細(xì)胞培養(yǎng)基本知識

1、細(xì)胞培養(yǎng)基本知識細(xì)胞培養(yǎng)基本知識根據(jù)中華人民共和國傳染病防治法實(shí)施辦法規(guī)定： 凡從事致病性微生物實(shí)驗(yàn)的科研、教學(xué)和生產(chǎn)單位，作為各類傳染病菌（毒）研究操作的基本單元，實(shí)驗(yàn)室必須有防止致病性微生物擴(kuò)散的制度和人體防護(hù)措施。 不同危害群的微生物必須在不同的物理性防護(hù)的條件下進(jìn)行操作，一方面防止實(shí)驗(yàn)人員和其他物品受到污染，同時也防止其釋放到環(huán)境中。傳染病原危害等級。第一級危害群微生物：與人類成人健康和疾病無關(guān)； （無或極低的個體和群體危險）不太可能引起人或動物致病的微生物第二級危害群微生物：在人類所引起的疾病很少是嚴(yán)重的，而且通常有預(yù)防及治療的方法； （個體危險中等，群體危險低） 實(shí)驗(yàn)室暴露也許會引

2、起嚴(yán)重感染，但對感染有有效的預(yù)防和治療措施，并且疾病傳播的危險有限。 第三級危害群微生物：在人類可以引起嚴(yán)重或致死的疾病，可能有預(yù)防和治療的方法；第四級危害群微生物：在人類可以引起嚴(yán)重或致死的疾病，通常無預(yù)防和治療的方法，如炭疽桿菌、霍亂弧菌、埃博拉病毒、天花病毒等。 隔離的設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計及實(shí)驗(yàn)實(shí)施等3個方面所組成. 根據(jù)其密封程度的不同，分為 P1、P2、P3和P4四個生物安全等級。 P是英文protect（保護(hù)）的縮寫。 四級生物安全（ P4）是生物安全實(shí)驗(yàn)室等級最高的實(shí)驗(yàn)室，可以有效阻止傳染性病原釋放到環(huán)境中，同時給研究人員提供生物安全的保證。實(shí)驗(yàn)室可分： 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室一級生物安全水平

3、、 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室二級生物安全水平、 防護(hù)實(shí)驗(yàn)室三級生物安全水平 最高防護(hù)實(shí)驗(yàn)室四級生物安全水平。 根據(jù)操作不同危險度 ，等級微生物所需的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計特點(diǎn)、建筑構(gòu)造、防護(hù)設(shè)施、儀器、操作以及操作程序來決定實(shí)驗(yàn)室的生物安全水平。有關(guān)的手冊有敘述： 與不同危險度等級相對應(yīng)的（而非“等同的”）各危險度等級微生物所要求的實(shí)驗(yàn)室生物安全水平。 生物安全實(shí)驗(yàn)室（生物安全實(shí)驗(yàn)室（P1、P2、P3、P4） 2 級 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室二 級生物安全水平 初級衛(wèi)生服務(wù)； 診斷、研究 GMT 加防護(hù)服、生物危 害標(biāo)志 開放實(shí)驗(yàn)臺，此外需 BSC 用于防護(hù)可能生 成的氣溶膠3 級 防護(hù)實(shí)驗(yàn)室三 級生物安全水平特殊的診斷、研 究 ，

4、在二級生物安全防護(hù)水平上增加特殊防護(hù)服、 進(jìn)入制度、定向氣流BSC 和或其他所有實(shí)驗(yàn)室工作所需要的基本設(shè)備 4 級 最高防護(hù)實(shí)驗(yàn)室四級生物安全水平 危險病原體研究在三級生物安全防護(hù)水平上增加氣鎖入口、出 口淋浴、污染物品的特殊處理 級BSC 或級BSC。穿著正壓服、雙開門高壓滅菌器（穿過墻體）、經(jīng)過濾的空氣。 BSC ：生物安全柜；GMT ：微生物學(xué)操作技術(shù)規(guī)范我國在生物安全方面也制定過一些相應(yīng)的條例和法規(guī)。中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（ WS2332002）微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則中對生物安全三級（ P3）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了規(guī)定。每個實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)該采用“安全手冊”或“操作手冊”，其中定義了

