細胞培養(yǎng)與細胞生死狀態(tài)的鑒別

1、Fh»eOde肇【實驗目的】1.2. 蚄學習并掌握動物細胞培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)。3.3. 羈了解并掌握用組織塊貼壁培養(yǎng)法和消化細胞培養(yǎng)法進行動物細胞原代培養(yǎng)的實驗方法。5.4. 袀熟練掌握動物細胞傳代培養(yǎng)的實驗方法。7.5. 膅學習細胞生死狀態(tài)鑒別的方法。9.6. 肅了解細胞生死狀態(tài)鑒別的原理。11.12.螁熟悉和掌握各種鑒別細胞生死狀態(tài)方法的判定特征。袁薈【實驗原理】蒂1.細胞培養(yǎng)蒁 細胞培養(yǎng)指的是在無菌條件下，把動、植物細胞從組織中取出，在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán) 境，使離體的細胞在體外生長和繁殖，并且維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。動物細胞培養(yǎng) 可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。從供體獲得組

2、織細胞，在無菌條件下，用胰蛋白酶消化或機械分 散等方法，將動物組織分散成單個細胞開始首次培養(yǎng)長出單層細胞的方法稱為細胞的原代培 養(yǎng)。當培養(yǎng)的動物細胞生長增殖達到一定密度，形成致密的單層細胞時，用胰蛋白酶將細胞消 化分散成單細胞，從一個容器中以1： 2或其他比例轉(zhuǎn)移到另一個容器中擴大培養(yǎng)的方法，稱 為細胞的傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的累計次數(shù)就是細胞的培養(yǎng)代數(shù)。蚈高等生物是由多細胞構(gòu)成的整體，在整體條件下要研究單個細胞或某一群細胞在體內(nèi)的功 能活動是十分困難的。但如果把活細胞拿到體外培養(yǎng)、增殖并進行觀察和研究，則要方便和簡 單得多。被培養(yǎng)的動物細胞是非常好的實驗對象和實驗研究材料，對體外培養(yǎng)的活細胞進行

3、研究可以幫助人類揭開生、老、病、死的規(guī)律，探索優(yōu)生、抗衰老和防治各種疾病的途徑和機制， 也可以人為地誘導和改變細胞的遺傳性狀和特性，使其向有利于人類健康長壽的方向發(fā)展。因 此動物細胞體外培養(yǎng)技術(shù)是研究細胞分子機制非常重要的實驗手段，被廣泛應用于醫(yī)學、生物技術(shù)、基因工程等研究領(lǐng)域。蚆2.細胞生死狀態(tài)的鑒定膆細胞生死狀態(tài)的鑒別方法主要是化學染色法和熒光染色法。節(jié)活細胞和死亡細胞在生理技能和性質(zhì)上主要存在一下差異： 細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性地通過；而細胞 死后，細胞膜受損，其通透性增加?；诖耍l(fā)展出了以臺盼藍、伊紅、苯胺黑、赤蘚紅、

4、甲 基藍以及熒光染料碘化丙啶或溴化乙啶等為染料鑒別細胞生死狀態(tài)的方法， 上述染料能使死亡 細胞著色，而活細胞不被著色。 此外，應用植物質(zhì)壁分離的性質(zhì)也可鑒定植物細胞的生死狀態(tài)。 活細胞的原生質(zhì)具有選擇透過性， 死細胞因其原生質(zhì)的選擇透過性已遭破壞， 故與高滲透壓溶 液接觸時不產(chǎn)生質(zhì)壁分離。 代謝上的差異：活細胞中新陳代謝作用強，細胞內(nèi)的酶具有較 強的活性和還原能力?；诖耍l(fā)展處了以熒光素二乙酸酯（FDA、熒光素二丙酸酯、熒光素 二丁酸酯或熒光素二苯甲酰酯等酯化的熒光素鑒別細胞生死狀態(tài)的方法， 上述酯化的熒光素親 脂性提高， 容易被細胞吸收進入， 活細胞內(nèi)的酯酶具有較強的活性， 可將酯化的熒光

5、素分解而 釋放出能發(fā)熒光的熒光素， 該物質(zhì)不能自由透過活的細胞膜， 積累在細胞內(nèi)， 熒光顯微鏡下顯 示有明亮的綠色或黃綠色熒光； 而死亡細胞內(nèi)的酯酶因失去活性， 不能分解酯化的熒光素， 熒 光顯微鏡下顯示不發(fā)光。 另外，可用亞甲基藍為染料鑒定酵母細胞的生死狀態(tài)。 亞甲基藍是一 無毒染料，氧化型為藍色，還原型為無色?；罴毎蚓哂休^強的還原能力，能使亞甲藍從藍色 的氧化型變成無色的還原型， 故活的酵母細胞在用亞甲基藍染色后顯示無色； 死亡酵母細胞或 代謝緩慢的衰老酵母細胞， 因無還原能力或還原能力極弱， 使亞甲藍仍處于氧化態(tài)， 故呈現(xiàn)藍 色或淡藍色。薅羂【實驗材料 】薇1. 超凈工作臺、二氧化碳培

