實驗九 DNA的酶切

1、實驗九 DNA的酶切一、原理 1三類限制酶 限制酶特異地結(jié)合于其識別的特殊DNA序列之內(nèi)或附近的特異位點上，并在此切割雙鏈DNA。限制酶可分為3類。I類和類限制酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有修飾(甲基化)作用及依賴于ATP的限制性酶切活性。類限制酶在識別序列上切割DNA，然后從底物上解離。而I類限制酶結(jié)合在識別序列上，但卻隨機地切割回轉(zhuǎn)到被結(jié)合酶處DNA。 在基因工程中I類和類限制酶都不常用。常用的是I類限制酶。 2類限制酶 類限制酶又可分為二種酶，一種是限制性內(nèi)切酶，它切割裂一特異性的核苷酸序列；另一種為獨立的甲基化酶，它使識別序列甲基化。 基因工程中常指的限制酶或限制性內(nèi)切酶就是第一種I類限制酶

2、。 3限制性內(nèi)切酶 (1)識別序列一般為回文對稱型，如EcoR I識別序列為： 5GAATTC3 3CTTAAG5對稱軸兩則等距離的堿基兩條互補鏈識別序列完全一樣。(2)識別序列長度大多數(shù)為46個核苷酸。(3)切割方式兩種A錯位切割 大多數(shù)限制性內(nèi)切酶不在識別序列的對稱軸上切割DNA鏈，而在偏離對稱軸數(shù)個核甘酸處切割。 錯位切割所產(chǎn)生的DNA末端，兩條鏈不平齊，一條鏈凸出，一條鏈凹進，這種末端稱為粘性末端(Cohesive Ends)。帶有相同粘性末端的DNA分子很容易在末端互補配對，連接成新的重組分子。B.沿對稱軸切割，一些酶在對稱軸處切割，產(chǎn)生平齊末端(Blunt Ends)。 (4)同裂

3、酶(同切口限制性內(nèi)切酶) 一般說來，不同的限制性內(nèi)切酶識別不同的序列。然而有一些從不同來源分離的酶能在相同靶序列切割。這些酶稱為同裂酶(Ischizomers)。 有些識別四核苷酸序列的酶識別序列在另一種六核苷酸識別序列之內(nèi)，如MboI和Sau3A I，識別序列在BamHl之內(nèi)。兩種酶切割反應要求最嚴的成分是底物DNA，酶要產(chǎn)物直接受DNA底物純度的影響。提取過程中的酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl均能干擾反心，有些甚至改變識別序列 兩種酶切割后得到相同末端所以這兩種酶產(chǎn)生的片段可以連接。 (5)來源及命名 一般采用Smith和Nathans(1973)提出的方法對限制性內(nèi)切酶進行命

4、名，以產(chǎn)生該酶的微生物屬名的第一個字母(大寫)種名的前兩上字母(小寫)，以及菌株型號或質(zhì)粒、噬菌體名稱組成。例如，從Bacillus amyloliqu-faciens H中提取的性內(nèi)切酶稱為BamH：從Haemophilus influenzae Rd中提取的限制性內(nèi)切酶成為Hand；從Escherichia ColiRT中提出的酶稱為EcoR(大腸桿菌耐藥質(zhì)粒R1)。在同一型號細菌中的幾種不同酶可以編成不同的號，如Hind、Hind、HpaI、Hpa、MboI、Mbo等。 (6)限制性內(nèi)切酶的星活性 一般來說，限制性內(nèi)切存在嚴格的識別在序列特異性，但某些條件改變，會使其對識別序列特異性的放

5、寬，而導致在DNA內(nèi)產(chǎn)生附加切割，限制性內(nèi)切酶表現(xiàn)的這種活性稱為星活性，或第二活性，在名稱右上角加一星號表示。產(chǎn)生星活性的條件甘油濃度離子強度 高鹽緩沖液酶降低鹽pH值 7.585產(chǎn)生有機溶劑 DMSO(二甲亞砜)12%(V/V)二價陽離子Mn2+代替Mg2+酶與DNA的比例 酶與DNA比為(50Ug)產(chǎn)生星活性。為了防止星活性的出現(xiàn)，所有限制性內(nèi)切酶反應在標準條件下(特別是pH、離子強度、二價離子濃度的條件下)進行。 某些限制性內(nèi)叨酶誘導產(chǎn)生星活性的反應條件 酶 誘導星活性條件AvaI A,B,DEcoRI A,B,D,E,FHae B,DHhaI B,D,GBamHI A,B,C,D,E,

