細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義

1、目 錄前 言1實(shí)驗(yàn)一 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察及大小測(cè)定2實(shí)驗(yàn)二 動(dòng)物細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)4實(shí)驗(yàn)三 DNA的細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)Feulgen反應(yīng)5實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞有絲分裂各期觀察8實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞凝集反應(yīng)12實(shí)驗(yàn)六 細(xì)胞膜的滲透性14實(shí)驗(yàn)七 小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象的觀察16實(shí)驗(yàn)八 線粒體和液泡系的超活染色與觀察18實(shí)驗(yàn)九 細(xì)胞核與線粒體的分離與觀察21實(shí)驗(yàn)十 外來(lái)化合物的毒性測(cè)定25附一 離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)與離心力的換算表28前 言細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)目的，主要是通過(guò)基本技能訓(xùn)練以及觀察分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使學(xué)生了解并掌握有關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理和操作方法，進(jìn)而培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手實(shí)踐、觀察分析和解決問(wèn)題的能力。為達(dá)到此目的，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容自成體

2、系，著眼于加強(qiáng)學(xué)生的基末技能訓(xùn)練，以及觀察分析問(wèn)題和科學(xué)思維能力的培養(yǎng)。 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)繪圖方法與要求一、在仔細(xì)觀察的基礎(chǔ)上，選擇典型結(jié)構(gòu)進(jìn)行描繪，要求真實(shí)、準(zhǔn)確(注意各部結(jié)構(gòu)的比例關(guān)系)。二、用鉛筆繪圖，線條要明確清晰，圖的深淺明暗一律以點(diǎn)的疏密來(lái)表示，點(diǎn)要圓而一致，不得涂暗影或進(jìn)行其它美術(shù)加工。 三、各部結(jié)構(gòu)名稱要在一側(cè)引直線注明。各引線要平行不得交叉。四、每幅圖的大小、位置在紙面上必須安排得當(dāng)并注意紙面的整潔。實(shí)驗(yàn)室規(guī)則一、遵守實(shí)驗(yàn)紀(jì)律，按時(shí)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，不得遲到或早退。實(shí)驗(yàn)中途因故需外出時(shí)應(yīng)向任課教師請(qǐng)假。二、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室之前要換好白大衣。三、保持實(shí)驗(yàn)室安靜，不許在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大聲喧嘩及隨意走

3、動(dòng)。四、必須嚴(yán)肅認(rèn)真地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間不得進(jìn)行任何與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的活動(dòng)。五、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各組儀器及器材由各組自已使用，不得互相調(diào)換。要愛護(hù)儀器、標(biāo)本和設(shè)備。如遇儀器損壞或不靈，應(yīng)及時(shí)報(bào)告任課教師，以便修理或更換，不要自行亂修。損壞器材或設(shè)備者應(yīng)按有關(guān)規(guī)定進(jìn)行賠償。六、注意節(jié)約實(shí)驗(yàn)材料、藥品和水、電等。七、保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)清潔整齊。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組必須認(rèn)真清理各自的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，將器材清洗后點(diǎn)清數(shù)目，然后擺放整齊。班級(jí)值日生負(fù)責(zé)清掃室內(nèi)衛(wèi)生，關(guān)好水、電開關(guān)和門、窗等，經(jīng)教師允許后方可離開實(shí)驗(yàn)室。 八、有不遵守上述要求者，任課老師將終止其實(shí)驗(yàn)，并取消其當(dāng)堂實(shí)驗(yàn)成績(jī)。實(shí)驗(yàn)一 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察及大小測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

4、的：1、觀察幾種細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及植物細(xì)胞的胞間連絲。2、掌屋用測(cè)微尺測(cè)定細(xì)胞大小的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：測(cè)微尺分物鏡測(cè)微尺（簡(jiǎn)稱物微尺或臺(tái)微尺）和目鏡測(cè)微尺（簡(jiǎn)稱目微尺），兩者配合使用，可以測(cè)量細(xì)胞大小。目微尺是一個(gè)可以放在目鏡內(nèi)的特制玻璃圓片，圓片中央刻有一條直線，此線分為若干格。物微尺為一載玻片中央封固的小尺，長(zhǎng)1mm，被等分為100格，長(zhǎng)為0.01mm(10m)。當(dāng)測(cè)量細(xì)胞大小時(shí)，不能用物微尺直接測(cè)量細(xì)胞，而只能使用目微尺。因目微尺測(cè)量的細(xì)胞是經(jīng)物鏡放大后的像，而它每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度隨物鏡的放大率而變，在測(cè)量時(shí)需要先用物微尺來(lái)標(biāo)定，求出某一放大率時(shí)目微尺每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度，然后再

5、用以測(cè)定細(xì)胞大小。將物微尺放在顯微鏡的載物臺(tái)上，小心轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺，移動(dòng)物微尺使兩尺平行，起點(diǎn)線重合，然后找出另一處兩尺刻度重合處，記錄起點(diǎn)線到重合線之間的各尺的刻度數(shù)（格數(shù)），按下式計(jì)算，在該放大系統(tǒng)下目微尺每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度： 物微尺格數(shù)目微尺每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度 = × 10m 目微尺格數(shù) 例如：目微尺是100格，其對(duì)應(yīng)的物微尺是80格，則目微尺每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度為80/100×10=8m。測(cè)量某一細(xì)胞時(shí)，如果目微尺測(cè)得其橫徑為5格，則此細(xì)胞橫徑為8×5=40m。三、實(shí)驗(yàn)用品：普通光學(xué)顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、消毒牙簽、燒杯、吸管、0.9%生理鹽水、

6、0.1%亞甲基蘭、蒸餾水、吸水紙。四、實(shí)驗(yàn)材料：口腔黏膜上皮細(xì)胞；洋蔥內(nèi)表皮；西紅柿；芹菜；韭菜；紅辣椒。五、方法步驟：（一）、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察：1、涂片法：人口腔上皮細(xì)胞的觀察：1）、在潔凈的載玻片中央，滴一滴生理鹽水。2）、用消毒牙簽的一端，在漱凈的口腔側(cè)壁上輕輕地刮幾下。3）、把牙簽上附有碎屑的一端，放在載玻片上的生理鹽水滴中涂勻。4）、用鑷子夾起潔凈的蓋玻片，將它的一邊先接觸載玻片上的生理鹽水滴，然后，輕輕地蓋在水滴上。然后在蓋片的一側(cè)加一滴0.1%亞甲基蘭染液，在蓋片的另一側(cè)用吸水紙吸取，染色后細(xì)胞核被染成深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)淺藍(lán)色。5）、用顯微鏡觀察細(xì)胞形狀，細(xì)胞呈扁平鱗狀。2、西紅柿

