新紀元。 在X-射線衍射技術方面，英國物理學家Perutz對血紅蛋白的結構進行X-射線結構分析, Kendrew測定了肌紅蛋白的結構，成為研究生物大分子立體結構的先驅，他們同獲1962年諾貝爾化學獎。 英國生物化學家Sanger還于1953年確定了牛胰島素中氨基酸的順序而獲得1958年的諾貝爾化學獎。 Kornberg發(fā)現了DNA聚合酶，美藉西班牙裔科學家Uchoa發(fā)現了細菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了將基因內的遺傳信息通過RNA中間體翻譯成蛋白質的過程。兩人分享了1959年諾貝爾生理醫(yī)學獎。60年代： 各種儀器分析方法用于生物化學研究，取得了很大的發(fā)展，如HPLC技術、紅外、紫外、

5、圓二色等光譜技術、NMR核磁共振技術等。 自1958年Stem，Moore和Spackman設計出氨基酸自動分析儀，大大加快了蛋白質的分析工作。1967年Edman和Begg制成了氨基酸序列分析儀，到1973年Moore和Stein設計出氨基酸序列自動分析儀，又大大加快了對多肽一級結構的測定，十多年間氨基酸的自動測定工作得到了很大的發(fā)展和完善。 在60年代，層析和電泳技術又有了重大的進展，在1968-1972年Anfinsen創(chuàng)建了親和層析技術，開辟了層析技術的新領域。1969年Weber應用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術測定了蛋白質的相對分子質量，使電泳技術取得了重大進展。 美國生物化學家N

6、irenberg在破譯遺傳密碼方面作出了重要貢獻，Holly闡明了酵母丙氨酸t(yī)RNA的核苷酸排列順序，后來證明所有tRNA的結構均相似。美藉印度裔生物化學家Khorana提出按預定的序列合成核酸分子的方法。他們3人共獲1969年諾貝爾生理醫(yī)學獎。 法國生物學家Lwoff、JAcob和生物化學家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共獲1965年諾貝爾生理醫(yī)學獎。70年代： 基因工程技術取得了突破性的進展，Arber，Smith和Nathans三個小組發(fā)現并純化了限制性內切酶，1972年，美國斯坦福大學的Berg等人首次用限制性內切酶切割了DNA分子，并實現了DNA分子的

7、重組。1973年，又由美國斯坦福大學的Cohen等人第一次完成了DNA重組體的轉化技術，這一年被定為基因工程的誕生年，Cohen成為基因工程的創(chuàng)始人，從此，生物化學進入了一個新的大發(fā)展時期。與此同時，各種儀器分析手段進一步發(fā)展，制成了DNA序列測定儀、DNA合成儀等。 80年代 基因工程技術進入輝煌發(fā)展的時期，1980年，英國劍橋大學的生物化學家Sanger和美國哈佛大學的Gilbert分別設計出兩種測定DNA核苷酸序列的方法，而與Berg共獲諾貝爾化學獎，從此，DNA序列分析法成為生物化學與分子生物學最重要的研究手段之一。他們3人在DNA重組和RNA結構研究方面都作出了杰出的貢獻。 1981

8、年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛細管電泳技術HPCE），由于其高效、快速、經濟，尤其適用于生物大分子的分析，因此受到生命科學、醫(yī)學和化學等學科的科學工作者的極大重視，發(fā)展極為迅速，是生化實驗技術和儀器分析領域的重大突破，意義深遠?，F今，由于HPCE技術的異軍突起，HPLC技術的發(fā)展重點己轉到制備和下游技術。 1984年德國科學家Kohler、美國科學家Milstein和丹麥科學家Jerne由于發(fā)展了單克隆抗體技術，完善了極微量蛋白質的檢測技術而共享了諾貝爾生理醫(yī)學獎。 1985年美國加利福尼亞州Cetus公司的Mullis等發(fā)明了用PCR技術Polymerase Chain

9、 Reaction即聚合酶鏈式反應擴增DNA的技術，對于生物化學和分子生物學的研究工作具有劃時代的意義，因而與第一個設計基因定點突變的Smith共享1993年的諾貝爾化學獎 1988年，美國遺傳學家McClintock由于在二十世紀五十年代提出并發(fā)現了可移動的遺傳因子而獲得諾貝爾生理醫(yī)學獎。 1989年，美國科學家Altman和Cech由于發(fā)現某些RNA具有酶的功能稱為核酶而共享諾貝爾化學獎。90年代： 1993年，美國科學家Roberts和Sharp由于在斷裂基因方面的工作而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學獎。 1994年，美國科學家Gilman和Rodbell由于發(fā)現了G蛋白在細胞內信息傳導中的作用而分

10、享諾貝爾生理醫(yī)學獎。 2019年，美國科學家Lewis、德國科學家Nusslein-Volhard和美國科學家Wieschaus由于在20世紀40-70年代先后獨立鑒定了控制果蠅體節(jié)發(fā)育基因而共享諾貝爾生理醫(yī)學獎。 進入21世紀以來，PCR技術、生物芯片技術不斷完善，基因組學、蛋白質組學、生物信息學發(fā)展迅速。我國生物化學界的主要成就 我國生物化學界的先驅吳憲教授在20年代初由美回國后，在協(xié)和醫(yī)科大學生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質變性理論、血液生化檢測和免疫化學等一系列有重大影響的研究。 1965年我國化學和生物化學家用化學方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的結晶牛胰島素，1983

11、年又通過大協(xié)作完成了酵母丙氨酸轉移核糖核酸的人工合成。近年來，在酶學研究、蛋白質結構及生物膜的結構與功能等方面都有舉世矚目的研究成果。 90年代以來，我國參與了人類基因組計劃，在水稻基因組研究中處于國際領先水平，在功能基因組學研究中取得不少成績。1.2 1.2 生化實驗室的基本設施與裝備生化實驗室的基本設施與裝備溫度與環(huán)境設施溫度與環(huán)境設施 許多生化實驗都要求在一定的溫度和濕度下進許多生化實驗都要求在一定的溫度和濕度下進行操作，因此，一個正規(guī)的生化實驗室必須能夠保行操作，因此，一個正規(guī)的生化實驗室必須能夠保持恒溫、恒濕的環(huán)境。為了保持這些條件，實驗室持恒溫、恒濕的環(huán)境。為了保持這些條件，實驗室

12、都應裝備空調和加濕器等，而儀器分析室則要求保都應裝備空調和加濕器等，而儀器分析室則要求保持干燥，一些怕潮濕和易水解的試劑應保存在干燥持干燥，一些怕潮濕和易水解的試劑應保存在干燥箱中。由于各種生物材料、制劑和各種生化試劑要箱中。由于各種生物材料、制劑和各種生化試劑要求在不同的溫度下保存，實驗室必須備有求在不同的溫度下保存，實驗室必須備有44、2020、8080的冰箱，需要在更低溫度下保存的樣的冰箱，需要在更低溫度下保存的樣品，則須使用液氮罐。對于需在較高溫度下進行的品，則須使用液氮罐。對于需在較高溫度下進行的操作，則可使用烘箱和高溫電爐等。實驗室還應備操作，則可使用烘箱和高溫電爐等。實驗室還應備

13、有干冰，以便使用乙醇有干冰，以便使用乙醇- -干冰浴進行樣品的快速冷凍干冰浴進行樣品的快速冷凍分裝。分裝。 實驗室用純水實驗室用純水 生化實驗室使用最多的溶劑是生化實驗室使用最多的溶劑是“水水”，配制生化實驗用試，配制生化實驗用試劑不能用自來水，只能使用經過純化的水。生化實驗對所用劑不能用自來水，只能使用經過純化的水。生化實驗對所用水的純度是要求比較高的，通常可以認為，水的質量越高，水的純度是要求比較高的，通?？梢哉J為，水的質量越高，實驗的結果就越真實可靠和準確，為此必須保證實驗用水的實驗的結果就越真實可靠和準確，為此必須保證實驗用水的質量。常用的兩種純水是二次蒸餾水和無離子水。在超純分質量。

14、常用的兩種純水是二次蒸餾水和無離子水。在超純分析和特殊的生化實驗中要求更高的水質，如無菌水、亞沸蒸析和特殊的生化實驗中要求更高的水質，如無菌水、亞沸蒸餾水、無二氧化碳蒸餾水等。根據實際工作的需要，來選用餾水、無二氧化碳蒸餾水等。根據實際工作的需要，來選用水的種類，如：無離子水、普通蒸餾水、二次蒸餾水、亞沸水的種類，如：無離子水、普通蒸餾水、二次蒸餾水、亞沸蒸餾水及按特殊要求制備的高純水等。蒸餾水及按特殊要求制備的高純水等。 所有的各種純水，在貯存中都會被污染：塑料容器會產所有的各種純水，在貯存中都會被污染：塑料容器會產生有紫外吸收的有機物；玻璃和金屬容器會產生金屬離子的生有紫外吸收的有機物；玻

15、璃和金屬容器會產生金屬離子的污染；長時間放置更會使水長菌，空氣中的二氧化碳會溶入污染；長時間放置更會使水長菌，空氣中的二氧化碳會溶入水中，所以貯存高純水一定要隔絕空氣，密封蓋嚴，必要時水中，所以貯存高純水一定要隔絕空氣，密封蓋嚴，必要時貯存在冰箱的冷藏室中。貯存在冰箱的冷藏室中。消毒系統(tǒng)消毒系統(tǒng) 生化實驗要進行生物培養(yǎng)和生物反應的操作，生化實驗要進行生物培養(yǎng)和生物反應的操作，這些操作都必須排除其他生物因素的干擾，因此這些操作都必須排除其他生物因素的干擾，因此在做這些實驗之前，都必須對實驗中用到的、可在做這些實驗之前，都必須對實驗中用到的、可能造成污染的材料、器械等進行消毒滅菌處理。能造成污染的

16、材料、器械等進行消毒滅菌處理。常用的滅菌方法有：高溫、高壓滅菌、紫外線照常用的滅菌方法有：高溫、高壓滅菌、紫外線照射、火焰焚燒、過濾除菌、酒精等試劑浸泡消毒射、火焰焚燒、過濾除菌、酒精等試劑浸泡消毒等，因此實驗室必須配備各種無菌處理設備。等，因此實驗室必須配備各種無菌處理設備。 離心設備離心設備 離心方法是分離和制備生物大分子最常用的離心方法是分離和制備生物大分子最常用的手段，因而生化實驗室必須備有各種形式的離心手段，因而生化實驗室必須備有各種形式的離心機。常用的有普通臺式離心機、高速冷凍離心機機。常用的有普通臺式離心機、高速冷凍離心機和超速離心機等。和超速離心機等。 計量系統(tǒng)計量系統(tǒng) 生化實

17、驗都要求在各種標準的定量條件下進行，因此生化實驗都要求在各種標準的定量條件下進行，因此實驗室必須配備各種標準的定量系統(tǒng)。常用的定量系統(tǒng)有：實驗室必須配備各種標準的定量系統(tǒng)。常用的定量系統(tǒng)有：稱量系統(tǒng)、液體體積度量系統(tǒng)、稱量系統(tǒng)、液體體積度量系統(tǒng)、pHpH測定系統(tǒng)、液體溶質定測定系統(tǒng)、液體溶質定量系統(tǒng)等。量系統(tǒng)等。 稱量儀器：最常用的設備是各種千分之一的扭力稱量儀器：最常用的設備是各種千分之一的扭力天平、單、雙盤天平和各種萬分之一的電子天平等，它們天平、單、雙盤天平和各種萬分之一的電子天平等，它們分別用于各種緩沖液的配制和標準物質的稱量等。分別用于各種緩沖液的配制和標準物質的稱量等。 液體體積度

18、量儀器：常用的有各種量筒、移液管、液體體積度量儀器：常用的有各種量筒、移液管、容量瓶、微量進樣器和各種自動取液器等。容量瓶、微量進樣器和各種自動取液器等。 酸堿度酸堿度pHpH測量儀器：最常用的是測量儀器：最常用的是pHpH試紙和試紙和pHpH計。計。 液體溶質定量儀器：此系統(tǒng)主要是根據液體溶質液體溶質定量儀器：此系統(tǒng)主要是根據液體溶質的某些理化特性而設計的，不同的物質在一定的條件下有的某些理化特性而設計的，不同的物質在一定的條件下有特定的吸收光譜，其吸收值的大小與其在溶液中的濃度有特定的吸收光譜，其吸收值的大小與其在溶液中的濃度有一定的關系，可以通過測定某物質在溶液中的吸收光譜來一定的關系，

19、可以通過測定某物質在溶液中的吸收光譜來計算出該物質的濃度，因而分光光度計就是生化實驗室必計算出該物質的濃度，因而分光光度計就是生化實驗室必備的儀器分析手段。主要有可見分光光度計和高檔的快速備的儀器分析手段。主要有可見分光光度計和高檔的快速掃描紫外可見分光光度計等。掃描紫外可見分光光度計等。 電泳裝置 電泳是生化實驗中最常用最重要的實驗技術之一，主要用于分析、鑒定，也可用于制備。電泳裝置由電源和電泳槽兩部分組成，詳見第4章。 層析系統(tǒng) 層析又稱為色譜，是分離各種生物大分子的主要手段之一，因而各種層析系統(tǒng)和核酸蛋白檢測器就是生化實驗室最常用的儀器設備。主要的層析技術有：吸附層析、凝膠排阻層析、離子

20、交換層析和親和層析等，詳見第3章。PCR儀 PCR(Polymerase Chain Reaction)是指聚合酶鏈式反應。該反應是用DNA聚合酶在體外大量擴增DNA片段的一種方法。PCR儀就是將此方法實現了自動化操作的一種儀器，是生化與分子生物學實驗常用和必備的設備。 其它設備其它設備 實驗室除以上常規(guī)設備和設施外，還必須裝備實驗室除以上常規(guī)設備和設施外，還必須裝備下列一些常用設備：下列一些常用設備：A.A.通風柜：用于有害和有毒氣體的操作。通風柜：用于有害和有毒氣體的操作。 B.B.微波爐：用于化凍、滅菌及其他一些需要快速加微波爐：用于化凍、滅菌及其他一些需要快速加熱的操作。熱的操作。C.

21、C.組織打碎機和勻漿器：用于各種生物材料、動植組織打碎機和勻漿器：用于各種生物材料、動植物組織和細胞的破碎。物組織和細胞的破碎。D.D.超聲清洗機：用于各種器皿、移液管和自動取液超聲清洗機：用于各種器皿、移液管和自動取液器吸頭的清洗和高效液相色譜儀所用流動相的脫氣器吸頭的清洗和高效液相色譜儀所用流動相的脫氣等。等。E.E.冰凍干燥機：用于生物大分子水溶液的冰凍干燥，冰凍干燥機：用于生物大分子水溶液的冰凍干燥，可由其水溶液直接制得固體干粉?？捎善渌芤褐苯又频霉腆w干粉。F.F.機械和水環(huán)式真空泵：用于旋轉蒸發(fā)器和各種真機械和水環(huán)式真空泵：用于旋轉蒸發(fā)器和各種真空抽氣操作?？粘闅獠僮?。G.G.旋轉

22、蒸發(fā)器：用于各種水溶液和有機溶液的旋轉旋轉蒸發(fā)器：用于各種水溶液和有機溶液的旋轉減壓蒸餾操作。減壓蒸餾操作。H.H.酶標儀：用于免疫化學實驗的酶聯(lián)免疫吸附測定。酶標儀：用于免疫化學實驗的酶聯(lián)免疫吸附測定。絕對誤差絕對誤差absolute errorabsolute error）：）： 絕對誤差是測量值與真實值之差。絕對誤差是測量值與真實值之差。 = x = x ( (：絕對誤差；：絕對誤差；x x：測量值；：測量值；：真實值）：真實值） 絕對誤差是以測量值的單位為單位，絕對誤差是以測量值的單位為單位，可以是正值，也可以是負值。測量值越接可以是正值，也可以是負值。測量值越接近真實值，絕對誤差越小

23、。近真實值，絕對誤差越小。 真實值是一個可以接近而不可達到的真實值是一個可以接近而不可達到的理論值。上式可以寫成：理論值。上式可以寫成： = x- = x- 說明在已知絕對誤差值的情況下，真說明在已知絕對誤差值的情況下，真實值可以從測定值減去絕對誤差而求得。實值可以從測定值減去絕對誤差而求得。相對誤差相對誤差relative error）：）： 為了反映誤差在測量結果中所占的比為了反映誤差在測量結果中所占的比例，分析工作中經常使用相對誤差。相對誤例，分析工作中經常使用相對誤差。相對誤差是以真實值的大小為基礎表示的誤差值，差是以真實值的大小為基礎表示的誤差值，沒有單位。沒有單位。 /=(x-)/

24、 通常以通常以%， 或或 ppm表示。表示。 例如：測定純例如：測定純NaCl中中Cl的百分含量為的百分含量為60.52%，而其真實含量理論值為，而其真實含量理論值為60.66%。那么。那么絕對誤差絕對誤差=60.52%60.66% = -0.14% 相對誤差相對誤差=（60.52% 60.66%） / 60.66% 1000 = -2.3 如果不知道真實值，而知道絕對誤差值，則相對誤差也可以表示為： 相對誤差 = 100% x 例如：用分析天平稱兩個重量，一個是0.0021g，另一個是0.5432g，兩個重量的絕對誤差都是0.0001g，可是相對誤差卻大不相同，一個是1/21 ）100%，另

25、一個是1/5432 ）100%。 可見，由于兩個被測組分含量高低不同，即使絕對誤差相同，相對誤差也不同。對高含量組分測定的相對誤差應當要求小些，低含量組分測定的相對誤差要求允許大些。 例如：用重量法和滴定法測量樣品主要成分，相對誤差需要達到千分之一，而用比色法測定樣品重微量成分時，相對誤差只要求達到百分之幾即可。2. 系統(tǒng)誤差系統(tǒng)誤差systematic error也叫“可定誤差”，是由某種確定的原因引起的，一般有固定的方向正或負和大小，重復測定時重復出現。根據系統(tǒng)誤差的來源，可分為： （1） 方法誤差 方法誤差是由于不適當的實驗設計或所選方法不恰當所引起的，通常影響較大。比如：滴定分析中終點

26、與化學計量點不相符合、重量分析中沉淀的溶解度過大或有共沉淀等，都會產生誤差。 （2） 儀器或試劑誤差 是由于儀器未經校準或試劑不合規(guī)格引起的。例 如：天平砝碼不準、容量儀器刻度不準或試劑不純等，均能產生這種誤差。（3） 操作誤差 操作誤差是由于分析者操作不符合要求引起的。 例如：分析者對滴定終點顏色改變的判斷能力不夠高，總是偏深或偏淺，便會產生誤差。 由于系統(tǒng)誤差是重復的以固定方向和大小出現，所以能用加校正值的方法加以消除，但不能用增加平行測定次數的方法消除。3.3.隨機誤差隨機誤差accidental error ):accidental error ): 也稱偶然誤差，是由于偶然的原因，如

27、測也稱偶然誤差，是由于偶然的原因，如測量條件、實驗室溫度、濕度等變動而未能得到量條件、實驗室溫度、濕度等變動而未能得到控制的條件波動引起的，其大小和正負都不固控制的條件波動引起的，其大小和正負都不固定。定。 偶然誤差的出現看起來似乎沒有規(guī)律，但偶然誤差的出現看起來似乎沒有規(guī)律，但多次測量就會發(fā)現絕對值相同的正負偶然誤差多次測量就會發(fā)現絕對值相同的正負偶然誤差出現的概率大致相等，它們之間能完全或部分出現的概率大致相等，它們之間能完全或部分抵消。因此通過增加平行測定次數，就可以減抵消。因此通過增加平行測定次數，就可以減免測定結果中這種誤差。也可以通過統(tǒng)計學方免測定結果中這種誤差。也可以通過統(tǒng)計學方

28、法估計出偶然誤差值，并在測定結果中予以正法估計出偶然誤差值，并在測定結果中予以正確表達。確表達。 系統(tǒng)誤差和偶然誤差往往不能區(qū)分。比如：系統(tǒng)誤差和偶然誤差往往不能區(qū)分。比如：在觀察滴定終點的顏色變化時，有人總是偏深，在觀察滴定終點的顏色變化時，有人總是偏深，產生系統(tǒng)誤差。但多次測定中偏深程度不一樣，產生系統(tǒng)誤差。但多次測定中偏深程度不一樣，又必然有偶然誤差。又必然有偶然誤差。4.4.準確度和精密度準確度和精密度 （1 1準確度準確度accuracyaccuracy）：）： 表示分析結果與真實值接近的程度。準確度的大小，用表示分析結果與真實值接近的程度。準確度的大小，用誤差表示。誤差越大，準確度