6、HA乙二醇(45)；B.甘油(1120)；C.乙醇(12)；D高酶：DNA比值()25Ug)；EMn2+代替Mg2+；FpH85；GDMSO(8)；H無NaCl4影響限制性內(nèi)切酶反應的因素限制性內(nèi)切酶能否有效、特異地切割DNA，最關(guān)鍵的因素有(1)底物DNA的純度與物理特性A純度酶切反應要求最嚴的成分時底物DNA，酶要產(chǎn)物直接受DNA底物純度的影響。提取過程種的酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl均能干擾反應，有些甚至改變識別序列特性，處理辦法為酶切前透析或乙醇沉淀。B、DNA濃度DNA濃度太稀、加量大，含有EDTA影響結(jié)果。C、識別序列位點，及與其相鄰的特異性。限制性內(nèi)切酶對DNA序列

7、顯示高度特性，因此，識別序列內(nèi)核苷酸的甲基化或糖苷化都會影響酶切反應，識別位點接近末端的程度也影響切割，如EcoRI要求識別序列后在末端至少有一個堿基存在才能切割。各種內(nèi)切酶對識別序列處于末端位置時的切割效率不同，下表列出了用20U常用內(nèi)切酶在20對0.1A260單位接近末端識別序列的切割效率。表4 常用內(nèi)切酶對識別序列接近末端的DNA的切割效率AccI GGTCGACC 8 0 0CGGTCGACCG 10 0 0 CCGGTCGACCGG 12 0 0Afi CACATGTG 8 0 0 CCACATGTGG 10 >90 >90 CCCACATGTGGG 12 >90

8、>90AscI GGCGCGCC 8 >90 >90 AGGCGCGCCT 10 >90 >90 TTGGCGCGCCAA 12 >90 >90AvaI CCCCGGGG 8 50 >90 CCCCCGGGGG 10 >90 >90 TCCCCCGGGGGA 12 >90 >90BamHI CGGATCCG 8 10 25 CGGATCCCG 10 >90 >90 CGCGGATCCGCG 12 >90 >90BgL CAGATCTG 8 0 0 GAAGATCTTC 10 75 >90 GG

9、AAGATCTTCC 12 25 >90BssHI GGCGCGCC 8 0 0 AGGCGCGCCT 10 0 0 TTGGCGCGCCAA 12 50 >90BstE GGGT(A/T)ACCC 9 0 10 D、DNA的二級/三級結(jié)構(gòu)識別/切割位點的二級和三級也影響酶切效率，切割超螺旋比線狀需要更多的酶。（2）反應系統(tǒng)A、緩沖液 pH、Na+離子B、金屬離子Mg+C、甘油能使酶穩(wěn)定，防止長期低溫（-20）保存時發(fā)生凍結(jié)。甘油會使很多酶的識別特異性下降，酶要反應含甘油量應低于5%。（3）反應體積：酶濃度EDTA（4）保溫時間與溫度 DNA濃度。二、方法1、制備pUC57質(zhì)粒DN

10、A。2、對pUC57質(zhì)粒DNA進行定量，并調(diào)整至0.2g/l.3、用EcoRV酶解pUC57DNA。取一支0.5ml微離心管，加入：pUC57DNA（0.2g/l） 75.0l10×EcoRV緩沖液 1.8lDecor（10U/l） 1.0l加ddH2O至 100l10000r/min離心5s混勻，37水浴60min。3、取酶解樣品，按下表點樣，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶解效果，如果酶解不完全，繼續(xù)酶解。酶解樣品電泳鑒定點樣表DNA樣品表 樣品量 電泳緩沖液量 點樣緩沖液量pUC57酶切樣品 6.0l 1.5l 1.5lpUC57質(zhì)粒DNA 6.0l 1.5l 1.5lDNA/E