7、果肉細(xì)胞涂片制作似人口腔上皮細(xì)胞，但將生理鹽水換成蒸餾水，且不必染色就可直接觀察。細(xì)胞大小和形狀如何？ 3、撕片法：撕一小片植物表皮（洋蔥、芹菜和韭菜），放在盛有一小滴蒸餾水的載玻片上，用鑷子展平，蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察。細(xì)胞大小和形狀如何？4、取紅辣椒一片，用刀片刮去果肉，將表皮制成臨時(shí)裝片，用顯微鏡觀察表皮細(xì)胞，能看見胞間連絲嗎？（二）、細(xì)胞大小的測(cè)定：1、將目微尺放于目鏡內(nèi)。2、將物微尺放在顯微鏡的載物臺(tái)上。3、小心轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺，移動(dòng)物微尺使兩尺平行，起點(diǎn)線重合，然后找出另一處兩尺刻度重合處。4、記錄起點(diǎn)線到重合線之間的各尺的刻度數(shù)（格數(shù)），按下式計(jì)算，在該放大系統(tǒng)下目微尺每格所代表

8、的實(shí)際長(zhǎng)度：目微尺每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度 = 物微尺格數(shù)/目微尺格數(shù) × 10M5、將制作的各種細(xì)胞臨時(shí)裝片置于載物臺(tái)上，測(cè)定細(xì)胞的大?。òㄩL(zhǎng)徑和短徑）。六、注意事項(xiàng)：1、制作臨時(shí)裝片時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。2、用物微尺標(biāo)定的目微尺每格長(zhǎng)度的數(shù)值代表在某一放大系統(tǒng)下的情況，這一數(shù)值會(huì)隨物鏡的放大率而改變，因此，在什么放大倍數(shù)物鏡下標(biāo)定的目微尺只能在同一放大倍數(shù)的物鏡下測(cè)定細(xì)胞的大小。七、作業(yè)：繪出你所觀察到的人口腔上皮細(xì)胞、洋蔥表皮細(xì)胞和芹菜和西紅柿果肉細(xì)胞（或紅辣椒、韭菜、韭菜表皮細(xì)胞）圖，指出各部分的名稱。實(shí)驗(yàn)二 動(dòng)物細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、判斷和識(shí)別光鏡下四種不同組織動(dòng)物細(xì)胞的

9、形態(tài)結(jié)構(gòu)及大小。2、掌握動(dòng)物細(xì)胞與植物細(xì)胞的區(qū)別。二、實(shí)驗(yàn)材料：1、人血涂片觀察。2、疏松結(jié)締組織永久制片觀察。 3、骨骼肌細(xì)胞縱橫切永久制片觀察。 4、心臟切片觀察。 5、平滑肌縱橫切永久制片觀察。6、脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元觀察。三、作業(yè)：1、繪制人血涂片中各種血細(xì)胞圖（×40光鏡下），指出各細(xì)胞的的名稱。2、繪制脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞圖（×40光鏡下），指出各部分的名稱。實(shí)驗(yàn)三 DNA的細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)Feulgen反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解Feulgen反應(yīng)的基本原理。2、熟悉傳統(tǒng)細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本實(shí)驗(yàn)技能和操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：Feulgen反應(yīng)是1924年由Feulge

10、n和Rossenbeck開創(chuàng)的。這一反應(yīng)的原理是：DNA經(jīng)酸（1mol/LHCL）水解，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的鍵打開，使脫氧核糖的一端形成游離的醛基，這些醛基在原位與Schiff試劑（無(wú)色品紅亞硫酸溶液）反應(yīng)，形成紫紅色的化合物，使細(xì)胞內(nèi)含有DNA的部位呈紫紅色陽(yáng)性反應(yīng)。所以，凡有DNA的部位，會(huì)呈現(xiàn)紫紅色陽(yáng)性反應(yīng)，可以作為定性研究DNA的一種簡(jiǎn)便方法。紫紅色的產(chǎn)生，是由于反應(yīng)產(chǎn)物的分子內(nèi)含有醌基，醌基是一個(gè)發(fā)色團(tuán)，所以具有顏色。對(duì)照組預(yù)先用熱三氯醋酸或DNA酶處理，抽提去細(xì)胞中的DNA而得到陰性反應(yīng)，從而證明了Feulgen反應(yīng)的專一性。三、實(shí)驗(yàn)用品：（一）藥品：1、Carnoy固定液

11、：3份95%酒精加入1份冰醋酸，混合即可。2、1mol/LHCL：準(zhǔn)確量取82.5ml濃鹽酸（比重1.18）加蒸餾水到1000ml即可(應(yīng)將鹽酸緩緩加入水中)。3、Schiff試劑：稱1g堿性品紅于200ml煮沸的重蒸餾水中，5分鐘后斷電使其冷卻至5550，過(guò)濾到一個(gè)棕色的試劑瓶中，加入1mol/L HCl 20ml，繼續(xù)冷卻至25，加入1g偏亞硫酸氫鈉，搖動(dòng)瓶子使其溶解。密閉瓶口，置黑暗低溫處或冰箱內(nèi)（4左右），1824小時(shí)后檢查，試劑如透明無(wú)色或呈淺黃色時(shí)即可使用，這就是Schiff試劑溶液。如有不同程度的紅色未褪，可加入1g活性炭，強(qiáng)烈震蕩一分鐘，仍在低溫下靜置過(guò)夜，

12、然后用濾紙過(guò)濾后使用。密封瓶口，包以黑紙，在5以下冰箱內(nèi)可以保存半年。 4、亞硫酸水溶液 (漂白液)：在200ml蒸餾水中，加入10ml 1N HCl 和10ml  10%偏亞硫酸氫鈉水溶液（或1.0g固體）。此液在臨用前配制。 否則會(huì)因SO2的的逸出而失效。5、5%三氯乙酸。6、0.5%固綠酒精溶液（95%的酒精溶解）。7、45%醋酸。（二）用具：顯微鏡、恒溫水浴鍋、溫度計(jì)、鑷子、解剖針、刀片、 剪刀、冰箱、溫箱、天平、載玻片、蓋玻片、吸水紙、鏡頭紙、青霉素小瓶、吸管、燒杯、量筒。 四、實(shí)驗(yàn)材料：Carnoy液固定的大蒜根尖。五、方法步驟：1

13、、材料準(zhǔn)備：取大蒜若干頭，剝皮后置于盛有水的培養(yǎng)皿內(nèi)使其長(zhǎng)出新根。待根尖長(zhǎng)1cm時(shí)，剪下根尖固定在Carnoy固定液內(nèi)24小時(shí)以上備用，固定時(shí)以冰箱中進(jìn)行為宜。2、水解：實(shí)驗(yàn)時(shí)，從冰箱取出預(yù)先準(zhǔn)備好的大蒜根尖，分裝到若干個(gè)青霉素瓶中，用自來(lái)水洗3次，蒸餾水水洗3次，換1mol/L HCl洗一次，傾去，換入預(yù)熱60的1mol/L HCl 3ml，放入恒溫水浴鍋中在60±0.5下水解8-15分鐘（視材料而定，水解時(shí)間可以從8分鐘延長(zhǎng)至30分鐘）。然后吸去熱1mol/L HCl，換入冷1mol/L HCl洗1次，再用蒸餾水將根尖洗3次。 水解是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一。重要

