PDQuest軟件分析2-DE圖譜講義課件

1、蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)主講教師：張玲2007.10.11回顧Functional analysisState 1State 22DEPMFMS/MSLC-MS/MSDatabase searchDifferential analysis?第四章第四章 電泳圖譜的圖像分析及電泳圖譜的圖像分析及細胞蛋白譜的建立細胞蛋白譜的建立 課程內(nèi)容課程內(nèi)容掌握：掌握：蛋白電泳圖像分析系統(tǒng)熟悉：熟悉：使用PDQuest軟件進行蛋白質(zhì)點的自動檢測，匹配和分析了解：了解：二維電泳蛋白譜數(shù)據(jù)庫電泳圖譜的圖像分析簡介what can we get from image analysis?雙向凝膠電泳技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組研究

2、的主要技術(shù)雙向凝膠電泳技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組研究的主要技術(shù)之一之一, , 雙向電泳根據(jù)等電點和分子量可一次性分離數(shù)雙向電泳根據(jù)等電點和分子量可一次性分離數(shù)千種蛋白質(zhì)，經(jīng)染色后蛋白質(zhì)再千種蛋白質(zhì)，經(jīng)染色后蛋白質(zhì)再PAGEPAGE上可形成密度上可形成密度不同、分布不均的復(fù)雜點圖譜。不同、分布不均的復(fù)雜點圖譜。如何有效的對雙向凝膠電泳圖像分析，如何對圖譜如何有效的對雙向凝膠電泳圖像分析，如何對圖譜上的蛋白質(zhì)點進行檢測、定量、比較、分析和歸類，上的蛋白質(zhì)點進行檢測、定量、比較、分析和歸類，挖掘有價值的蛋白質(zhì)點的信息是雙向電泳分析軟件挖掘有價值的蛋白質(zhì)點的信息是雙向電泳分析軟件所要解決的問題。所要解決的問題

3、。PDQuest 軟件簡介軟件簡介PDQuestPDQuest軟件是顯示（軟件是顯示（imagingimaging）、分析）、分析（analyzinganalyzing）雙向電泳圖譜數(shù)據(jù)庫查詢的一個）雙向電泳圖譜數(shù)據(jù)庫查詢的一個軟件包軟件包硬件：硬件：一定的電腦配置,Pentirm 166處理器，64M內(nèi)存，3G硬盤，1024*768分辨率 ，256色，SCI接口，windows操作系統(tǒng)軟件：軟件： PDQuest雙向凝膠圖像分析軟件，Bio-Rad Laboratory,Hercules,CAPDQuest 軟件的使用軟件的使用以以PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析軟件為例將雙

4、向電泳分分析軟件為例將雙向電泳分析的基本實驗過程做一簡單介紹。析的基本實驗過程做一簡單介紹。凝膠的圖像處理分析及細胞蛋白譜的建立 典型流程典型流程l凝膠圖像的掃描：凝膠圖像的掃描：l圖像加工：圖像加工：l斑點檢測和定量：斑點檢測和定量：l凝膠配比：凝膠配比：l數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析：l數(shù)據(jù)呈遞（數(shù)據(jù)呈遞（report）l2-DE數(shù)據(jù)庫的建立數(shù)據(jù)庫的建立：PDQuest 軟件軟件PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析軟件系統(tǒng)和其他分析軟件系統(tǒng)和其他2-D2-D分析軟分析軟件系統(tǒng)一樣，包括：件系統(tǒng)一樣，包括：一一 圖象采集與加工：圖象采集與加工：二二 斑點檢測斑點檢測三三 斑點匹配斑點匹配四

5、四 數(shù)據(jù)分析及輸出數(shù)據(jù)分析及輸出PDQuest 軟件的使用http:/ 圖象采集與加工(editing images)1、掃描：凝膠染色后用清華紫光掃描儀掃描，透射模式，凝膠染色后用清華紫光掃描儀掃描，透射模式，全彩全彩RGB,RGB,分辨率為分辨率為400dpi-800dpi400dpi-800dpi，盡量排除氣泡，文件以，盡量排除氣泡，文件以tifftiff格式格式保存。保存。2、圖片加工：l在在PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析軟件中打開以分析軟件中打開以tifftiff格式保存的文件可以格式保存的文件可以。（單擊“打開文件”圖標(biāo)和“File”菜單并選擇“OpenOpen”

6、命令，選擇保存2-D圖象文件的磁盤、路徑和文件名，雙擊文件名或單擊“Open”以打開2-D圖象文件，此時tiff格式保存的文件會自動另外創(chuàng)建一個為PDQUEST 2-D分析軟件自定義的文件格式2D 2D ScanScan。）l單擊工具欄上的單擊工具欄上的control thecontrol the image displayimage display 圖標(biāo)，會出圖標(biāo)，會出現(xiàn)一個對話框，通過改變此對話框的現(xiàn)一個對話框，通過改變此對話框的High High 和和LowLow的值以改變明的值以改變明亮度。亮度。l用工具欄的用工具欄的crop可以切割掉凝膠邊緣沒有蛋白質(zhì)點的部分，以減可以切割掉凝膠邊緣