5、已知的和潛在的危害，并規(guī)定了特殊的操作程序來避免或盡量減小這種危害。規(guī)范的微生物學(xué)操作技術(shù)是實(shí)驗(yàn)室安全的基礎(chǔ)，而專門的實(shí)驗(yàn)設(shè)備僅僅是一種補(bǔ)充，絕不能替代正確的操作規(guī)范。 在一級生物安全水平操作的微生物不太可能引起人類疾病或獸醫(yī)學(xué)意義的動 物疾病。但理想的做法是，所有實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)進(jìn)行上崗前的體檢，并記錄其病史。疾病和實(shí) 驗(yàn)室意外事故應(yīng)迅速報告，所有工作人員都應(yīng)意識到應(yīng)用規(guī)范的實(shí)驗(yàn)室操作技術(shù)的重要性。 在二級生物安全水平操作微生物的實(shí)驗(yàn)室工作人員 1 、必須有錄用前或上崗前的體檢。記錄個人病史，并進(jìn)行一次有目的的職業(yè)健康評估。 2 、實(shí)驗(yàn)室管理人員要保存工作人員的疾病和缺勤記錄。 3 、育齡期

6、婦女應(yīng)知道某些微生物（如風(fēng)疹病毒）的職業(yè)暴露對未出生孩子的危害。培訓(xùn) 人為的失誤和不規(guī)范的操作會影響所采取的安全措施對實(shí)驗(yàn)室人員的防人為的失誤和不規(guī)范的操作會影響所采取的安全措施對實(shí)驗(yàn)室人員的防護(hù)效果。因此，熟悉如何識別與控制實(shí)驗(yàn)室危害的、有安全意識的工作人護(hù)效果。因此，熟悉如何識別與控制實(shí)驗(yàn)室危害的、有安全意識的工作人員，是預(yù)防實(shí)驗(yàn)室感染、差錯和事故的關(guān)員，是預(yù)防實(shí)驗(yàn)室感染、差錯和事故的關(guān) 鍵。鍵。 管理者應(yīng)確保將安全的實(shí)驗(yàn)室操作及程序融合到工作人員的基本培訓(xùn)中。管理者應(yīng)確保將安全的實(shí)驗(yàn)室操作及程序融合到工作人員的基本培訓(xùn)中。所有實(shí)驗(yàn)室工作人員都會經(jīng)常遇到的高危操作，包括：所有實(shí)驗(yàn)室工作人員

7、都會經(jīng)常遇到的高危操作，包括： 1 、吸入危險（氣溶膠產(chǎn)物），如使用接種環(huán)、劃線接種瓊脂平板、移液、吸入危險（氣溶膠產(chǎn)物），如使用接種環(huán)、劃線接種瓊脂平板、移液、制作涂片、打開培養(yǎng)物、采集血液血清標(biāo)本、離心等制作涂片、打開培養(yǎng)物、采集血液血清標(biāo)本、離心等 2 、食入危險，如處理標(biāo)本、涂片以及培養(yǎng)物、食入危險，如處理標(biāo)本、涂片以及培養(yǎng)物 3 、在使用注射器和針頭時刺傷皮膚的危險、在使用注射器和針頭時刺傷皮膚的危險 4 、處理動物時被咬傷、抓傷、處理動物時被咬傷、抓傷 5 、處理血液以及其他有潛在病理學(xué)危害的材料、處理血液以及其他有潛在病理學(xué)危害的材料 6 、感染性材料的清除污染和處理。、感染性材

8、料的清除污染和處理。 典型的二級生物安全水平實(shí)驗(yàn)室 門保持關(guān)閉并貼上適當(dāng)?shù)奈ｋU標(biāo)志。潛在被污染的廢棄物同普通廢棄物隔開。 基本生物安全設(shè)備 1 、移液輔助器避免用口吸的方式移液 2 、生物安全柜，在以下情況使用： 處理感染性物質(zhì)；如果使用密封的安全離心杯，并在生物安全柜內(nèi)裝樣、取樣，則 這類材料可在開放實(shí)驗(yàn)室離心 空氣傳播感染的危險增大時 進(jìn)行極有可能產(chǎn)生氣溶膠的操作時（包括離心、研磨、混勻、劇烈搖動、超聲破碎、打開內(nèi)部壓力和周圍環(huán)境壓力不同的盛放有感染性物質(zhì)的容器、動物鼻腔接種以及從動物或卵胚采集感染性組織）。 3 、一次性塑料接種環(huán)，也可在生物安全柜內(nèi)使用電加熱接種環(huán)，以減少生成氣溶膠。

