G418篩選細(xì)胞(整合版)

1、G418篩選細(xì)胞G418簡介：G418是一種氨基糖甘類抗生素，在分子遺傳試驗(yàn)中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩 選試劑。白色粉末，融點(diǎn)138144 C,溶于水、甲醇。CAS No.: 108321-42-2分子式：C20H40N4O10?2H2SO4分子量：692.71儲(chǔ)運(yùn)室溫下運(yùn)輸，干粉在室溫下儲(chǔ)存，溶液于-20 C儲(chǔ)存。G418工作原理：它通過抑制轉(zhuǎn)座子Tn601, Tn5的基因，干擾80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成， 對原核和真核等細(xì)胞都有毒性，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也包括 原生動(dòng)物和蠕蟲。細(xì)菌Tn5轉(zhuǎn)座子序列（neo抗性基因）攜帶的氨基糖甘磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將 G418 轉(zhuǎn)變成無毒

2、形式。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后，則能啟動(dòng) neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA,從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖甘磷酸轉(zhuǎn)移酶的高 效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有 G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。利用G418篩選細(xì)胞:1、準(zhǔn)備工作在篩選之前，一定要確定你的細(xì)胞對這一批G418的最佳篩選濃度。每種細(xì)胞對G418的敏感性不同，一般變動(dòng)在 100ug/ml1000ug/ml范圍。分子克隆給出的幾個(gè)常用細(xì)胞系所需G418的最佳用量:細(xì)胞系或機(jī)體G418 濃度（ug/ml ）中國倉鼠卵巢細(xì)胞700800Madin-Darby犬腎細(xì)胞500人上皮A431細(xì)胞400猿CV-1細(xì)胞500盤基網(wǎng)柄菌屬1

3、035植物10酵母1255002、確定最佳篩選濃度最適用量通過建立細(xì)胞死亡曲線獲得。將細(xì)胞稀釋至1000cell/ml,每孔100ul加入有培養(yǎng)基的24孔板。 G418濃度稀釋至 0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/m2個(gè)級別，培養(yǎng)10-14天，以細(xì)胞全部死亡最低濃度為基準(zhǔn)，一般400-800左右。篩選時(shí)比該濃度再高一個(gè)級別，維持時(shí)使用篩選濃度的一半即可。匯合度對G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)匯合度不宜超過50%!3、加藥時(shí)間一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開始加G418篩選（由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后 要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)

4、。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染 了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增殖較慢，時(shí)間長了就會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入 的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克?。?。每35d更換一次含有G418的篩選液（因?yàn)殡S著細(xì)胞的代謝 G418的濃度和活 性都會(huì)下降），這時(shí)藥物濃度可以降至200ug/mL4、培養(yǎng)液的使用加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡：精品非選擇性死亡：死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)， 導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽 性細(xì)胞死亡。精品 陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡：孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號會(huì)變得很弱，導(dǎo)致陽性細(xì)胞死亡這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液： 轉(zhuǎn)染前， 在細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液

5、，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1： 1 混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。5、挑選單克隆的優(yōu)化（篩選陽性克?。┠康模罕M量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響；增加陽性克隆的得率。方法：加藥后，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽性克隆下用記號筆做個(gè)標(biāo)記。之后：套環(huán)法（結(jié)合有限稀釋法）：用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或 EDTA 消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的孔中培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。刮除法（結(jié)合有限稀釋法）：刮除陰性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96 孔板中篩選。6

6、、鑒定之后一般經(jīng)過4 周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了，而且是隨機(jī)整合，會(huì)導(dǎo)致表達(dá)的目的蛋白的量產(chǎn)生很大差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達(dá)目的基因的細(xì)胞會(huì)占據(jù)優(yōu)勢，強(qiáng)表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞會(huì)越來越少。這樣再次篩選是必不可少的。 只有經(jīng)過2 次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強(qiáng)分泌目的蛋白的，遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。細(xì)胞克隆 有限稀釋法有限稀釋法采用梯變倍數(shù)稀釋的原則，將稀釋的細(xì)胞懸液接種于微孔培養(yǎng)板中（也可在板上的96孔中直接稀釋）培養(yǎng)一定時(shí)間后，孔中可出現(xiàn)單個(gè)

7、細(xì)胞克隆。本法不需特殊設(shè)備，操作簡單快速，適合大大批量克隆化培養(yǎng)?，F(xiàn)已廣泛用于異質(zhì)性細(xì)胞系的克隆化培養(yǎng)、誘導(dǎo)和分離，如耐藥性細(xì)胞株或高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株或突變細(xì)胞株以及單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的克隆篩選中。取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成懸液（貼壁細(xì)胞用0.25%夷蛋白酶消化后吹打分散制成） ，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，測定活細(xì)胞數(shù)及濃度（細(xì)胞存活率及單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)高于90%以上）。將細(xì)胞懸液在試管中稀釋，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至 50個(gè)/ml、10個(gè)/ml、5個(gè) /ml ,將3種稀釋度的細(xì)胞分別接種于 96孔板中，每孔100仙l于37 C、5% CO2 下培養(yǎng)。次日在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞數(shù)，挑選只含一個(gè)細(xì)胞的孔，做好標(biāo)記并補(bǔ)加100仙培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，