7、沒有蛋白質(zhì)點的部分，以減少分析的復(fù)雜性，但要注意對你要分析的多塊凝膠圖像最好是切割少分析的復(fù)雜性，但要注意對你要分析的多塊凝膠圖像最好是切割成同樣大小。成同樣大小。（在操作時先選擇其中的一個凝膠圖象并選定要切割的區(qū)域，然后（在操作時先選擇其中的一個凝膠圖象并選定要切割的區(qū)域，然后在在imageadvance cropsave crop settingsimageadvance cropsave crop settings下保存下保存cropcrop的設(shè)定條件的設(shè)定條件并輸入保存的名稱，其他的圖象切割時在并輸入保存的名稱，其他的圖象切割時在imageadvance imageadvance cr

8、opload crop settingscropload crop settings中選定先前保存的名稱即可中選定先前保存的名稱即可 ）二 、斑點檢測(spots detection)圖象采集與加工后就要進行斑點檢測，圖象采集與加工后就要進行斑點檢測，PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析軟件通過一個稱之為分析軟件通過一個稱之為“蛋白質(zhì)斑點檢測向?qū)У鞍踪|(zhì)斑點檢測向?qū)В╯pot identification wizardspot identification wizard）”的程序來實現(xiàn)的程序來實現(xiàn)的。的。l單擊“spot”菜單，選擇“spot identification wizar

9、d”程序。l該程序首先需人工設(shè)定檢測參數(shù)如最小斑點、最弱斑點、最大斑點、最小斑點和背景值,然后程序進行自動檢測并可調(diào)節(jié)檢測的靈敏度，若檢測效果不理想，該步驟可反復(fù)進行。程序允許人工調(diào)節(jié)脫尾（streaks）、背景、斑點（speckles）和其他一些選項等。l這些參數(shù)設(shè)好后單擊Find spot centers,其結(jié)果在凝膠圖象會顯示檢測到的斑點會用“ 字（Spot Crosshairs）”表示，檢測的蛋白質(zhì)斑點應(yīng)盡量與肉眼觀測的相符。檢測的蛋白質(zhì)斑點應(yīng)盡量與肉眼觀測的相符。l在Parameter Set 項輸入保存的名稱，蛋白質(zhì)斑點的參數(shù)可被保存，并能用保存的參數(shù)自動檢測所有2-D凝膠中蛋白質(zhì)

10、斑點，單擊Process all gels，會出現(xiàn)一個Auto-detect spots窗口，其中可以選擇需要進行斑點檢測的凝膠圖象（這些凝膠圖像需事先打開）。l蛋白質(zhì)斑點檢測完了之后，軟件會自動創(chuàng)建另外兩種格式分別為gel image 和和gel spot。l由于在進行斑點檢測時會錯誤的識別一些蛋白質(zhì)斑點，比如將一些污染的非蛋白質(zhì)點識別為蛋白質(zhì)點、將本來是一個蛋白質(zhì)點識別為兩個蛋白質(zhì)點或者反之。所以在匹配之前最好進行處理，同時將gel scan 、gel image 和gel spot圖打開，然后單擊edit spot tool，出現(xiàn)一個對話框，此對話框中有增加斑點（make a spot

11、at cursor）, 刪除斑點（remove spot at cursor）,合并斑點（combine spot in box）等圖標(biāo)，可根據(jù)你的目的而選擇其中一個圖標(biāo)進行相應(yīng)的斑點處理。這些處理只能在gel image圖象中處理，但相應(yīng)的在gel spot圖象中會同時得到顯示。三 、斑點匹配(Matching spots)u蛋白質(zhì)斑點檢測完了之后，為了比較和分析不同凝膠中蛋白質(zhì)斑點的改變，PDQUEST 可以建立一個建立一個Matchset。單擊matchcreat matchset, 出現(xiàn)一個Matchset的對話框，輸入文件名稱，保存路徑，選擇（select）或上載（load）gel

12、spot 圖像的文件名，然后單擊creat, 出現(xiàn)一對話框，選擇其中的一個圖象做為參考圖象（standard member）, 整個Matchset用單個窗口（signal window）來表示，其中的亞窗口（subwindow）分別用來表示參考圖像（用REF來表示）和成員膠（member gel）圖像。Matchset 建成后，接著便是建成后，接著便是設(shè)立標(biāo)志點（landmark）,它的作用是對整個它的作用是對整個凝膠上蛋白質(zhì)斑點進行排列（凝膠上蛋白質(zhì)斑點進行排列（align）與定位（）與定位（position）以便進行匹配）以便進行匹配（match）。）。單擊工具欄中的單擊工具欄中的mat