6、養(yǎng)箱、離心機、眼科剪、眼科鑷、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管、微 量加樣器、吸管、酒精燈；小鼠、培養(yǎng)基2. 血球計數(shù)板、蓋玻片、滴管、顯微鏡；培養(yǎng)的小鼠脾臟細胞、臺盼藍、伊紅膇【實驗步驟 】1.2. 肄取材螂取小白鼠一只，采用斷頭法處死：清水洗小鼠并浸于75%酒精中滅菌 5 分鐘。取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)的解剖盤內(nèi)，無菌操作打開腹腔。取出脾臟，去除其周圍的脂肪組織，鑷起脾 臟用PBS液自上而下沖洗1 2次。轉(zhuǎn)入無菌玻璃培養(yǎng)皿，待用。3.3. 蕿分離脾細胞芅用滴管先向上述無菌玻璃培養(yǎng)皿中滴入 PBS液30滴,再用“L”型針頭注射器在皿中吸取 PBS液 0.2ml，然后將其沿脾長軸方向注射入脾內(nèi)（使脾臟膨脹以

7、利于細胞散開）。蒄用針尖在脾臟上扎眼，并用“ L”針頭輕刮脾臟表面擠出脾細胞，用滴管吸皿中的PBS液沖脾臟并吹散刮出的脾細胞，稍傾斜并靜置 12分鐘。蒃吸取上述靜置后的脾細胞懸液上清部分放入 Eppendof管，并使量至1ml，以3000"分離 1 2 分鐘。5.6. 蝕培養(yǎng)脾細胞蚇超凈工作臺中取塑料培養(yǎng)皿一個，用“槍（1ml）”加入細胞培養(yǎng)液2ml，并在皿蓋上畫上 標記，待用。袃?nèi)∩鲜鲭x心后的Eppendof管，在超凈工作臺內(nèi)開蓋棄去上清液，用“槍（200卩l(xiāng) ）”吸 取塑料皿中的培養(yǎng)液400卩l(xiāng)加入棄去上清液的Eppendof管中，用槍頭吹勻管底的脾細胞， 然后吸取200卩I脾細

8、胞懸液接種于上述塑料培養(yǎng)皿中，混勻，然后放入37C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.8. 膃臺盼藍法鑒定細胞的生死狀態(tài)：蕆（1） 試劑配制：用生理鹽水配置 0.4%臺盼藍染液，備用。螆（2） 細胞懸液制備：將生長有貼壁型細胞的培養(yǎng)瓶（皿）中的培養(yǎng)液倒入干凈試管中， 向培養(yǎng)瓶（皿）中加入 0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml，靜置3-5min，待見 到細胞變圓，彼此不連接為止，棄去混合消化液并將上述試管中的培養(yǎng)液倒回培養(yǎng)瓶中， 用滴管輕輕吹打細胞，制成細胞懸液。莃（3）染色制片：取0.5ml細胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混 合， 2min 后制成臨

9、時裝片，鏡檢。羄（ 4） 染色結(jié)果：死細胞染成藍色，活細胞不著色。葿或者膈（3）染色計數(shù)：取0.5ml細胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混 合2-5min，滴加少許染色后的細胞懸液于放有蓋片的血球計數(shù)板的斜面上，使懸液自然充 滿計數(shù)板小室。注意不要使小室內(nèi)有氣泡產(chǎn)生，否則要重新滴加。在普通光鏡10'物鏡下計數(shù)四個大格內(nèi)的細胞數(shù)，壓線者數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。羆（4） 根據(jù)染色結(jié)果計算活細胞率：依據(jù)死細胞染成藍色、活細胞不著色的原則計數(shù)死細 胞數(shù)和細胞總數(shù)，以如下公式計算細胞存活率：蒀細胞存活率 =（細胞總數(shù) -死亡細胞數(shù)） /細胞總數(shù) *100%薀附：血球計數(shù)板