11、coR+Hind 1.5l 6.0l 1.5l以50電壓電泳30分鐘，在透射式紫外分析儀上觀察、記錄電泳結(jié)果。如果酶解完全，酶解樣品應為一條線性帶。4.電泳鑒定確認酶解完全后，6510分鐘滅活EcoRV，終止酶解反應。三、試劑1. EcoRV內(nèi)切酶2. EcoRV內(nèi)切酶10×緩沖液成分為：60mmol/L Tris-HCL (pH7.9)1.5mmol/L NaCl60mmol/L MgCl210mmol/L DTT。3.電泳緩沖液40mmol/L Tris-HCl(pH8.0)20mmol/L NaAC2mmol/L EDTA 配制方法：先配50倍電泳緩沖液，用時取5ml，重蒸水稀

12、釋至250ml。50倍電泳緩沖液配制方法：Tris 121.1g無水NaAC 41.0gEDTA·Na2 18.6g先用400ml重蒸水加熱攪拌溶解后，再用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至8.0（大約25毫升）然后加蒸水定容至500ml。1.1kg/cm2滅菌20分鐘。4.溴酚藍指示劑稱取溴酚藍200mg，加重蒸水10ml，在室溫下過夜，待溶解后再稱取蔗糖50g，加蒸餾水溶解后移入溴酚藍溶液中，搖勻后加重蒸水定容至100ml，加10mol/L NaOH 12滴，調(diào)至藍色。5.EB：(10mg/ml溴化乙錠)配制方法：溴化乙錠 1g ddH2O 100ml6.瓊脂糖7.DNA /EcoR+Hind分子

13、量標準物：21226，5148，4973，4268，3530，2027，1904，1584，1375，947，831，564四、說明 1酶切時所用DNA的量根據(jù)不同需要可有所增減。切點增多，所用DNA量亦相應增加。但是，所用DNA溶液的體積不能太大，否則，DNA溶液中其他成分會干擾酶反應和電泳。 2酶活性通常用酶單位表示，酶單位的定義是：在最適反應條件下，l小時完全降解1gDNA的酶量為一個單位。但是，許多實驗室制備的DNA不象DNA那樣易于降解，需適當增加酶的用量。職有必要，可以用不同的酶量做試驗，以決定最適酶量。反應液中加入過量的酶不合適，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的連接反

14、應。 3.市售內(nèi)切酶般濃度很大，為節(jié)約起見，使用前，可事先用酶反應緩沖液(1x)進行稀釋。另外，酶通常保存在50的甘油中，實驗時，應將反應液中甘油濃度控制在110之下，否則，酶活性將受影響。 4.延長反應時間，通?？梢杂?；補酶量的不足，但是這對一部分酶不適用，隨著反應時間的延長，這些酶的活性迅速下降。 5.在制作酶切圖譜時，有時需要用二種酶切割DNA樣品，如果這兩種酶反就條件一致，可將酶一起加入反應液。如果二種酶所需緩沖液不同，可采用下列方法： a將要求低鹽濃度緩沖液的酶先反應，然后加入適量的鹽溶液和第二種要求較高鹽濃度緩沖液的酶。 b第一個反應在較小的體積下進行，然后用第二種酶要求的緩沖液稀釋。 c第個反應完成后，用等體積酚氯仿處理，水相加0.1倍體積3molL醋酸鈉和2倍體積無水乙醇，混勻后置-70低溫冰箱30分鐘，離心，干燥后進行第二個反應。 d有些生產(chǎn)酶的公司，對雙酶同時反應進行了研究，對雙酶反面提出了推薦使用的緩沖液使用所推薦的種緩沖液，可同時用二種酶對DNA進行酶切， 6從冷藏處取出酶（包括各種工具酶)，應立即放人冰水中。每次均應用清潔和消毒的吸管應避免限制酶被DNA或其它酶所污染。酶自冰箱取出后，應迅速操作將酶立即放回冷凍處， 7如果酶切反應體積太大電泳凝膠槽中裝不下時，可用下列方法濃縮DNA：加入EDTA3體積及