13、ch toolsmatch tools圖標(biāo)會出現(xiàn)一個窗口，其中有圖標(biāo)會出現(xiàn)一個窗口，其中有 landmark, landmark, unlandmark, match gel, match all gelsunlandmark, match gel, match all gels等斑點匹配的工具等斑點匹配的工具, , 在在matchmatch菜單中也有菜單中也有這些工具。這些工具。標(biāo)志點應(yīng)選擇分辨良好，且所有成員膠上均出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點，并盡量避開標(biāo)志點應(yīng)選擇分辨良好，且所有成員膠上均出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點，并盡量避開蛋白質(zhì)斑點聚集的地方，最好在不同的放大倍數(shù)下確定該蛋白質(zhì)斑點為所有蛋白質(zhì)斑點聚集的地

14、方，最好在不同的放大倍數(shù)下確定該蛋白質(zhì)斑點為所有成員膠上同一個蛋白質(zhì)斑點。至少要設(shè)立兩個標(biāo)志點后便可利用成員膠上同一個蛋白質(zhì)斑點。至少要設(shè)立兩個標(biāo)志點后便可利用PDQUESTPDQUEST的自的自動匹配功能來完成不同凝膠上的蛋白質(zhì)斑點的匹配了。動匹配功能來完成不同凝膠上的蛋白質(zhì)斑點的匹配了。一般設(shè)立的landmark斑點個數(shù)為總斑點的10%左右，要用肉眼檢查每一個應(yīng)該能匹配上的斑點是否匹配上了。u對錯誤匹配的蛋白質(zhì)斑點或沒有識別到的匹配可進行手工方式編輯。在這里也可以進行編輯斑點功能，單擊viewinterchange all images, 這樣所有的成員膠和參考膠有Gel spot 狀態(tài)下

15、變成了Gel image, 而在Gel image 狀態(tài)下可進行Edit Spot Tools 以編輯蛋白以編輯蛋白質(zhì)斑點質(zhì)斑點。標(biāo)志點以綠色三角標(biāo)記，每塊膠上匹配上的蛋白質(zhì)標(biāo)志點以綠色三角標(biāo)記，每塊膠上匹配上的蛋白質(zhì)斑點以斑點以綠色字母綠色字母標(biāo)記，沒有匹配上的蛋白質(zhì)斑點用標(biāo)記，沒有匹配上的蛋白質(zhì)斑點用紅紅色圈色圈來標(biāo)記，即是有無差異表達的蛋白質(zhì)點。來標(biāo)記，即是有無差異表達的蛋白質(zhì)點。 四 、數(shù)據(jù)分析及輸出（analysis and report）為了分析蛋白質(zhì)斑點之間差異表達，PDQUEST提供了多個分析程序，包括蛋白質(zhì)斑點量量(Quantity)分析分析，散點圖工具（Satter Plo

16、t Tool） ,量的柱狀圖分析（Graph）等在內(nèi)的多種分析程序。量的分析量的分析打開Matchset，單擊DatabaseAnalysisCreate Analysis Set, 然后再單擊參考圖，就會出現(xiàn)一個對話框, 輸入名字（Name）, Type有多種選項,要做量的比較就選Quantitative。比較（比較（Compare）形式有兩種，一種是）形式有兩種，一種是Gel, 可以單個的膠兩兩互相比可以單個的膠兩兩互相比較較(只能是成員膠和參考膠進行比較只能是成員膠和參考膠進行比較)，另一種是，另一種是Group，可以將同一樣，可以將同一樣品的多塊膠做為一組（這在品的多塊膠做為一組（這在

17、Database Replicate GroupCreate Group下可以創(chuàng)建組），然后再組之間兩兩比較。然后再選擇下可以創(chuàng)建組），然后再組之間兩兩比較。然后再選擇A 和和B，分別表示兩塊膠或者是兩組膠。分別表示兩塊膠或者是兩組膠。Replicate Group在在Select Spots Which are 中可以選擇中可以選擇Increased, Increased or Decreased 或者是或者是Decreased 等，激活選項后可以輸入倍數(shù)等，激活選項后可以輸入倍數(shù)關(guān)系關(guān)系, 默認的是默認的是2 times, 可以輸入其他數(shù)值，可以輸入其他數(shù)值， 如如3 times。參數(shù)設(shè)。