9、4 、螺口蓋試管及瓶子。 5 、用于清除感染性材料污染的高壓滅菌器或其他適當(dāng)工具。 6 、一次性巴斯德塑料移液管，盡量避免使用玻璃制品。 7 、在投入使用前，像高壓滅菌器和生物安全柜等設(shè)備必須用正確方法進(jìn)行驗(yàn)收。應(yīng)參照生產(chǎn)商的說明書定期檢測。 廢棄物處理 首要原則：所有感染性材料必須在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)清除污染、高壓滅菌或焚燒。 用以處理潛在感染性微生物或動物組織的所有的實(shí)驗(yàn)室物品，在被丟棄前應(yīng)考慮的主要問題有： 1 、是否已采取規(guī)定程序?qū)@些物品進(jìn)行了有效的清除污染或消毒？ 2 、丟棄已清除污染的物品時，是否會對直接參與丟棄的人員，或在設(shè)施外可能接觸到丟棄物的人員造成任何潛在的生物學(xué)或其他方面的危害？

10、 3.清除污染 高壓蒸汽滅菌是清除污染時的首選方法。需要清除污染并丟棄的物品應(yīng)裝在容器中。任何高壓滅菌后重復(fù)使用的污染（有潛在感染性）材料不應(yīng)事先清洗，任何必要的清洗、修復(fù)必須在高壓滅菌或消毒后進(jìn)行。 也可采用其他除去或殺滅微生物的替代方法 4.污染性材料和廢棄物的處理和丟棄程序 要對感染性物質(zhì)及其包裝物進(jìn)行鑒別并分別進(jìn)行處理，相關(guān)工作要遵守國家和國際規(guī)定。合適的環(huán)境和必需的條件合適的環(huán)境和必需的條件1營養(yǎng)需要營養(yǎng)需要2環(huán)環(huán) 境境 要要 求求3無毒及無污染無毒及無污染無無 毒：毒：無毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件。凡與 細(xì)胞直接或間接接觸的東西都必須 是無毒的。無無微生物的污染不同細(xì)胞類型的交叉污染細(xì)

11、菌細(xì)菌霉菌霉菌支原體支原體等等實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品：實(shí)驗(yàn)用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管日本三洋CO2培養(yǎng)箱倒置像差生物顯微鏡超凈工作臺自動雙重純水蒸餾器 純水儀濾 器酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器培 養(yǎng) 板 及瓶 浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、流水沖浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、流水沖洗、洗、 60烘干、酸泡（烘干、酸泡（24小時）、流水沖洗、小時）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、60烘干烘干細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇選擇培養(yǎng)基沒有

12、一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考：選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考： (1 (1 ）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時咨詢?；??？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時咨詢。 (2) (2) 其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。細(xì)胞。 (3) (3) 根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選多選 RPMI1640 RPMI1640

13、 。 (4) (4) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。最客觀的方法，但比較繁瑣。 制備1000mlRPMI 1640培養(yǎng)基 RPMI 1640 干粉培養(yǎng)基10.4g（1包） 蒸餾水 400ml 磁力攪拌至完全溶解 加三蒸餾水定容至1000ml 在超凈臺內(nèi)無菌條件下，用滅菌后的并置有0.22m孔徑濾膜的過濾器除菌，并分裝成200ml/瓶，-20保存?zhèn)溆谩?用前取一瓶溶解，每200m

14、l培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。再加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。 - 細(xì)胞培養(yǎng)液： 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。從而使細(xì)胞分離。 胰蛋白酶液濃度胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會損傷細(xì)胞。定限度會損傷細(xì)胞。 胰蛋白酶液消化時間：胰蛋白酶液消化時間：2-102-10分鐘。分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用 血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)

15、成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘血清的消毒：過濾除菌一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性無毒性主要作用主要作用: :防止培養(yǎng)基防止培養(yǎng)基pHpH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO25%CO2的環(huán)境，的環(huán)境，CO2CO2氣體氣體迅速逸出，迅速逸出，pHpH迅速升高，若加了迅速升高，若加了HEPESHEPES，此時可以維持，此時可以維持pH7.0pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時要添加左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPESHEPESmmol