重組蛋白質(zhì)純化技術(shù)進展

1、重組蛋白質(zhì)純化技術(shù)進展作者：佚名 科研信息來源：本站原創(chuàng) 點擊數(shù)： 163 更新時間：2002-11-20關(guān)鍵詞：重組蛋白質(zhì)；分離；純化；層析；色譜健康網(wǎng)訊：摘要 90年代以來，基因重組技術(shù)得到很大的發(fā)展，基因工程產(chǎn)品的分離純化的成本約占其全部成本的60%80%，因此重組蛋白的分離純化技術(shù)越來越重要。著重介紹了擴張柱床吸附層析技術(shù)，徑向膜層析技術(shù)，灌注層析技術(shù)，液液萃取技術(shù)，置換層析技術(shù)和金屬螯合親和層析技術(shù)近年來進展情況以及它們的優(yōu)缺點和應用范圍。近年來隨著對蛋白質(zhì)的研究和生產(chǎn)的需要，基因重組技術(shù)突飛猛進，出現(xiàn)了很多基因工程產(chǎn)品，深刻地影響人類自身及其環(huán)境。而作為基因工程技術(shù)的下游工程中的基

2、因重組蛋白的分離純化技術(shù)越來越顯示其重要性。據(jù)有人統(tǒng)計，基因工程產(chǎn)品的分離純化成本約占到其全部成本的60%80%。因此越來越多的生物工作者從事重組蛋白的分離純化工作。 重組蛋白可在E.coli、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞等體系中得到高效表達，其表達形式一般可分為：（1）細胞外的分泌表達；（2）細胞內(nèi)可溶性表達；（3）細胞內(nèi)不溶性表達，即產(chǎn)物以包涵體的形式存在。因此對于重組蛋白的純化要依據(jù)其表達形式的不同，采取不同的純化工藝。例如，當重組蛋白以包涵體形式存在時，就需要對包涵體進行變復性處理。然而不論以那種表達形式產(chǎn)生的重組蛋白，其純化的方法都與傳統(tǒng)的生物大分子分離方式相似。與傳統(tǒng)方式相似，重組蛋白

3、的分離純化也是利用其物理和化學性質(zhì)的差異，即以分子的大小，形狀，溶解度，等電點，親疏水性以及與其它分子的親和性等性質(zhì)建立起來的。與此相對應的分離純化方法參見表1。從表1可看出，當前蛋白質(zhì)的純化主要是依靠層析和電泳技術(shù)。由于重組蛋白在組織和細胞中仍以復雜混合物的形式存在，因此到目前為止還沒有一個單獨或一整套現(xiàn)成的方法把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合物中分離出來，而只能依據(jù)目標蛋白的物理化學性質(zhì)摸索和選擇一套綜合上述方法的適當分離程序，以獲得較高純度的制品。表1 蛋白質(zhì)物化性質(zhì)和分離純化方法蛋白質(zhì)的 分離純化方法物理和化學性質(zhì) 分子的大 密度梯度離心 、超濾、透析、分子篩層析小和形狀 等等電點和 制備

4、電泳、等電聚焦層析（或電泳）、離子交電荷 換層析、吸附層析等溶解度 鹽溶、鹽析、有機溶劑沉淀、等電點沉淀、液液萃取技術(shù)等與其它分子 親和層析、金屬螯合親和層析、共價層析等的親和性親疏水性 疏水層析、反相層析等90年代以來，國內(nèi)外許多科學工作者在蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)和工藝上進行了大量的研制和開發(fā)，將原有的純化技術(shù)水平提高到一個新的高度。本文將著重介紹近10年來重組蛋白分離純化中常用方法的新進展和一些新出現(xiàn)的技術(shù)。常規(guī)液相層析技術(shù)的新進展液相層析技術(shù)是目前蛋白質(zhì)分離中最常用的技術(shù)之一，在基因工程產(chǎn)品下游處理中占有主要的地位。近年來對這項技術(shù)的改進主要放在純化操作系統(tǒng)的性能改進和載體介質(zhì)的性能提高上。

5、下面就以Amersham Pharmacia Biotech公司為代表，介紹該公司在90年代新推出的操作系統(tǒng)和一些載體。近年來該公司在對80年代發(fā)展起來的快速蛋白液相層析系統(tǒng)（FPLC）進行了進一步改進，在 90年代推出其新型機型-AKTA系統(tǒng)。其主要特點有：（1）該系統(tǒng)配有計算機及與系統(tǒng)硬件相配合的一套人工智能軟件，預裝有80種柱的預編程序，其操作菜單簡便易于設定，可以使整個系統(tǒng)全自動化工作，極大地提高工作效率。（2）所配有的高壓動力雙泵體系不僅可以提供以往FPLC系統(tǒng)的中壓、低壓，而且可以提供HPLC 的高壓。因此流速范圍較大，可以運用的柱型多，既可以用于實驗室的分析摸索階段，又可以應用于

6、生物工程制品下游的中試和生產(chǎn)。（3）具有自動緩沖液制備功能-BufferPrep。通過這一功能只需準備4瓶存儲液體，包括水、酸/堿。鹽溶液和緩沖儲備液，系統(tǒng)會考慮緩沖液的pKa 值自動對鹽及pH進行補償，可以在線快速制備出各種pH/鹽濃度緩沖液。這樣用戶在開發(fā)工藝時，再也不用配置大量不同的緩沖液，大大簡化了pH優(yōu)化問題節(jié)省了很多時間。（4）AKTA 系統(tǒng)還具有獨特的多波長連續(xù)檢測器，可以同時提供3個從190700nm的不同波長作連續(xù)檢測。利用這一技術(shù)，在檢測蛋白的同時，可以對具有其它波長吸收的分子進行在線鑒定。 與AKTA操作系統(tǒng)相配合，90年代Amersham Pharmacia Biote

7、ch公司還設計和改進了許多載體，為廣大的純化工作者提供了多種選擇。例如 Source系列，Mono系列，Mini系列，Supeniex系列， STREAMLINE系列等。其中Mini系列的載體介質(zhì)其平均顆粒直徑為3m，大小均一，為當前分辨率最高的離子交換介質(zhì)之一。新型設計的 Superdex凝膠載體是目前分辨率、選擇性最高的分子篩凝膠排阻過濾介質(zhì)。與過去的Sephadex 凝膠載體相比，它加強了介質(zhì)的機械強度，一改以往Sephadex軟凝膠的性質(zhì)，可以容許載體在較高的流速壓力下工作并且反壓低，克服了分子篩凝膠排阻層析時間過長的缺陷。Source系列是為生物分子的制備性分離而設計的一種低反壓高分

8、辨率凝膠介質(zhì)，顆粒大小分15m和30m兩種，完全均一。即使流速在1000cm/h以上仍保持高分辨率，因而可在數(shù)分鐘內(nèi)完成1次洗脫過程，適合作為中度和精細純化基架。以上這些新技術(shù)現(xiàn)已普遍為人們接受和運用，它代表了當前液相層析技術(shù)發(fā)展的方向和趨勢。擴張柱床吸附技術(shù)當重組蛋白的表達為包涵體形式時，表達量高，是近年來熱門的研究項目。但是包涵體需經(jīng)過一個復雜的復性過程才可進行下一步的純化工作。在復性過程中，溶液的體積放大了幾十倍，同時還伴隨有大量的不溶性懸浮物生成。當重組蛋白以分泌形式表達時，其發(fā)酵液中也存在著大量菌體碎片。這些含有不溶性是浮物或菌體碎片的溶液的處理在傳統(tǒng)工藝上都需要經(jīng)過高速離心或者過濾

9、。這不僅需要昂貴的離心設備，而且所費時間較長，往往成為基因工程產(chǎn)品下游工藝開發(fā)的限制瓶頸。最近問世的擴張柱床吸附層析技術(shù)（Expanded Bed Adsorption Chromatography Techniques）及時地為解決這一問題提供了新的途徑。 擴張柱床吸附層析技術(shù)操作原理與一般的吸附層析相似，層析柱經(jīng)過自下而上的擴張及平衡后，含菌體的發(fā)酵液或復性液從柱底部進至柱中。此時目標蛋白會吸附于凝膠上面，一些雜蛋白、菌體和不溶性的顆粒會隨液流從柱項流出，而不會阻塞其中。再通過改變洗脫條件，目標蛋白便可從柱中洗下來。經(jīng)過長時間的研究開發(fā)，Amersham Pharmacia Biotech

10、公司為擴張柱床吸附層析技術(shù)設計了名為STREAMLINE的一系列產(chǎn)品。它包括 STREAMLINE的介質(zhì)和擴張柱兩部分，其介TM質(zhì)的吸附特性主要是陰陽離子交換吸附和親和吸附。選擇性地利用這些介質(zhì)的性質(zhì)，再加上合適的緩沖液和洗脫條件，產(chǎn)品可以進行一步澄清濃縮純化。這不僅減少了樣品預處理的損失，樣品體積也不再是處理量的限制因素，在縮短純化步驟的同時，省去了大筆去購買大處理量的高速離心機及大規(guī)模膜過濾和超濾系統(tǒng)的經(jīng)費。由此可見，擴張柱床吸附層析技術(shù)針對基因工程產(chǎn)品，結(jié)合了澄清、濃縮及產(chǎn)品捕捉三個步驟為一體，突破性地直接從未經(jīng)任何預處理的樣品中捕獲靶蛋白，極大地減少了損失，降低了生產(chǎn)成本，提高了經(jīng)濟效

11、益。徑向膜層析技術(shù)傳統(tǒng)的層析技術(shù)往往采用長軸流向設計，雖然為廣大的科技工作者運用，但依然存在許多缺點：（1）流速較慢，層析耗時長效率低。（2）層析過程中壓降較大，增加了對設備的要求。（3）層析條件不易放大，若想放大規(guī)模，需重新摸索分離條件，為重組蛋白的大規(guī)模分離純化提出了難題。80年代中期國際上提出了一種稱為徑向?qū)游觯≧adial Flow Chromatography）的新技術(shù)。 80年代后期，徑向?qū)游鲇纸Y(jié)合膜分離處理量大的優(yōu)點，發(fā)展成徑向膜層析技術(shù)，在原理上解決了上述問題。徑向膜層析柱常采用螺旋卷式膜組件結(jié)構(gòu)，流動的方向是從層析柱的圓周流向往的圓心，即徑向流動。由于這一原理，與傳統(tǒng)的軸向?qū)?/p>

12、析柱相比，徑向?qū)游鲇幸韵聨讉€優(yōu)點：（1）流向的截面積加大，即使在流速高時壓降仍很低，因而純化速度快處理量大。（2）保持柱徑不變，無需改變其它分離條件，僅增加柱長就可以增加上樣量，因而有利于放大生產(chǎn)。據(jù)1999年楊利等報道，當柱床體積相差不大時，徑向?qū)游鲋牧魉伲ㄉ? 小時）和班產(chǎn)率（升/班）要比軸向柱提高33.8 倍和3倍。這一優(yōu)點對工業(yè)生產(chǎn)極為有利。徑向膜層析柱技術(shù)及其產(chǎn)品在80年代后期首先由美國CUNO公司推出，到90年代其產(chǎn)品從實驗室規(guī)模、中試規(guī)模到生產(chǎn)規(guī)模已形成系列化，膜的類型主要是離子交換型。此外，美國的 Millipore公司和Nygene公司于90年代相繼推出了以Protein

13、A為親和配基的商業(yè)化膜層析組件。我國中國科學院大連化學物理研究所國家色譜研究分析中心也緊跟這一技術(shù)潮流，經(jīng)10年攻關(guān)，在1999年前研制開發(fā)出一系列以纖維素為基質(zhì)的離子交換，親和和疏水3種類型的復合膜層析介質(zhì)和多種規(guī)格的徑向膜層析柱，為我國生物工程產(chǎn)品的分離純化提供了有效工具。預計徑向膜層析的發(fā)展方向?qū)⒅赜趯χY(jié)構(gòu)的優(yōu)化和篩選、合成新型具有更高選擇性及廣泛適用性的膜。灌注層析技術(shù)液相層析技術(shù)是生物分子分離純化的重要工具，而其中分離介質(zhì)尤為重要。在過去幾十年里，人們一直在提高液相層析的分離能力，以達到最好的分離效果。譜帶擴展是影響層析效率的主要因素之一，它主要源于流動相的粒子內(nèi)部擴散、縱向擴散

14、和溶質(zhì)擴散這3個因子，影響了固定相和流動相之間的傳質(zhì)和交換平衡速度。通常人們解決這一問題的方法是減小介質(zhì)顆粒的大小。Amersham Pharmacia Biotech公司近年來提供的Mini系列和Mono系列就是采用這一策略，顯著地提高了層析柱床的分辨效率。然而當顆粒達到3sm時，再提高分辨率就不太實際了。 1989年初美國的Dr.Frederick Regnier、Dr. Noubar Afeyan等人率先發(fā)明了具有貫穿孔的分離載體（flow-through particale）-POROS，并申請了專利。同時他們將液流通過這一載體而減小粒子內(nèi)部擴散的層析行為命名為灌注層析技術(shù)（Perfu

15、sion Chromatography）。這一技術(shù)的提出為流動相于固定相的傳質(zhì)問題的解決提供了新的方法。POROS介質(zhì)是在苯乙烯-二乙烯苯的交聯(lián)共聚物（PS-DVB）基礎(chǔ)上構(gòu)成的，其化學穩(wěn)定性和機械強度均高于傳統(tǒng)的葡聚糖、聚丙烯酸酯和硅膠等介質(zhì)。POROS為雙模式網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，在介質(zhì)上有 600800nm的貫穿孔和與之相連接的80 150nm擴散孔。這一結(jié)構(gòu)可以容許液體對流到分離介質(zhì)的內(nèi)表面，加快了流動相與固定相的傳質(zhì)速度，縮短了交換平衡所需的時間。因此這一方法打破了傳統(tǒng)的流速、分辨率和容量之間的三角關(guān)系，即在流速增加的情況下柱容量和分辨率均不會降低，且反壓也不會升高、為快速純化生物大分子提供了基

16、礎(chǔ)。Regnier等創(chuàng)建的 Perseptive Biosystems公司在1991年推出以 BioCAD為名的灌注層析系統(tǒng)，這一系統(tǒng)已于 1993年開始進入中國市場。到目前為止他們已在POROS介質(zhì)的基礎(chǔ)上發(fā)展了具有10、20和 50m3種規(guī)格，表面由25種不同的化學制成的不同載體。其所運用的范圍包括離子交換層析、疏水層析、反相層析和親和層析。據(jù)1994年夏小燕等人報道，該系統(tǒng)分離速度比傳統(tǒng)技術(shù)快10 100倍，最短僅需30秒至3分鐘就可以完成一個樣品的純化和分析工作。由于灌注層析技術(shù)的原理只是增強了傳質(zhì)的動力學過程而不改變層析的分離原理，因此它可以運用于除凝膠排阻層析之外的所有層析技術(shù)中。

17、從某種角度來說，Amersham Pharmacia Biotech公司的SOURCE系列也具有類似低反壓精細純化的作用。鑒于灌注層析技術(shù)的快速高效性能，它的推廣是蛋白質(zhì)純化技術(shù)發(fā)展的必然趨勢。液液萃取技術(shù)萃取是利用物質(zhì)在不同溶劑相的分配系數(shù)不同而達到分離效果的一種古老技術(shù)。已有大量文獻論證液液萃取技術(shù)在重組蛋白質(zhì)分離純化上也具有廣泛的應用前景。目前文獻報道液液萃取技術(shù)較多的有：雙水相萃取技術(shù)和反膠團體系萃取技術(shù)。雙水相萃取技術(shù)是近年來發(fā)展很快的一種生物分離方法，它具有活性損失小，分離步驟少的優(yōu)點。據(jù)1993年周長林等人報道，他們利用PEG磷酸酯/磷酸鹽兩水相系統(tǒng)，經(jīng)兩次萃取從E.coli勻漿

18、液中抽提重組表達的干擾素1，收率達99.6%，純度提高25倍。雙水相萃取技術(shù)常用的體系主要有兩類：高聚物/高聚物和高聚物/鹽。但是前者價格昂貴，后者因鹽濃度過高蛋白活性損失較大，且界面吸附蛋白多。近年來許多學者為了解決這一問題，探索了許多新型的萃取劑，其中變性淀粉PPT/PEG體系因價廉性優(yōu)，具有很好的應用前景。一些學者將雙水相萃取技術(shù)與膜分離技術(shù)結(jié)合起來，較好地解決了生物大分子在兩相界面的吸附和乳化作用并且加快了萃取速率。還有一些學者利用親和反應的高度專一性，在萃取劑上接上一定的親和配基，使得雙水相萃取體系不僅具有處理量大的特點，而且具有專一性，提高了萃取效率。今后，尋找廉價高效的雙水相萃取

19、體系和利用其它分離技術(shù)與雙水相萃取技術(shù)結(jié)合是這項技術(shù)的發(fā)展主流。液液反膠團（Reversed Micelles，RM）體系萃取技術(shù)是90年代以來發(fā)展較快的另一種萃取技術(shù)，是依賴表活劑液液萃取技術(shù)的一個分支。反膠團是離子型表面活性劑分散在非極性溶液中形成的，由表活劑的極性頭向內(nèi)形成一個圍繞"水核"的納米級微團。在這微團中由于表活劑極性頭的保護，可使包溶的的蛋白質(zhì)不易變性。此外反膠團萃取體系還具有操作條件溫和，對目標蛋白選擇性好，容量大和易于擴大再生產(chǎn)的優(yōu)點。當然反膠團體系萃取技術(shù)也有其不足之處，以往采用單一表潔劑AOT或季氨鹽的反膠團萃取體系易受溶液pH、溫度、離子強度和離子

20、種類等因素的影響。目前為了克服這些缺點，往往往反膠團體系中加其它表活劑作助劑或者采用陰、陽和非離子復合型表活劑的反膠團體系的方法來解決。 隨著對上述技術(shù)的不斷探索，液液萃取技術(shù)將會具有更強的生命力。置換層析技術(shù)能夠找到一種高上樣量、高生產(chǎn)率、高分辨率和易于操作的層析技術(shù)一直是人們夢寐以求的。一些沉睡中的老方法由于新技術(shù)的推動，給人們帶來了新的面孔和希望。置換層析（Displacement Chromatography）是非線形層析技術(shù)中（即被分離的物質(zhì)在流動相與固定相之間不是線性失系而是顯其它函數(shù)關(guān)系）唯一可實際應用的技術(shù)，其基本原理是利用置換劑置換出吸附在層析柱的被分離組分。此技術(shù)早在40年

21、代就由 Tiselius提出，只是在最近十幾年里，隨著高效置換劑和高效吸附劑的出現(xiàn)以及HPLC技術(shù)的發(fā)展，才顯示出其在蛋白質(zhì)制備性分離中的優(yōu)勢。置換層析與傳統(tǒng)洗脫層析都是利用樣品組分對固定相的親和能力不同將各組分分離，但兩者的工作原理卻大相徑庭。傳統(tǒng)的洗脫層析是由于各分離組分在流動相與固定相之間的分配平衡常數(shù)不同而引起的各組分在流動相的遷移速度不同達到分離目的。而置換層析的分離原理是被吸附的各組分對固定相吸附部位的直接競爭作用的結(jié)果，依據(jù)與固定相的親和性不同在置換劑的推動下，形成一系列已分離的置換序列。置換層析與傳統(tǒng)洗脫層析的比較見表2。重組蛋白質(zhì)的純化經(jīng)常會遇到如下問題，即雖經(jīng)過多次不同層析

22、技術(shù)的分離，目標蛋白中仍有無法去除的雜蛋白，這些雜蛋白在分子量大小和所帶電荷數(shù)均極為相似，有的甚至就是目標蛋白的折疊異構(gòu)物。因而極難除去，常令純化工作者頭疼。利用置換層析這一具有高分辨率的方法常常可以起到特殊的效果。1997年， Amitava Kunda和Steven Camer報道利用小分子量的置換劑將離子交換層析和分子篩層析不能分離的牛細胞色素C和馬細胞色素C完全分開。此外，置換層析的另一大優(yōu)點是在如此高的分辨率的情況下依然保持很高的上樣量，這無疑為重組蛋白的生產(chǎn)提供了有效的手段。表2 置換層析與傳統(tǒng)洗脫層析的比較- 置換層析 傳統(tǒng)洗脫層析 分離機理 被吸附分子之間對固 吸附的平衡常數(shù)不

23、同定，相親和性大小不同 導致各組分在流動相中有不同的速度洗脫峰形 矩形的平臺洗脫峰形 鐘罩形洗脫峰形上樣量 飽和吸附量的40% 飽和吸附量的5%60%樣品在洗脫 濃縮狀態(tài)分離 稀釋狀態(tài)分離后的濃度有無拖尾 無 有分辨率 極高 高誠然，目前置換層析也有許多局限性：（1）由于置換層析技術(shù)要求被分離蛋白質(zhì)附和 Langmuir吸附等溫線，如不同蛋白在同一吸附劑上的等溫線有交叉時，置換層析的分離效率就會大打折扣。（2）由于在分離過程中各組分形成相互接近的的置換序列，就會在彼此相鄰的交界處發(fā)生洗脫峰的重疊現(xiàn)象，影響樣品的回收率。（3）由于置換層析中的濃縮作用，許多蛋白質(zhì)在超過一定濃度的界限時會聚集形成沉

24、淀，造成層析柱堵塞。鑒于置換層析技術(shù)的上述特點，國內(nèi)外許多學者都認為它將成為基因工程下游技術(shù)中最有效的制備性生物物質(zhì)分離技術(shù)之一。今后的研究工作將會集中在不斷探索研制低價無毒而高效蛋白質(zhì)置換劑，適合置換層析技術(shù)的新型吸附材料上。金屬螯合親和層析的新運用目前金屬螯合親和層析（Metal-Chelate Affinity Chromatography，MCAC）所采用的螫合劑主要有兩種：一是亞氨基二乙酸（IDA），另一個是次氨基三乙酸（NTA）。它們都可以有效地與Ni、 Zn、Cu和Co等二價金屬離子發(fā)生螫合作用，從而將金屬離子牢固地結(jié)合在介質(zhì)上。在層析過程中，這些二價金屬離子又可以螫合溶液中蛋白質(zhì)分子外露的組氨酸等氨基酸殘基簇，將蛋白吸附在介質(zhì)上。洗脫時，通過改變pH，加競爭的螯合試劑等方法，依據(jù)各蛋白組分與介質(zhì)的親和程度不同將目標蛋白與雜蛋白分離。因此具有分辨率高選擇性好的特點，給分離蛋白質(zhì)帶來了很大方便。金屬螫合親和層析的另一個優(yōu)點是層析過程既可以在常規(guī)的非變性條件下進行純化又可以應用于含6mol/L鹽酸胍或8mol/L尿素的變性條件。這一優(yōu)點尤其對以包涵體形式表達的重組蛋白純化尤為有利。但是在實際應用過程中金屬螯合親和層析也遇到一些問題。在過去，金屬螫合親和層析