14、的是溫度，應(yīng)保持在60±0.5之間。如果溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成水解過(guò)度，醣與醛基之間的鍵被破壞，醛基流失到水解液中；反之，不能出現(xiàn)潛在的醛基，都不能呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。 3、染色：吸凈水分，加入Schiff試劑避光染色40min60min，用漂洗液漂洗23次，每次5min,然后經(jīng)自來(lái)水流水沖洗，再用蒸餾水洗2次后準(zhǔn)備壓片。 4、壓片法：取一根尖置于載玻片上，用刀片切下生長(zhǎng)區(qū)部位（染成紫紅色），加一滴0.1%亮綠水溶液對(duì)染一分鐘，吸去亮綠液，加一滴清水或45%醋酸水溶液，加蓋玻片，用拇指輕壓使細(xì)胞分散均勻，鏡檢。 5、對(duì)照組預(yù)先用5%三氯醋酸（90）處理15min，然后再依次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)步驟（

15、二）、（三）、（四）。六、注意事項(xiàng)：1、Feulgen反應(yīng)的染色深淺與材料、水解時(shí)的溫度和時(shí)間都有關(guān)系。水解時(shí)間的長(zhǎng)短要根據(jù)固定液和材料來(lái)進(jìn)行選擇，時(shí)間太短則游離的醛基量少而染色不深，時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)因醛基進(jìn)一步變成其它物質(zhì)，染色也不深。水解時(shí)的溫度要嚴(yán)格控制。2、未經(jīng)水解的對(duì)照切片在schiff試劑中最多不要超過(guò)1 h (40分鐘即可)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，試劑本身的酸性也會(huì)使DNA水解，從而出現(xiàn)假的正反應(yīng)。 3、Schiff試劑的作用：Feulgen反應(yīng)成功與否的一個(gè)非常關(guān)鍵的因素，就是schiff試劑的質(zhì)量。有一大類試劑均稱為堿性品紅，它們實(shí)際上是由幾種產(chǎn)品分別組成的。因此只能選用注明“DNA染色反應(yīng)用

16、”的堿性品紅才行。此外，Schiff試劑的配制方法也可影響DNA的染色反應(yīng)。 4、漂白液的重要性：漂洗時(shí)，所用的亞硫酸水，最好在每次實(shí)驗(yàn)前臨時(shí)配制，以便保持較濃的SO2。 5、操作過(guò)程中，用鑷子鑷取根尖的生長(zhǎng)區(qū)部位，切勿夾取根冠部位。 七、作業(yè)：1、簡(jiǎn)述Feulgen 反應(yīng)的染色原理。2、繪圖表示Feulgen反應(yīng)的染色結(jié)果, 并驗(yàn)交Feulgen反應(yīng)的壓片1張。實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞有絲分裂各期觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握細(xì)胞分裂各期的主要特點(diǎn)。 2、掌握動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞在細(xì)胞分裂過(guò)程中的區(qū)別。二、實(shí)驗(yàn)原理：有絲分裂，又稱為間接分裂，由W. Fleming (1882)年首次發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物及E. Stra

17、sburger（1880）年發(fā)現(xiàn)于植物。特點(diǎn)是有紡錘體染色體出現(xiàn)，染色體被平均分配到子細(xì)胞，這種分裂方式普遍見于高等動(dòng)植物(動(dòng)物和低等植物)。細(xì)胞有絲分裂過(guò)程可分為細(xì)胞核分裂和細(xì)胞質(zhì)分裂，細(xì)胞核分裂可分為：前期，中期，后期，和末期不同時(shí)期的染色體的形態(tài)和行為是各不相同的。前期：染色質(zhì)絲高度螺旋化成染色體，紡錘體出現(xiàn)，細(xì)胞核分解，核仁消失。中期：染色體排列在細(xì)胞中心赤道板位置，其著絲點(diǎn)與紡錘絲相接。后期：染色體分裂成染色單體，每一條向不同方向的細(xì)胞兩極移動(dòng)。末期：染色體到達(dá)兩極后解螺旋形成染色質(zhì)絲，紡錘體消失，核膜、核仁重建。  在細(xì)胞核分裂進(jìn)入后期以后，細(xì)胞質(zhì)開始分裂，從而

18、將一個(gè)細(xì)胞分裂成兩個(gè)子細(xì)胞。三、實(shí)驗(yàn)材料：1、自制大蒜根尖壓片3-4片。2、洋蔥根尖縱切永久制片。3、馬蛔蟲卵切片永久制片。馬蛔蟲受精卵細(xì)胞中只有2-6條染色體，而大蒜和洋蔥體細(xì)胞的染色體為16條，因?yàn)樗鼈兌季哂腥旧w數(shù)目少的特點(diǎn)，所以便于觀察和分析。四、有絲分裂各期觀察：1、自制大蒜根尖壓片的觀察首先在低倍鏡下，區(qū)分根尖的分生組織區(qū)及延長(zhǎng)組織區(qū)的細(xì)胞，然后，在高倍鏡下，觀察細(xì)胞核的形態(tài)，注意在你的片子上，是否有有絲分裂細(xì)胞，如有，你能找到細(xì)胞分裂期的幾個(gè)階段，其特征如何？ 植物細(xì)胞分裂的幾個(gè)時(shí)期。細(xì)胞周期分為間期及分裂期，按照有無(wú)核膜，核仁、染色體，以及染色體形態(tài)與分布位置的變化，細(xì)胞有絲分

19、裂又分為前期、中期、后期和末期四個(gè)階段?，F(xiàn)將各期特點(diǎn)簡(jiǎn)述如下， （1）前期：此期的染色質(zhì)螺旋盤繞成一定數(shù)目的細(xì)而長(zhǎng)的染色絲，此即染色體。染色體先是分散于核液中，以后，逐漸向核膜移動(dòng)，在此時(shí)，核仁逐漸消失，核膜溶解。 （2）中期：染色體進(jìn)一步盤繞，變短變粗，在細(xì)胞的中央（即赤道板）規(guī)則地排列成行，仔細(xì)觀察，可看到染色體兩側(cè)的紡錘絲。  （3）后期：姊妹染色體分別向細(xì)胞兩極移動(dòng)，染色體達(dá)到兩極時(shí)染色體緊縮成團(tuán)，染色體的輪廓逐漸變得不清楚，細(xì)胞質(zhì)中間部位（細(xì)胞的赤道板）形成細(xì)胞板。 （4）末期：盤繞變粗的染色體又伸展開，此時(shí)，核仁、核膜又重新出現(xiàn)。 此外，間期細(xì)胞的細(xì)胞核有下述特點(diǎn)：核膜清

20、楚，核內(nèi)結(jié)構(gòu)均勻，除異染色質(zhì)外，可見12個(gè)著色較深的核仁。而在進(jìn)入細(xì)胞分裂期的細(xì)胞核，一般均大于間期細(xì)胞核。2、洋蔥根尖縱切永久制片觀察（同大蒜根尖）將洋蔥根尖切片標(biāo)本先在低倍鏡下觀察，尋找生長(zhǎng)區(qū)，這部分的細(xì)胞分裂旺盛，大多處于分裂狀態(tài)，細(xì)胞形狀呈方形。換高倍鏡仔細(xì)觀察不同分裂時(shí)期的細(xì)胞形態(tài)特征與動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂特征比較，找出植物細(xì)胞有絲分裂的特點(diǎn)和兩者的區(qū)別。3、動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂的觀察馬蛔蟲子宮切片（馬蛔蟲受精卵切片永久制片觀察）取馬蛔蟲的子宮切片標(biāo)本，先在低倍鏡下觀察，可見馬蛔蟲子宮腔內(nèi)有許多橢圓形的受精卵細(xì)胞，它們均處在不同的細(xì)胞時(shí)相。每個(gè)卵細(xì)胞都包在卵殼之中，卵殼與卵細(xì)胞之間的腔，叫卵

21、殼腔。細(xì)胞膜的外面或卵殼的內(nèi)面可見有極體附著。尋找和觀察處于分裂間期和有絲分裂不同時(shí)期的細(xì)胞形態(tài)變化，并轉(zhuǎn)換高倍鏡仔細(xì)觀察。間期(Interphase) 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有兩個(gè)近圓形的細(xì)胞核，一為雌原核，另一為雄原核。兩個(gè)原核形態(tài)相似不易分辨，核內(nèi)染色質(zhì)分布比較均勻，核膜、核仁清楚，細(xì)胞核附近可見中心粒存在。 圖 馬蛔蟲受精卵的有絲分裂 分裂期(Mitosis) 前期(Prophase)雌、雄原核相互趨近,染色質(zhì)逐漸濃縮變粗、核仁消失，最后核膜破裂、染色體相互混合，兩個(gè)中心粒分別向細(xì)胞兩極移動(dòng)，紡錘體開始形成。 中期(Metaphase)染色體聚集排列在細(xì)胞的中央形成赤道板，由于細(xì)胞切面不同，此期有側(cè)

22、面觀和極面觀的兩種不同現(xiàn)象，側(cè)面觀染色體排列在細(xì)胞中央，兩極各有一個(gè)中心體，中心體之間的紡錘絲與染色體著絲點(diǎn)相連；極面觀由于染色體平排于赤道面上，2-6條染色體清晰可數(shù)，此時(shí)的染色體已縱裂為二，但尚未分離。后期(Anaphase)紡錘絲變短，縱裂后的染色體被分離為兩組，分別移向細(xì)胞兩極，細(xì)胞膜開始凹陷。 末期(Telophase)移向兩極的染色體恢復(fù)染色質(zhì)狀態(tài)，核膜、核仁重新出現(xiàn)，最后細(xì)胞膜橫縊，兩個(gè)子細(xì)胞形成。五、注意事項(xiàng)：馬蛔蟲是真核生物中染色體數(shù)目最少的物種，二倍體馬蛔蟲的染色體數(shù)目為2條或4條，三倍體為6條。在觀察切片時(shí)要注意所觀察卵的染色體數(shù)目的不同。注意：1)馬蛔蟲受精卵是動(dòng)物細(xì)胞

23、，在細(xì)胞分裂過(guò)程中與植物細(xì)胞有所不同。首先最明顯的不同就是，植物細(xì)胞的赤道板在后期可形成細(xì)胞板，而動(dòng)物細(xì)胞卻不能。2)細(xì)胞的整體分裂形式也不太一樣，植物細(xì)胞是細(xì)胞板的縊裂，動(dòng)物細(xì)胞是細(xì)胞膜中部向內(nèi)凹陷縊裂成兩個(gè)子細(xì)胞。3)再有，高等植物細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有中心體。馬蛔蟲的細(xì)胞內(nèi)有中心體，在有絲分裂過(guò)程中，中心體會(huì)進(jìn)行復(fù)制，然后發(fā)出星射線牽引染色體等等。六、作業(yè)：1、說(shuō)明動(dòng)植物細(xì)胞有絲分裂的區(qū)別。2、繪制馬蛔蟲受精卵或大蒜根尖細(xì)胞、洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂的各期細(xì)胞圖像，并注明結(jié)構(gòu)名稱?實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞凝集反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?#160;1、觀察血細(xì)胞的凝集現(xiàn)象。  2、掌握凝集素促使細(xì)胞凝集的原理。 二

24、、實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞質(zhì)膜是由蛋白質(zhì)不同程度鑲嵌在脂雙層中所形成的動(dòng)態(tài)流動(dòng)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)和脂類分子又與寡糖鏈結(jié)合為糖蛋白和糖脂分子，糖蛋白和糖脂分子伸至細(xì)胞表面的分枝狀寡糖鏈在質(zhì)膜表面形成細(xì)胞外被（又稱為糖萼）。許多研究結(jié)果表明：細(xì)胞間的分子識(shí)別、細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等均與細(xì)胞外被（分枝狀寡糖鏈）有關(guān)。凝集素（1ectin）是一類含糖的（少數(shù)凝集素例外）并能與糖進(jìn)行專一性結(jié)合的蛋白質(zhì)，它具有凝集細(xì)胞和刺激細(xì)胞分裂的作用。凝集素促使細(xì)胞凝集主要是由于它能與細(xì)胞外被的糖分子相連接、在細(xì)胞間形成“橋”的結(jié)果，加入與凝集素互補(bǔ)的糖分子可以抑制細(xì)胞間的凝集反應(yīng)。 三、實(shí)驗(yàn)用品：1、器材 顯微鏡、

25、托盤天平、載玻片若干、5mL注射器、滴管2支、離心管2支。2、試劑 PBS緩沖液：稱取NaCl 7.2g、Na2HP04 1.48g、KH2P04 0.43g、加蒸餾水，定容至l000 mL中，調(diào)pH值到7.2。1%肝素溶液：稱取肝素鈉0.1g，定容至l0 mL生理鹽水中即可。3、實(shí)驗(yàn)材料 土豆塊莖。 2% 紅細(xì)胞懸液 以無(wú)菌方法抽取兔子耳緣靜脈血液（5mL注射器用1%肝素溶液浸潤(rùn)）1mL，用生理鹽水洗5次，每次3000 r/min，離心5 min，最后按沉淀壓積的紅細(xì)胞體積用生理鹽水配成2紅細(xì)胞懸液。 四、實(shí)驗(yàn)方法：稱取土豆去皮塊莖2g，切成小塊 加10 mL PBS緩沖液，浸泡2

26、h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素） 載玻片上滴一滴土豆凝集素 再滴一滴2紅細(xì)胞液 充分混勻 靜置20 min 低倍顯微鏡下觀察血球凝集現(xiàn)象 以PBS液加2血細(xì)胞懸液作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，低倍顯微鏡下觀察。 五、作業(yè)：1、繪制簡(jiǎn)圖，表示血細(xì)胞的凝集過(guò)程。 2、圖示血細(xì)胞凝集的原理。實(shí)驗(yàn)六 細(xì)胞膜的滲透性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解溶血現(xiàn)象及其發(fā)生機(jī)制。2、了解細(xì)胞膜的滲透性及各類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度。二、實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的選擇通透性屏障。它是一種半透膜，可選擇性控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。各種物質(zhì)出入細(xì)胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶劑，水分子可以按照物質(zhì)濃度梯度從滲透壓低的一側(cè)通過(guò)細(xì)

27、胞膜向滲透壓高的一側(cè)擴(kuò)散，這種現(xiàn)象就是滲透。滲透作用是細(xì)胞膜的主要功能之一。將紅細(xì)胞放在低滲鹽溶液中，水分子大量滲到細(xì)胞內(nèi)，可使細(xì)胞脹破，血紅蛋白釋放到介質(zhì)中，由不透明的紅細(xì)胞懸液變?yōu)榧t色透明的血紅蛋白溶液，這種現(xiàn)象稱為溶血。將紅細(xì)胞放在某些等滲鹽溶液中，由于紅細(xì)胞膜對(duì)各種溶質(zhì)的通透性不同，有的溶質(zhì)可進(jìn)入，有的溶質(zhì)不能進(jìn)入，進(jìn)入紅細(xì)胞的溶質(zhì)能提高紅細(xì)胞的滲透壓，使水進(jìn)入紅細(xì)胞，引起溶血。由于溶質(zhì)透入速度不同，溶血時(shí)間也不同，因此，發(fā)生溶血現(xiàn)象所需時(shí)間長(zhǎng)短可作為測(cè)量物質(zhì)進(jìn)入紅細(xì)胞速度的一種指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)選用紅細(xì)胞作為細(xì)胞膜透性的實(shí)驗(yàn)材料，將其放入不同的介質(zhì)溶液中，觀察紅細(xì)胞的變化。三、實(shí)驗(yàn)用品：1

28、、器材：50ml燒杯、10ml移液管、滴管、試管12支、試管架。2、試劑：0.017mol/L氯化鈉、0.032mol/L葡萄糖、0.17mol/L氯化鈉、0.32mol/L葡萄糖、0.17mol/L氯化銨、0.17mol/L醋酸銨、0.17mol/L硝酸鈉、0.12mol/L草酸銨、0.12mol/L硫酸鈉、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮、 0.9%生理鹽水。四、實(shí)驗(yàn)材料：兔血。五、方法步驟：1、50%兔紅細(xì)胞懸液的制備。制備流程如下：以無(wú)菌方法抽取兔子耳緣靜脈血液（1 mL兔血加0.9%生理鹽水9 mL）混勻，離心（3000rpm）5min 棄上清

29、取沉淀 加0.9%生理鹽水， 離心（3000rpm）5min，重復(fù)3次 棄上清 取沉淀，用生理鹽水稀釋,制成 50%兔紅細(xì)胞懸液備用2、溶血現(xiàn)象的觀察：取試管2支，分別加入0.017mol/L氯化鈉和0.032mol/L葡萄糖低滲溶液3ml ，再加入2滴制備好的50%兔紅細(xì)胞懸液，注意觀察溶液顏色的變化，由不透明的紅色懸液變成透明的血紅蛋白溶液（紅細(xì)胞發(fā)生破裂，造成100%紅細(xì)胞溶血，使光線比較容易透過(guò)溶液）。3、紅細(xì)胞的滲透性：（1）取試管一支，加入0·17mol/L氯化鈉溶液3ml，再加入2滴制備好的50%兔紅細(xì)胞懸液，輕輕搖動(dòng)，混勻后靜置于溫室中，觀察試管中發(fā)生溶血的時(shí)間及其變

30、化。注意是否有顏色變化？是否有溶血現(xiàn)象？為什么？（2）分別在下列幾種等滲溶液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，步驟同（1）。0.32mol/L葡萄糖、0.17mol/L氯化銨、0.17mol/L醋酸銨、0.17mol/L硝酸鈉、0.12mol/L草酸銨、0.12mol/L硫酸鈉、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮。六、注意事項(xiàng)：1、離心機(jī)使用時(shí)，要將配平后的離心管對(duì)稱放置在離心機(jī)內(nèi)，禁止未配平就放入離心機(jī)和非對(duì)稱放置離心管。2、試管中有紅細(xì)胞和測(cè)試溶液時(shí)，不應(yīng)強(qiáng)力搖晃，以免造成人為的紅細(xì)胞破裂。3、目測(cè)法判斷標(biāo)準(zhǔn)：快速溶血：；慢速溶血：或；不溶血：。七、作業(yè)：記錄觀察到的現(xiàn)象，并

31、對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和比較。編號(hào)溶液種類是否溶血溶血所需時(shí)間結(jié)果分析123456789101112實(shí)驗(yàn)七 小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、通過(guò)對(duì)小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞活動(dòng)的觀察，加深理解細(xì)胞吞噬作用的過(guò)程及其意義。2、掌握小白鼠腹腔注射給藥和頸椎脫臼處死方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：巨噬細(xì)胞起源于骨髓，經(jīng)血液進(jìn)入組織中而成，分布于全身各處。當(dāng)機(jī)體受到某些損傷因素時(shí)（如微生物或其它病原體或異物侵入），能招引巨噬細(xì)胞，同時(shí)巨噬細(xì)胞有趨化性，主動(dòng)向病原體或異物游走，在接觸到病原體或異物時(shí)，細(xì)胞膜凹陷伸出偽足包圍異物，并發(fā)生胞吞作用形成吞噬泡，繼而巨噬細(xì)胞質(zhì)中的溶酶體與吞噬泡融合，消化分

32、解異物。含臺(tái)盼藍(lán)的淀粉肉湯，可使腹腔中有較多的巨噬細(xì)胞，以供觀察吞噬活動(dòng)。三、實(shí)驗(yàn)用品：1、儀器設(shè)備：顯微鏡、注射器、注射針頭、吸管、試管架、剪刀、解剖刀、解剖鑷、載玻片、蓋玻片、記號(hào)筆。2、試劑：0.85%生理鹽水；4%臺(tái)盼藍(lán)染液：稱0.2g臺(tái)盼藍(lán)，再加入0.85%生理鹽水50 ml即可；6%的淀粉肉湯（含臺(tái)盼藍(lán)染液）：將0.3g牛肉膏、1.0g蛋白胨、0.5g氯化鈉放入100 ml蒸餾水中，加熱后加入可溶性淀粉6.0g，溶解后煮沸滅菌，置4冰箱保存。用時(shí)水浴融化，加入適量4%臺(tái)盼藍(lán)染液混勻，使其呈藍(lán)色；Alsever溶液：葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉(Na9C6H5O7.2H2O) 0.89

33、g、檸檬酸（C6H6O7.H2O）0.05g、氯化鈉0.42g、蒸餾水100ml，調(diào)pH至7.2，過(guò)濾滅菌或高壓滅菌10min，置4冰箱保存。3、材料：小白鼠；1%雞紅細(xì)胞懸液：從集市買一只健康活雞現(xiàn)殺取血5ml（防止污染），放入盛有20ml Alsever溶液瓶中，混勻后置4冰箱保存?zhèn)溆茫? 周內(nèi)使用）。使用前，取用Alsevers 液保存的新鮮雞血5ml ， 加入8ml 的0.85% 的NaCl 溶液，小心混勻，1500 r/min 離心5min，如此洗滌3 次，最后配成1%的雞紅細(xì)胞懸液。四、實(shí)驗(yàn)材料：1、小白鼠。2、1%雞紅細(xì)胞懸液。五、實(shí)驗(yàn)步驟：1、實(shí)驗(yàn)前一天，給小白鼠腹腔注射6淀粉

34、肉湯液(含臺(tái)盼藍(lán))1毫升（連續(xù)注射三天效果較好）。2、實(shí)驗(yàn)時(shí)，每組取一只注射過(guò)淀粉肉湯的小白鼠，腹腔注射1%雞紅細(xì)胞懸液1ml，25分鐘30分鐘后再向腹腔注射0.9%生理鹽水1ml，并用手輕揉小鼠腹部，有利于懸液分散。3分鐘后，用頸椎脫臼方法處死小鼠（一手捏著鼠頭、頸連接處，一手捏住鼠尾，分別向兩端用力牽拉，直到拉死為止），迅速剖開腹腔，用不帶針頭的注射器貼腹腔背壁處直接抽取腹腔液，滴片，制備一張臨時(shí)裝片，蓋上蓋玻片。放置2分鐘3分鐘后在顯微鏡下觀察。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在高倍鏡下，可見到圓形或形狀不規(guī)則的巨噬細(xì)胞，其胞質(zhì)中含有數(shù)量不等的藍(lán)色顆粒（為吞入的含臺(tái)盼藍(lán)的淀粉肉湯形成的吞噬泡），還可見少量

35、淡黃色橢圓形有核的雞紅細(xì)胞。慢慢移動(dòng)玻片標(biāo)本，仔細(xì)觀察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的過(guò)程：有的雞紅細(xì)胞（一個(gè)至多個(gè)）緊貼于巨噬細(xì)胞表面；有的巨噬細(xì)胞已將一至數(shù)個(gè)雞紅細(xì)胞部分吞入；有的巨噬細(xì)胞已吞入了一個(gè)或幾個(gè)紅細(xì)胞，形成了橢圓形吞噬泡；有的巨噬細(xì)胞內(nèi)的吞噬泡已與溶酶體融合正在被消化，體積縮小呈圓形。將所見到的處在不同吞噬階段的巨噬細(xì)胞動(dòng)態(tài)地聯(lián)系起來(lái)，想一想吞噬作用的全過(guò)程。七、注意事項(xiàng)：剖開小鼠腹腔時(shí)，剪刀頭要向上，以避免剪破腹腔血管，腹腔液應(yīng)是無(wú)色的液體。八、作業(yè)：在高倍鏡下繪制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞血紅細(xì)胞的過(guò)程圖（繪制不同吞噬階段的巨噬細(xì)胞圖各一個(gè)），示巨噬細(xì)胞吞噬作用的全過(guò)程。實(shí)驗(yàn)八 線粒體和液泡

36、系的超活染色與觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、觀察動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布。2、學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理： 活體染色是指對(duì)生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著色但又無(wú)毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡?；钊炯夹g(shù)可用來(lái)研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染與體外活染兩類。體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動(dòng)、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識(shí)別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動(dòng)、植物

37、分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色。活體染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部位，主要是染料的“電化學(xué)”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽(yáng)離子，酸性染料的膠粒表面帶陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽(yáng)離子的，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性或毒性極小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來(lái)使用。一般是以堿性染料最為適用，可能因?yàn)樗鼈兙哂腥芙庠陬愔|(zhì)（如卵磷脂、膽固醇等）的特性，易于被細(xì)胞吸收。詹納斯綠B（Janus green B）和中性紅（neutral red）兩種堿性

38、染料是活體染色劑中最重要的染料，對(duì)于線粒體和液泡系的染色各有專一性。三、實(shí)驗(yàn)用品：1、器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、剪刀、鑷子、刀片、載玻片、蓋玻片、10ml量筒、吸管、牙簽、吸水紙（或衛(wèi)生紙）等。2、試劑：（1）Ringer溶液（裝入滴瓶）：氯化鈉0·85g（變溫動(dòng)物用0·65g）、氯化鉀0·25g、氯化鈣0·03g、蒸餾水100ml。（2）1%、1/3000中性紅溶液（裝入棕色滴瓶）：稱取0·5g中性紅溶于50mlRinger液，稍加熱（30-40）使之很快溶解，用濾紙過(guò)濾，裝于棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。臨用前，取已配制的

39、1%中性紅溶液1ml，加入29mlRinger溶液混勻，裝入棕色瓶備用。（3）1%、1/5000詹納斯綠B溶液（裝入棕色滴瓶）： 稱取50mg詹納斯綠B溶于5mlRinger溶液中，稍加熱（30-40），使之溶解，用濾紙過(guò)濾后，即為1%原液。取1%原液1ml加入49mlRinger溶液，即成1/5000工作液，裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。四、實(shí)驗(yàn)材料：1、人口腔上皮細(xì)胞。2、小白鼠肝細(xì)胞。3、洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞。4、小麥或黃豆幼根根尖。五、實(shí)驗(yàn)方法：（一）、線粒體的超活染色與觀察：線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所，其形態(tài)和數(shù)量隨不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態(tài)而發(fā)生

40、變化。詹納斯綠B是毒性較小的堿性染料，可專一性地對(duì)線粒體進(jìn)行超活染色，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)），呈藍(lán)綠色；而線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì)中，這些染料被還原為無(wú)色的色基（即無(wú)色狀態(tài)）。1、人口腔黏膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察（1）、取清潔載玻片放在37恒溫水浴鍋的金屬板上，滴兩滴1/5000詹納斯綠B染液。（2）、實(shí)驗(yàn)者用牙簽寬頭在自己口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色1015分鐘（注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。（3）、在低倍鏡下，選擇平展的口

41、腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察。可見扁平狀上皮細(xì)胞的核周圍胞質(zhì)中，分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即是線粒體。2、小白鼠肝細(xì)胞線粒體的超活染色觀察(1) 用脊椎脫臼法處死小白鼠，置于解剖盤中，剪開腹腔，取小白鼠肝邊緣較薄的肝組織塊，放入表面皿內(nèi)。用吸管吸取Ringer 液，反復(fù)浸泡沖洗肝臟，洗去血液。(2) 在干凈的凹面載玻片的凹穴中, 滴加1/5000詹納斯綠B溶液，再將肝組織塊移入染液，注意不可將組織塊完全淹沒(méi)，要使組織塊上面部分半露在染液外，這樣細(xì)胞內(nèi)的線粒體酶系可充分得到氧化，易被染色。當(dāng)組織塊邊緣被染成藍(lán)綠色即成(般需染2030min)。(3) 吸去染液，滴加Rin

42、ger 溶液，用眼科剪將組織塊著色部分剪碎，使細(xì)胞或細(xì)胞群散出。然后，用吸管吸取分離出的細(xì)胞懸液，滴一滴子載玻片上，蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察。(4) 在低倍鏡下選擇不重疊的肝細(xì)胞，在高倍鏡或油鏡下觀察，可見具有l(wèi)2 個(gè)核的肝細(xì)胞質(zhì)中，有許多被染成藍(lán)綠色的線粒體，注意其形態(tài)和分布狀況。3、洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察（1）用吸管吸取1/5000詹納斯綠B染液，滴一滴于干凈的載玻片上，然后，撕取一小片洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，置于染液中，染色1015分鐘。（2）用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使內(nèi)表皮組織展平，蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察。（3）高倍鏡下，可見洋蔥表皮細(xì)胞中央被一大液泡所占據(jù)，細(xì)胞核被擠至

43、一側(cè)貼細(xì)胞壁處。仔細(xì)觀察細(xì)胞質(zhì)中線粒體的形態(tài)與分布。（二）、液泡系的超活染色與觀察中性紅為弱減性染料，對(duì)液泡系的染色有專一性，只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色，這可能與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。1、小麥或黃豆根尖細(xì)胞液泡系的中性紅染色與觀察（1）實(shí)驗(yàn)前，將小麥或黃豆種子培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內(nèi)潮濕的濾紙上，使其發(fā)芽，胚根伸長(zhǎng)到1cm以上。（2）取初生的小麥或黃豆幼苗根尖（約12cm長(zhǎng)）,置于載波片上,滴一滴Ringer液，用鑷子或刀片小心將根尖壓成一薄片，吸去Ringer液，在材料上滴一滴1/3000中性紅染液，染色510分鐘。（3）吸去染液，滴一滴Ringer液，蓋上蓋玻片，并用鑷子

44、輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察。（4）在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長(zhǎng)點(diǎn)的細(xì)胞，可見細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長(zhǎng)點(diǎn)向延長(zhǎng)區(qū)觀察，在一些已分化長(zhǎng)大的細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個(gè)淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分，將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。2、洋蔥表皮細(xì)胞液泡系的活體染色與觀察（1）撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮。（2）置于加有一滴1/3000的中性紅染液的載玻片中，染色510分鐘。（3）用吸水紙吸去染液，換上Ringer液，蓋上蓋玻片。（4）顯微鏡下觀察，可見被染成磚紅色的中央大液泡。六、注意

45、事項(xiàng)：1、在對(duì)口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)不可使染液干燥，可適當(dāng)補(bǔ)加染液。2、在對(duì)植物進(jìn)行觀察時(shí)一定要讓材料盡量展開。七、作業(yè)：1、繪口腔上皮細(xì)胞示線粒體形態(tài)與分布2、繪小麥或黃豆根尖細(xì)胞示液泡系形態(tài)與分布實(shí)驗(yàn)九 細(xì)胞核與線粒體的分離與觀察一、目的與要求：1、學(xué)習(xí)勻漿器和高速離心機(jī)的使用方法。2、學(xué)習(xí)用差速離心法分離線粒體的一般操作程序。了解提取線粒體的基本原理及其過(guò)程，通過(guò)光學(xué)顯微鏡的觀察了解體外分離的線粒體的一般形態(tài)，增加對(duì)線粒體的感性認(rèn)識(shí)。二、原理：細(xì)胞由細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)組成，細(xì)胞種含有各種細(xì)胞器和細(xì)胞骨架等。對(duì)各種細(xì)胞器進(jìn)行分離和純化，便于對(duì)它們進(jìn)行結(jié)構(gòu)或生理生化分析。這種拆離的方法，

46、使細(xì)胞中的各種生物學(xué)過(guò)程彼此分開，互不干擾。分離細(xì)胞器的方法主要有差速離心和密度梯度離心。 細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的比重和大小都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用差速離心法，先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉淀下來(lái)，從而使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體等得以分離。分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿(在低溫條件下進(jìn)行）后，放在均勻的懸浮介質(zhì)上，即可用差速離心法分離其亞細(xì)胞組分。球形顆粒在均勻的懸浮介質(zhì)中的沉降速度取決于離心場(chǎng)G、顆粒的密度、半徑以及懸浮介質(zhì)的粘度。主要細(xì)胞器的沉降順序是：細(xì)胞核機(jī)質(zhì)膜碎片、葉綠體、線粒體、溶酶體和微體、微粒體、核

47、糖體和生物大分子。 細(xì)胞器分離常用介質(zhì)是緩沖的蔗糖水溶液。它比較近細(xì)胞質(zhì)的分散相，具有足夠滲透壓，防止顆粒膨脹破裂，對(duì)酶活性干擾小，在pH7.4的條件下細(xì)胞器不易發(fā)生聚集。三、實(shí)驗(yàn)用品：（一）材料：小鼠。（二）器材：剪刀、漏斗、玻璃勻漿器、小燒杯、尼龍網(wǎng)(或紗布)、溫度計(jì)、離心管、冷凍高速離心機(jī)、顯微鏡、載片、蓋片 片、吸水紙、鏡頭紙、恒溫水浴鍋、PH 計(jì)、冰箱、高壓滅菌鍋等。（三）試劑：氯化鈉、詹納斯綠B、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、D(十)蔗糖、甲醇、冰醋酸、雙蒸水、甘油、姬姆薩染料、KH2P04 、Na2HP04。1、0.9%滅菌的生理鹽水。2、1%詹納斯綠B染液，用0.9%滅菌

48、的生理鹽水配制。3、0.25mol/L 蔗糖-0.01mo1/L Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)：0.1mol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris) 10ml；0.1mol/L 鹽酸8.4ml；加雙蒸水到100ml；加蔗糖到0.25mol/L。4、0.34mol/L 蔗糖-0.01mol/L tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)。5、0.34mol/L蔗糖0.5mmol/LMg（AC）2（pH7.4）。 6、0.88mol/L蔗糖0.5mmol/LMg（AC）2（pH7.4）。7、姬姆薩染液（原液）：Giemsa 粉0.5g，甘油33m1，純甲醇33m1。先將Giemsa 粉置于研缽內(nèi)中，加少量

49、甘油研磨至無(wú)顆粒，再將剩余甘油倒入混勻，56左右保溫2h 令其充分溶解，最后加甲醇混勻，成為姬姆薩原液，保存于棕色瓶。8、姬姆薩染液（應(yīng)用液）：臨用時(shí)，吸出1ml 原液，用9ml 1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)作10倍稀釋。9、1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH6.8)：l/15mol/L KH2P04 50ml；l/15 mol/L Na2HP04 50ml。10、RSB溶液。 11、甲醇-冰醋酸固定液：甲醇：冰醋酸(9：1)。12、比重d20= 1.18的蔗糖溶液。13、比重d20= 1.16的蔗糖溶液。四、實(shí)驗(yàn)操作：1、制備小鼠肝細(xì)胞勻漿：實(shí)驗(yàn)前小鼠空腹12h，拉頸處死，

50、剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干。稱取肝組織2g，剪碎，用預(yù)冷到04的0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后在04條件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿化，蔗糖溶液應(yīng)分?jǐn)?shù)次添加。勻漿液用尼龍網(wǎng)(或四層紗布)過(guò)濾備用。2、差速離心：先將9ml 0.34mol/L 緩沖蔗糖溶液放入離心管，然后沿管壁小心地加入9ml 肝勻漿使其覆蓋于上層。用冷凍高速離心機(jī)按下圖順序進(jìn)行差速離心，以分離細(xì)胞核和線粒體。差速離心提取鼠肝細(xì)胞核和線粒體流程見下圖。3、收集質(zhì)膜：吸出細(xì)胞核沉淀 中較疏松的上層，混懸于比重d20 = 1.16的蔗糖溶液中，沿管壁小心地加入

51、離心管，使其覆蓋在等量的比重d20= 1.18的蔗糖溶液之上。 700g離心10min，質(zhì)膜最終集中在兩層溶液的界面上。用尖頭吸管小心地吸出質(zhì)膜。4、細(xì)胞核的純化：將細(xì)胞核沉淀懸浮在5倍體積的0.34mol/L蔗糖0.5mmol/LMg（AC）2（pH7.4）溶液中，鋪在4倍于核懸浮液體積的0.88mol/L蔗糖0.5mmol/LMg（AC）2 （pH7.4）溶液之上，500g離心20min，棄上清液，沉淀為純化的細(xì)胞核。置RSB溶液中4可保存數(shù)天。5、線粒體的純化（見圖）：合并的上清液10，000g離心10min，棄上清，沉淀（線粒體 ）用10ml預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗滌，共洗2

52、次，每次10，000g離心10min，沉淀即為純化的線粒體，純化的線粒體可懸浮在0.25mol/L蔗糖溶液中，置-70 保存。鼠肝勻漿液700×g 離心10min沉淀 上清液加10 ml 預(yù)冷的0.25M 蔗糖溶液2 次，每次1000×g 離心15min沉淀 上清液（細(xì)胞核及質(zhì)膜碎片） 合并洗滌10ml預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖溶液，共洗2次，每次1000g離心10min。10，000×g 離心10min離心沉淀（線粒體） 上清液加10ml 預(yù)冷的0.25M 蔗糖溶液2 次，每次10，000×g 離心15min沉淀 上清液（純化的線粒體）圖： 差速離心

53、分離鼠肝細(xì)胞核和線粒體流程圖6、分離物鑒定：(1) 細(xì)胞核的鑒定：取細(xì)胞核沉淀1 滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴1 滴姬姆薩染液應(yīng)用液染色10min。自來(lái)水沖洗，吹干，鏡檢。結(jié)果：細(xì)胞核呈紫紅色，上面附著的少量胞質(zhì)及淺藍(lán)色碎片。(2) 線粒體的鑒定：取線粒體沉淀1 滴涂片，滴加1%詹納斯綠B 染液染20min，覆上蓋玻片，鏡檢。線粒體藍(lán)綠色，呈小棒狀或啞鈴狀。五、實(shí)驗(yàn)建議：1、注意盡可能先充分剪碎肝組織，縮短勻漿時(shí)間，整個(gè)分離過(guò)程不宜過(guò)長(zhǎng)，以保持組分生理活性。最好在在04或冰浴中進(jìn)行。2、將勻漿液置于蔗糖溶液上層時(shí)要沿管壁小心加入，同時(shí)及時(shí)離心，以防勻漿液中的顆粒自然下沉

54、過(guò)快，影響后面的離心分層效果。3、姬姆薩染液應(yīng)用液要在實(shí)驗(yàn)時(shí)臨時(shí)配制，效果較好。過(guò)期的應(yīng)用液不可使用。4、饑餓對(duì)線粒體形狀的影響。線粒體正常情況下一般呈圓形。饑餓時(shí)，缺乏供能營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，線粒體會(huì)數(shù)目減少，大量的嵴會(huì)消失，會(huì)使線粒體形狀變得細(xì)長(zhǎng)，因而易于觀察。5、使用肝細(xì)胞的緣由：A、線粒體含量較多，每個(gè)肝細(xì)胞有1000-2000個(gè)線粒體；B、長(zhǎng)度適合觀察，約5m；C、肝臟較軟，易于破碎，并且適于快速提取，因而利于保持線粒體活性； D、但就以上某一條而言，均有其他部位可以替代肝臟，但若全面比較三個(gè)條件，則肝臟為最佳。六、作業(yè)：1、繪制觀察的細(xì)胞核和線粒體的結(jié)構(gòu)圖。 2、線粒體提取分離過(guò)程中，為什么要在04進(jìn)行？3、分離介質(zhì)0.25mol/L 及0.34mol/L 緩沖蔗糖溶液哪一種在下層? 有什么作用?七、思考題：差速離心與密度剃梯度離心方法有什么不同？離心結(jié)束時(shí)亞細(xì)胞組分在介質(zhì)中各呈什么樣的分布？因而收集組分的方法有什么分別？ 實(shí)驗(yàn)十 外來(lái)化合物的毒性測(cè)定Zn2+（Cu2+或Cd2+）對(duì)小鼠肝細(xì)胞SOD活力的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模罕驹囼?yàn)以小鼠為試驗(yàn)對(duì)象,從鋅（銅或鎘）毒性的氧化損傷出發(fā),測(cè)定染鋅（銅或鎘）后小鼠肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）的活性變化,以此探討鋅（銅或鎘）對(duì)小鼠肝臟抗氧化酶SOD的影響. 為細(xì)胞分子水平毒性機(jī)制探討和環(huán)境安全性