29、越低。誤差表示。誤差越大，準確度越低。 （2 2精密度精密度precisionprecision）：）： 表示平行測量的各測量值之間的相互接近程度表示平行測量的各測量值之間的相互接近程度, ,表示測表示測量的重現性。用以下幾個指標表示量的重現性。用以下幾個指標表示: : A. A.偏差偏差d = Xi - Xd = Xi - X平均平均 B. B.平均偏差：各個偏差絕對值的平均值平均偏差：各個偏差絕對值的平均值, ,即即 平均偏差平均偏差=偏向偏向/n/n C. C.相對平均偏差相對平均偏差 S= S=（平均偏差（平均偏差/ X/ X平均）平均） 100%100%。 D. D.標準偏差標準偏差

30、: :各個偏差的平方值和除以樣本個數各個偏差的平方值和除以樣本個數n n1 1，再，再開平方。即開平方。即 （S)= S)= 偏差偏差2/2/（n n1 1）1/2 1/2 E. E.相對標準偏差相對標準偏差 RSD = RSD =（標準偏差（標準偏差/ X/ X平均）平均） 100%100%。5.提高分析準確度的方法 （1選擇恰當的分析方法 不同方法的準確度和靈敏度不同。重量分析法和容量分析法靈敏度雖然不高，但對常量組分的測定可以獲得比較準確的結果，一般相對誤差不超過千分之幾。但對于微量和痕量組分的分析，常常做不出來，談不上精確度。 儀器分析法對測定常量組分無法準確，但對測定微量和痕量組分靈

31、敏度很高，盡管相對誤差較大，但絕對誤差不大，能符合準確度的要求。 總之，必須根據分析對象，樣品情況以及對分析結果的要求，選擇恰當的分析方法。 （2減小測量誤差 為了保證分析結果的準確度，必須盡量減小各步的測量誤差。 例如：一般分析天平的稱量誤差為+0.0001g，用減重法稱量兩次，可能引起的最大誤差是+0.0002g，為了使稱量的相對誤差小于0.1%，取樣量就不能小于0.2g。 （3消除測量中的系統(tǒng)誤差 A、校準儀器：對砝碼、滴定管和移液管進行校準。 B、做對照實驗：用含量已知的標準試樣或純物質當樣品進行分析，由分析結果和其已知含量的差值，確定分析的誤差。 C、做空白實驗：在不加樣品的情況下，

32、以與樣品相同的方法、步驟進行分析，把所得的結果作為空白值從樣品分析結果中減去。這樣可以消除由于試劑不純或容器不符合要求所帶進的誤差。 8.有效數字 有效數字是指分析工作中實際測到的數字，允許最后一個數字是可疑數，反映測量值的準確度，要與測量的方法相適應。 一般分析數據保留4位有效數字，保留的位數太多無實際意義，反而增加計算的麻煩。要注意0.0052的有效數字只有2位，3個0是用于定位的無效數字。 修約有效數字的原則是四舍六入五成雙。如23.4550.546修約為23.460.55， 28.4450.675修約為28.440.68，要避免出現0.000020.00001之類的數字，或3658.2

33、5430.0058之類的數字。五、生物化學常用緩沖液（一基本概念 Bronsted-Lowry酸堿理論酸堿質子理論）: 1923年由丹麥化學家J.N.Brnsted和英國化學家T.M.Lowry同時提出了酸堿質子學說，認為凡能釋放質子的分子或離子如：H2O，HCl，NH4+，HSO4- 等稱為酸，凡能接受質子的分子或離子如：H2O，NH3，Cl-等稱為堿。因此，一種酸釋放質子后即成為堿，稱為該酸的共軛堿，同樣一種堿與質子結合后，形成對應的酸，稱為該堿的共軛酸。 如鹽酸在水中的解離： HCl Cl- H+ HCl是酸，Cl-是它的共軛堿。 pH = pKa+log質子受體/質子供體 緩沖體系的設

34、計： 1960年，N.E.Good和他的同事們提出，適合生命科學研究使用的緩沖體系應具有以下特性： pKa值在6-8之間； 在水中的溶解度高； 不易穿透生物膜； 鹽效應??； 離子濃度、溶液組成和溫度對解離的影響??； 不與金屬離子生成復合物或沉淀； 該緩沖劑化學穩(wěn)定； 紫外和可見光波長范圍內光吸收??； 易制得高純度的鹽。（二生物化學常用緩沖液 磷酸鹽緩沖液： 磷酸鹽是生物化學研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級解離，有二個pKa值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬： NaH2PO4： pKa12.12， pKa27.21 Na2HPO4： pKa17.21， pKa212.32 配酸

35、性緩沖液： 用NaH2PO4，pH1-4， 配中性緩沖液： 用混合的兩種磷酸鹽，pH6-8， 配堿性緩沖液： 用Na2HPO4，pH10-12。 用鉀鹽比鈉鹽好，因為低溫時鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因為SDS十二烷基硫酸鈉會與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點為： 容易配制成各種濃度的緩沖液； 適用的pH范圍寬； pH受溫度的影響??； 緩沖液稀釋后pH變化小，如稀釋十倍后pH的變化小于0.1。其缺點為： 易與常見的鈣Ca+離子、鎂Mg+離子以及重金屬離子締合生成沉淀； 會抑制某些生物化學過程，如對某些酶的催化作用

36、會產生某種程度的抑制作用。 Tris三羥甲基氨基甲烷緩沖液： Tris緩沖液在生物化學研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用Tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。 Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性范圍，例如： Tris-HCl緩沖液： pH7.5-8.5 Tris-磷酸鹽緩沖液： pH5.0-9.0Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點是： 因為Tris的堿性較強，所以可以只用這一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液； 對生物化學過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。其缺點是： 緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖

37、液稀釋十倍，pH值的變化大于0.1； 溫度效應大，溫度變化對緩沖液pH值的影響很大，例如：4時緩沖液的pH8.4，而37時的pH7.4，所以一定要在使用溫度下進行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0-4。 易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴密封。 此緩沖液對某些pH電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。 有機酸緩沖液： 這一類緩沖液多數是用羧酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸性，即pH3.0-6.0，最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。 有機酸緩沖液的缺點是： 所有這些羧酸都是天然的代謝產物，因而對生化反應過程可能發(fā)生干擾作用； 檸檬酸鹽

38、和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子Fe3+、Zn+、Mg+等結合而使緩沖液受到干擾； 這類緩沖液易與Ca+離子結合，所以樣品中有Ca+離子時，不能用這類緩沖液。 硼酸鹽緩沖液： 常用的有效pH范圍是：pH8.5-10.0，因而它是堿性范圍內最常用的緩沖液，其優(yōu)點是配制方便，只使用一種試劑，缺點是能與很多代謝產物形成絡合物，尤其是能與糖類的羥基反應生成穩(wěn)定的復合物而使緩沖液受到干擾。 氨基酸緩沖液： 此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.0-11.0，例如最常用的有： 甘氨酸-HCl緩沖液：pH=2.0-5.0， 甘氨酸-NaOH緩沖液：pH=8.0-11.0， 甘氨酸-Tris緩沖液：pH=8.0-

39、11.0，（廣泛使用的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液）， 組氨酸緩沖液：pH=5.5-6.5， 此類緩沖體系的優(yōu)點是：為細胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。 其缺點是： 與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會干擾某些生物化學反應過程，如代謝過程等。 試劑的價格較高。 六、 pH值的測定 測定溶液pH值通常有兩種方法，最簡便但較粗略的方法是用pH試紙，分為廣泛和精密pH試紙兩種。 廣泛pH試紙的變色范圍是pH=1-14、9-14等，只能粗略確定溶液的pH值。 精密pH試紙，可以較精確地測定溶液的pH值，其變色范圍是2-3個pH單位，例如有pH=1.4-3.0、5.4-7.0、9.5-1

40、3.0等許多種，可根據待測溶液的酸、堿性選用某一范圍的試紙。 測定的方法是將試紙條剪成小塊，用鑷子夾一小塊試紙，用玻璃棒蘸少許溶液與試紙接觸，試紙變色后與色階板對照，估讀出所測pH值。切不可將試紙直接放入溶液中，以免污染樣品溶液。 第二節(jié) 紫外可見分光光度法一、基本原理一、基本原理（一Beer-Lambert 定律 當一束單色光通過溶液時，由于溶液吸收了一部分光能，光的強度就會減弱。設入射光的強度為I0，透過濃度為c，液層厚度為b的溶液后，透射光的強度I必定小于I0，隨濃度和厚度的增加，光被吸收的程度亦增加，透射光的強度則減小。透射光強度與入射光強度的比值，稱為透光度(transmittanc

41、e)，以T表示。實驗證明，當液層厚度b和溶液濃度c按算術級數增加時，透光度T按幾何級數減小，數學式為： A-lgTabc A：吸光度，又稱光密度“O.D”；T：透光度， TI / I。； a：吸光系數Lmol1cm1）； b：樣品光程cm），通常使用1.0cm 的吸收池，則b=1cm； c：樣品濃度mol/L）。 當a、c一定時，吸光度A與液層厚度b成正比，稱為朗伯定律(Lamberts law)。 當a、b一定時，吸光度A與溶液濃度c成正比，稱為比爾定律(Beers law)。 吸光度與液層厚度和溶液濃度的乘積成正比，稱為朗伯比爾定律，簡稱比爾定律，即光的吸收定律。其數學表達式為：A=abc

42、 式中的a為比例常數，稱吸光系數，有兩種表示方式： 1.摩爾吸光系數,是指在一定波長時，溶液濃度為1mol/L，厚度為1cm的吸光度，用或EM表示。 2.百分吸光系數或稱比吸光系數,是指在一定波長時，溶液濃度為1%(W/V)，厚度為1cm的 吸光度，用E1%1cm表示。 吸光系數兩種表示方式之間的關系是： = Mr/10 E1%1cm 摩爾吸光系數是物質對某波長的光的吸收能力的量度。越大，吸收光的能力越強，相應的分光度法測定的靈敏度就越高。值越大，說明電子躍遷的幾率大，通常 10-105：一般認為 104為強吸收；103-104 為較強吸收； 102 為弱吸收，此時分光光度法不靈敏。 因為通常

43、使用分光光度計可檢測出的最小吸光度A0.001, 所以，當b1cm, 105時，可檢測的溶液最小濃度是C10-8 mol/L。 的值很難直接測定，通常要先測出E1%1cm再按公式計算求得。 吸光度“A有一個重要性質是其具有加和性： 即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長下吸光度的算術和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎。 若溶液中各溶質的吸光系數相同，則各溶質吸光度的大小與溶質濃度成比例。 例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測定 260nm的吸光度為0.650，用同一吸收池測定純溶劑的吸光度為0.070，已知其摩爾吸光系數 = 8.2103 M-1cm，計算其摩爾濃度。 L

44、）。 AbC A（溶劑加樣品的吸光度）（溶劑的吸光度） A0.6500.0700.580 b1cm C=7.110-5 mol / L3. 影響吸光系數的因素 吸光系數的大小，取決于物質(溶質、溶劑)的本性和光的波長。 1.物質不同，則吸光系數不同。以吸光系數可作為物質的特性常數。在分光光度法中，常用摩爾吸光系數來衡量顯色反應的靈敏度，值越大，靈敏度越高。 2.溶劑不同，其吸光系數亦不同。所以在說明某一物質的吸光系數時，應注明溶劑。 3.光的波長不同，其吸光系數亦不同。如將不同波長的單色光依次通過被分析物質，分別測得吸光度，然后繪制吸光度波長曲線，稱為吸收曲線(absorption curve

45、)，又稱吸收光譜(absorption spectrum)。由吸收曲線可以看出物質的吸收特征。吸收曲線上有極大值 的部分，稱為吸收峰。吸收峰所對應的波長，稱為最大吸收波長，以符號max表示 ，這是物質定性的依據之一。物質的定量也常選擇在max處測定其吸光度，因為在此處測定的靈敏度最高。 4.單色光的純度也影響吸光系數。單色光越純，即經單色器分光后的波長范圍越窄，其吸光系數越大。嚴格說來，朗伯比爾定律只有當入射光是單色光時才完全適用，但實際上不管儀器中光學系統(tǒng)的質量怎樣高，單色化以后的光還是具有一定的寬度，這取決于儀器的精確程度。濾光片的分光本領較差，故一般測得的吸光系數要比真值小得多。 吸收池

46、使用注意事項： 要徹底清洗，尤其是盛過蛋白質等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時可放在 1洗潔凈液中浸泡，去污效果好，使用時用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可以用綢布絲線或軟塑料制作一個小刷子清洗杯子。 嚴禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。 嚴禁加熱烘烤。急用干的杯子時，可用酒精蕩洗后用冷風吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。4. 4. 檢測器檢測器: : 檢測器是一種光電轉換設備，即把光強度以電訊檢測器是一種光電轉換設備，即把光強度以電訊號顯示出來，常用的檢測器有光電管，光電倍增管和號顯示出來，常用的檢測器有光電管，光電倍增管和光電

47、二極管等三種。光電二極管等三種。 光電管：光電管可檢測光電管：光電管可檢測1010微微安微微安10-11A10-11A的的光電流，管內抽真空充入惰性氣體光電流，管內抽真空充入惰性氣體. . 光電倍增管：它是檢測弱光的最靈敏最常用的光電倍增管：它是檢測弱光的最靈敏最常用的光電元件，其靈敏度比光電管高光電元件，其靈敏度比光電管高200200多倍，光電子由多倍，光電子由陰極到陽極重復發(fā)射陰極到陽極重復發(fā)射9 9次以上，每一個光電子最后可次以上，每一個光電子最后可產生產生106-107106-107個電子，因此總放大倍數可達個電子，因此總放大倍數可達106-107106-107倍，倍，光電倍增管的響應

48、時間極短，能檢測光電倍增管的響應時間極短，能檢測10-8-10-910-8-10-9秒級秒級的脈沖光。其靈敏度與光電管一樣受到暗電流的限制，的脈沖光。其靈敏度與光電管一樣受到暗電流的限制，暗電流主要來自陰極發(fā)射的熱電子和電極間的漏電。暗電流主要來自陰極發(fā)射的熱電子和電極間的漏電。 光電二極管：其原理是這種硅二極管受紫外光電二極管：其原理是這種硅二極管受紫外- -近紅外輻射照射時，其導電性增強的大小與光強或正近紅外輻射照射時，其導電性增強的大小與光強或正比。近年來分光光度計使用光電二極管作檢測器在增比。近年來分光光度計使用光電二極管作檢測器在增加，雖然其靈敏度還趕不上光電倍增管，但它的穩(wěn)定加，雖

49、然其靈敏度還趕不上光電倍增管，但它的穩(wěn)定性更好，使用壽命更長，價格便宜，因而許多著名品性更好，使用壽命更長，價格便宜，因而許多著名品牌的高檔分光光度計都在使用它作檢測器。牌的高檔分光光度計都在使用它作檢測器。 5. 5. 顯示裝置顯示裝置: : 低檔分光光度計現在已都使用低檔分光光度計現在已都使用數字顯示，有的還連有打印機。現數字顯示，有的還連有打印機。現代高性能分光光度計均可以連接微代高性能分光光度計均可以連接微機，而且有的主機還使用帶液晶或機，而且有的主機還使用帶液晶或CRTCRT熒屏顯示的微處理機和打印繪圖熒屏顯示的微處理機和打印繪圖機，有的還帶有標準軟驅，存取數機，有的還帶有標準軟驅，

50、存取數據更加方便。據更加方便。三、分光光度法的定性與定量方法（一定性方法： 一系列不同波長的單色光照射待測溶液，可測的一系列相應的吸光度。以吸光度為縱坐標，以波長為橫坐標作圖，可以得到待測物質的吸收曲線。通過與標準品比較而定性。 實際工作中常用max 和來定性，max 可以從吸收曲線中吸收峰所對應的波長直接找出； 通常需配置待測物質三種不同濃度的溶液，在1cm的吸收池中，在max處分別測定其吸光度，根據A= bc,即=A/bc，計算出，將三次結果平均，即是該物質的摩爾吸光系數。從吸受光譜中初步推斷官能團： 一個化合物在220-800nm范圍內無吸收1），它可能是脂肪族飽和碳氫化合物、醇、醚、羧

51、酸、胺等，不含直鏈或環(huán)狀共軛體，沒有醛、酮等基團。在210-250nm有吸收帶，可能含量2個共軛單位250-300nm有弱吸收帶，表示有羰基存在。異構體的推定： 許多異構體可以利用雙鍵位置不同，通過紫外吸收光譜推斷異構體結構?；衔锕羌艿耐贫ǎ?未知化合物與已知化合物的紫外吸收光譜一致時，可以認定兩者具有同樣的發(fā)色團。通過這個原理可以推定未知化合物的骨架。（二定量方法： 根據比爾定律，物質在一定波長處的吸光度與濃度之間有線性關系。因此，只要選擇一定的波長測定溶液的吸光度，即可求出濃度。1.吸光系數法絕對法）： 根據比爾定律A= c l ，假設 l 和吸光系數或E1%1cm已知，即可根據測得的A

52、，求出被測物的濃度。 C = A / l 通?；駿1%1cm可以在手冊或文獻中查到。 示例見課本P10.2.標準曲線法: 在有些情況下，如單色光不純等情況，測得的吸光值隨所用儀器不同而有相當大的變化。若此時用吸光系數換算成濃度，將產生很大的誤差。 但如果只用一臺固定的儀器，則可認定在固定的工作狀態(tài)和測定條件下，濃度與吸光度之間的關系在許多情況下是線性關系或接近于線性關系。 A=KC(K只為比例常數，而非物質常數） 依據上式的關系進行定量是分光光度法中比較簡便易行的方法。標準曲線的制作（1配置一系列濃度不同的標準溶液。（2在測定條件相同的情況下，分別測定其吸光度。（3以標準溶液濃度為橫坐標不必考

53、慮顯色劑等引起的濃度變化），以相應的吸光度為縱坐標，繪制A-C關系圖。（4在相同條件下測出樣品溶液的吸光度，從標準曲線上查出濃度。AC0AxCx如如FolinFolin酚試劑法酚試劑法(Lowry(Lowry法法) )測定蛋白質含測定蛋白質含量量 取取1414只試管分成兩組，分別加入只試管分成兩組，分別加入0 0，0.10.1，0.20.2，0.40.4，0.60.6，0.80.8，1.0mL1.0mL標準蛋標準蛋白質溶液白質溶液(250 g/mL)(250 g/mL)，用水補足到，用水補足到1mL1mL，加入加入5mL5mL試劑甲，混勻，于試劑甲，混勻，于20-2520-25放置放置1010

54、分分鐘。再加入鐘。再加入0.5mL0.5mL試試 劑乙劑乙(Folin(Folin氏試劑氏試劑) )，立即振搖均勻，在立即振搖均勻，在20-2520-25保溫保溫3030分鐘，然分鐘，然后于后于500nm500nm處比色。取兩組測定的平均值，處比色。取兩組測定的平均值，以蛋白質濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標，以蛋白質濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線作為定量的依據繪制標準曲線作為定量的依據 。橫坐標的。橫坐標的蛋白質濃度分別為蛋白質濃度分別為0 0，2525，5050，100100，150150，200200，250250，單位為，單位為g/mLg/mL，不可將上述數字，不可將上述數

55、字再除以再除以6.56.5，將數字變成一個小數。，將數字變成一個小數。3.對照法: 在同樣條件下配置標準溶液和樣品溶液，在選定波長處，分別測量吸光度，根據定律 A標=E C標l A樣=E C樣l 在同種物質、同臺儀器及同一波長測定的條件下l 和E 均為定值，所以： A標/A樣 = C標/C樣 C樣 = C標（A樣/ A標）四、減小測定誤差的方法 1.選擇合適的顯色劑，使顯色反應的靈敏度高、選擇性好、顯色產物穩(wěn)定。 2.通過條件試驗，找出最佳的試劑加入量、酸度、溫度和顯色時間。并使樣品與標準品在盡可能完全相同的條件下進行測定。 3.通過加掩蔽劑和控制pH值，消除共存離子的干擾。 4.盡可能在吸光度0.1-1.0范圍內測定，以減小吸光度誤差。A1.0的溶液，可通過稀釋或用薄的吸收池來降低吸光度。 5.減小儀器誤差。用穩(wěn)壓器穩(wěn)定電源以使入射光強度保持不變；吸收池厚度應一致，透光性好，不要用手摸透光面；吸收池與入射光線應垂直，否則會因光程增大而發(fā)生誤差。 四.離心操作的注意事項 高速與超速離心機是生化實驗教學和生化科研的重要精密設備，因其轉速高，產生的離心力大，使用不當或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴重事故，因此使用離心機時都必須嚴格遵守操作規(guī)程。 超速冷凍離心機:未經過培訓和考核者不能使用。 其它普通離心機：按照操作要