10、芇血球計數(shù)板是一塊特制的厚載玻片， 載玻片上有四條槽而構(gòu)成三個平臺。 中間的平臺較 寬，其中間又被一短橫槽分割成兩半，每個半邊上面各有有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分 九大格，其中間的一大格（又稱計數(shù)室）常被用作細胞的計數(shù)。蒅計數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為 1 6個中方格,而每個中方格又分成 25個小方 格；另一種是一個大方格分成 25個中方格，而每個中方格又分成 16個小方格。但是不管 計數(shù)室是哪一種構(gòu)造，他們都有一個共同特點，即每個大方格都有 400 個小方格組成。膀每個大方格邊長為1mm則每一大方格的面積為1口市每個小方格的面積為1/400口用蓋 上蓋玻片后，蓋玻片與計數(shù)室底部之間的高

11、度為0.1mm所以每個計數(shù)室（大方格）的體積為0.1mm3所以每個小方格的體積為1/400mm若取四個大方格的細胞數(shù)，貝 每毫升液體中細胞的數(shù) =每個大方格中的細胞數(shù)量 *10000*稀釋倍數(shù)莇 【 實驗結(jié)果 】裊羈死細胞活細胞葿項目螇左上芄左下蟻右上蒀右下祎中螃總細胞莁14羋8羋16膃17膂15荿死細胞莆7祎5袂8莀9蒅5芆蚃細胞存活率=(細胞總數(shù)-死亡細胞總數(shù))/細胞總數(shù)X100%膈=(14+8+16+17+15-(7+5+8+9+5) / (14+8+16+17+15 *100%袇=51.43%蚅每毫升液體中細胞的數(shù)=(70/5)*25*(16/25)*10000莃=3500000艿羆【

12、實驗結(jié)果分析】1.2.膄活細胞邊緣較明顯，而求細胞膜維持正常的選擇透過性， 染料無法通過，所以呈現(xiàn)透明無3.4. 膃死細胞由于細胞膜不再具有生物活性， 染料從細胞膜通過， 將細胞染色， 且死細胞的邊緣 不明顯。5.6. 芁將培養(yǎng)基剛從培養(yǎng)箱拿出來時， 培養(yǎng)基的顏色應呈現(xiàn)無色 （由于細胞的代謝產(chǎn)物為酸性以 及培養(yǎng)箱中的二氧化碳濃度較高） ，過一段時間后漸漸恢復粉紅色。7.8. 莈用倒置顯微鏡觀察時，可以看到在黃色的背景下有一些透明的細胞。薄【注意事項 】1.2. 襖在進行方格查數(shù)時注意：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)下不數(shù)上。3.4. 肈實驗涉及的臺盼藍染料有致癌危險，因此滴加染液時要小心，防止濺到皮膚上。5.

13、6. 蒆動物細胞培養(yǎng)使用的所有器皿、 用具、 溶液等必須經(jīng)過嚴格消毒或除菌處理， 才能進超凈 工作臺中使用，整個實驗過程都要有無菌操作的概念，避免細胞被污染。7.8. 羃在超凈工作臺內(nèi)點燃酒精燈后， 實驗操作應在火焰的附近進行， 耐熱物品要經(jīng)常在火焰上 燒灼，金屬器械燒灼后要待其冷卻才能夾取組織，經(jīng)過培養(yǎng)液的用具不能長時間燒灼，以 免燒焦形成碳膜。9. 超凈工作臺內(nèi)吸取溶液用的的各種吸管等不能混用，以免相互污染。10. 在超凈工作臺中，組織細胞、培養(yǎng)液等不能敞開暴露過久，以免溶液蒸發(fā)和pH變化。11. 器皿、離心管培養(yǎng)瓶等在離開超凈工作臺前必須將蓋子或橡皮塞蓋緊，以防止細胞污染或 溶液漏出。【

14、 反思與總結(jié) 】1. 做實驗的時候由于顯微鏡的光線問題，死細胞的顏色有時不太明顯，在觀察的時候需要注、八意。2. 將脾加入到培養(yǎng)基后，準備將其加入到培養(yǎng)箱培養(yǎng)時，檢測一下培養(yǎng)基中是否有氣泡，若 有氣泡的話，則應除去后再放置。3. 用注射器的針頭對小白鼠的脾進行穿孔時要小心操作，既不能刺得太狠將脾弄破，也不能 刺得太輕使得到的脾細胞過少。4. 注意進行無菌實驗操作的規(guī)范，身體只有消過毒的部分才可進入超凈工作臺，防止身體的 其他部分將細菌帶入。5. 注意用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)基中細胞的正確方法。僅供個人用于學習、研究；不得用于商業(yè)用途For personal use only in study an

15、d research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pas fins commerciales.to員bko gA.nrogeHKO TOpMenob3ygoiflCH6yHeHuac egoB u HHuefigoHMucno 員 B30BaTbCEb KOMMepqeckuxqe 員 ex.僅供個人用于學習、研究；不得用于商業(yè)用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen fu r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et