18、參數(shù)設(shè)好后就單擊好后就單擊go, 在參考膠上就會出現(xiàn)黃色圈標(biāo)記的蛋白質(zhì)斑點，如在參考膠上就會出現(xiàn)黃色圈標(biāo)記的蛋白質(zhì)斑點，如果你選擇是果你選擇是Increased BA 2 times, 那么這些那么這些黃色圈標(biāo)記的蛋白蛋白質(zhì)斑點即為在量上質(zhì)斑點即為在量上B大于大于A 兩倍的蛋白質(zhì)點兩倍的蛋白質(zhì)點.為了矯正銀染對蛋白質(zhì)點定量分析的影響，所有點的含量通過單個點為了矯正銀染對蛋白質(zhì)點定量分析的影響，所有點的含量通過單個點的光密度值比上膠上所有點光密度質(zhì)而正?；墓饷芏戎当壬夏z上所有點光密度質(zhì)而正?；∟ormalize）, 單擊單擊EditNormalize, 出現(xiàn)一對話框，選擇左上角出現(xiàn)一對話框，

19、選擇左上角Enable Normalize，下面，下面的窗口被激活，在的窗口被激活，在Basis下選擇下選擇Total of all Valid Spots, 在在Scaling下選下選擇擇PPM(1000000), 然后單擊然后單擊 go。這樣所有的點都正?；?。這樣所有的點都正?；∟ormalize）了。了。歸一化歸一化 Normalization散點圖工具散點圖工具 Scatter plot單擊單擊Reports 下的下的Scatter plot，會出現(xiàn)散點圖分析的對話框，可以選，會出現(xiàn)散點圖分析的對話框，可以選擇擇x, y軸，分別代表一塊膠，軸，分別代表一塊膠，Markers 下可以

20、選擇倍數(shù)，下面的散點圖下可以選擇倍數(shù)，下面的散點圖即顯示了兩個即顯示了兩個2-D膠圖像中蛋白質(zhì)點之間的相關(guān)性，上面會顯示二者的膠圖像中蛋白質(zhì)點之間的相關(guān)性，上面會顯示二者的相關(guān)系數(shù)，如果相關(guān)系數(shù)大于相關(guān)系數(shù)，如果相關(guān)系數(shù)大于0.4，說明二者有較大的相關(guān)性，如果小于，說明二者有較大的相關(guān)性，如果小于0.4大于大于0.2, 說明相關(guān)性較小，小于說明相關(guān)性較小，小于0.2, 說明沒有相關(guān)性。在說明沒有相關(guān)性。在Reports Scatter plots 下可以將所有的凝膠圖之間的相關(guān)圖都打印出來。下可以將所有的凝膠圖之間的相關(guān)圖都打印出來。量化柱狀圖量化柱狀圖 Graphs單擊單擊ReportsMo

21、re GraphsPage Graphs, 在有邊會出現(xiàn)一對化在有邊會出現(xiàn)一對化框，顯示所有蛋白質(zhì)點在不同膠上的框，顯示所有蛋白質(zhì)點在不同膠上的量化柱狀圖，如果要顯示所要，如果要顯示所要分析的蛋白質(zhì)點的量化柱狀圖，則在對話框的分析的蛋白質(zhì)點的量化柱狀圖，則在對話框的Input下選擇下選擇Analysis set, 出現(xiàn)一對話框，然后選擇分析的名稱即可。在出現(xiàn)一對話框，然后選擇分析的名稱即可。在ReportsQuantity Graphs下可輸出所有的蛋白質(zhì)點（下可輸出所有的蛋白質(zhì)點（All Match Spots）或者是特定分析的蛋白質(zhì)點（）或者是特定分析的蛋白質(zhì)點（Specificd Ana

22、lysis Set）在）在不同膠上的量化柱狀圖。不同膠上的量化柱狀圖。應(yīng)用材料：無腔眼金魚胚胎正常眼金魚胚胎差異點：差異點：量化柱狀圖：量化柱狀圖：2D Gel DatabaseslBiobase Biobase 角質(zhì)形成細胞角質(zhì)形成細胞, ,膀胱癌等膀胱癌等 ( (丹麥丹麥Center for Genome Research) Center for Genome Research) http:/biobase.dk/cgi-bin/celishttp:/biobase.dk/cgi-bin/celislECO2DBASE ECO2DBASE 大腸桿菌大腸桿菌 ( (在在NCBINCBI庫中庫

23、中) ) /respository/ECO2DBASE/respository/ECO2DBASElHeart-2DPAGE Heart-2DPAGE 人心肌人心肌 ( (德國柏林德國柏林) ) http:/www.chemie.fu-berlin.de/user/pleisshttp:/www.chemie.fu-berlin.de/user/pleisslHSC-2DPAGE HSC-2DPAGE 人類心臟人類心臟 ( (英國英國Harefield, Heart Science Center) Harefield, Heart Science Center) http:/www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.htmlhttp:/www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.htmllLSB LS