抗雞傳染性支氣管炎病毒多克隆抗體的制備及其生物活性的鑒定

1、中國畜牧獸醫(yī)2010年第37卷第1期生物技術65抗雞傳染性支氣管炎病毒多克隆抗體的制備及其生物活性的鑒定王衡1,2,劉博奇1,尹航1,唐麗1,任曉峰1,李廣興1(1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院,哈爾濱150030;2.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院,廣州510642)摘要:本試驗將商品化疫苗株H120雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)直接免疫大白兔進行抗IBV制備,通過瓊擴試驗及酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測其抗體效價,、blotting技術檢測了所制備多抗血清的生物活性。試驗結果表明,IBV相關抗原發(fā)生特異性結合。關鍵詞:傳染性支氣管炎病毒;中圖分類號7文章編號:167127236(2010)0120065204(I

2、B)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸傳染性疾病,以氣管啰音、咳嗽、打噴嚏為特征(甘孟侯,1999;殷震等,1997),IBV可以造成雞的產(chǎn)蛋量減少和蛋品質(zhì)下降,甚至引起死亡,成為養(yǎng)雞業(yè)中危害最大的病毒性傳染病之一。IBV在20世紀30年代發(fā)現(xiàn)于美國,目前呈世界性流行。由于IBV對養(yǎng)禽業(yè)的影響,以及病毒本身突變性,因此半個世紀以來對于IBV的各方面研究受到了廣泛的重視。在IBV研究過程中常常需要相關的抗體使試驗得以進行,在試驗的需要下,學者利用不同手段研制出了不同類型的IBV相關抗體,其中包括多克隆抗體及單克隆抗體(Mockett等,1984;夏威等,1998;Ka

3、raca等,1992;李翠等,2008;王新衛(wèi)等,2009),這些抗體有特異性好、效價高及免疫活性強的優(yōu)點,但是在制備這些抗體的過程中也都存在著步驟多、成本高及周期長的缺點。因此,本試驗嘗試采用IBVH120株弱毒疫苗制備多克隆抗體,旨在建立一種方便、快捷和高效的制備抗IBV全病毒多克隆抗體(多抗血清)方法,為收稿日期:2009208226作者簡介:王衡(1981-),男,黑龍江人,博士,研究方向:動物病理學。劉博奇(1982-),女,黑龍江人,碩士,研究方向:動物病理學。劉博奇與王衡對本文的貢獻相同。通信作者:李廣興(1968-),男,教授,博士生導師,研究方向:動物病理學。E2mail:g

4、基金項目:黑龍江省教育廳科學研究項目(10531005);黑龍江省自然科學基金重點項目(ZJN0702201)。檢測IBV全病毒粒子及IBV功能性抗原基因的表達提供檢測抗體。1材料與方法1.1試驗動物、毒株、細胞、質(zhì)粒及主要試劑健康新西蘭12月齡雄性大白兔,體重2.5kg,購自哈爾濱市某養(yǎng)殖場,自由采食,自由飲水。雞傳染性支氣管炎活疫苗(H120株),1000羽份/瓶,含傳染性支氣管炎病毒弱毒H120株至少103.5EID50/羽份,購自哈藥集團生物疫苗有限公司。傳染性支氣管炎病毒Beaudtte株、Vero細胞由東北農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)免疫微生物教研室饋

5、贈,另外與Beaudtte株IBV同源的pET30a2IBVS1重組蛋白及pcDNA3.12IBVS1質(zhì)粒由東北農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)病理解剖教研室制備并保存。辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體,購自博士德生物公司。sp9002免疫組化試劑盒購自北京中山生物試劑公司。1.2免疫程序大白兔飼養(yǎng)1周后進行免疫,首免劑量1mL疫苗液含病毒40羽/份,混合等體積的弗氏完全佐劑,待完全乳化后,背部皮下多點注射;首免14d后進行第2次免疫,免疫劑量減半,混合弗氏不完全佐劑,待完全乳化后,背部皮下多點注射;以后每隔7d再進行1次免疫,共進行3次,免疫劑量和免疫途徑與第2次免疫相同。1.3血清獲取第5次免疫后7d,進

6、行動物麻醉,通過外科手術方式分離頸動脈,無菌收集血液,直至動物失血死亡。收集到的血液4放置2h,然后4條件下3000r/min離心15min,收集上清即為制備的多抗血清,小劑量分裝、-20凍存。1.4瓊脂擴散試驗0.81g瓊脂糖加入100mL生物技術66中國畜牧獸醫(yī)2010年第37卷第1期0.1mol/L的8%氯化鈉磷酸緩沖液(pH7.2PBS),倒入瓊擴板內(nèi)(厚中,加熱融化,稍涼(6065度為3mm),待瓊脂凝固后,用六角形打孔器在瓊因質(zhì)粒,加入到100L氯化鈣溶液中,混勻。把DNA2氯化鈣溶液加入到100LN,N2雙(22羥乙基)232氨基乙磺酸緩沖鹽水溶液(BBS)中,混勻,室溫孵育10

7、20min。把DNA2氯化鈣2BBS混合物均勻滴加到整個6孔板內(nèi),于含5%CO2的37細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在2h后輕輕晃動培養(yǎng)板數(shù)次,吸去含磷酸鈣沉淀的培養(yǎng)液,加入2mL新鮮的完全培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24h,然后進行體外表達的檢測。;,37作用h3稀釋的FITC標作用30min,PBS清洗3,熒光顯微鏡下觀察表達情況。1.8多抗血清的Westernblotting檢測將pET30a2IBVS1重組蛋白純化后樣品作SDS2PAGE分離后,電轉移至硝酸纖維素(NC)膜上,用5%脫脂奶粉4封閉過夜,再與多抗血清37溫脂板上按7孔梅花圖案打孔。打孔完畢后,將板底部在酒精燈上烘烤以封閉孔底。然后將適當稀釋的疫

8、苗液滴加于中間孔,周圍余孔加被檢血清。將瓊擴板加蓋保濕,放于37溫箱內(nèi)作用2472h,觀察沉淀線。1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)包被液(pH9.6,0.05mol/L碳酸鹽緩沖液)將純化的IBVBeaudette株全病毒抗原作適當稀釋后,烯板,4過夜。棄去包被液,(含0.05%Lp4PBST)洗滌3,。每孔加入封閉液(含1%BSA的)100L,感作1h,甩干,洗板同前。加入100L待檢樣品,對照組加入正常大白兔血清,37感作1h,洗滌同前。每孔加入適當稀釋倍數(shù)的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體100L,37感作1h,同上洗滌。加底物液100L顯色20min。每孔加終止液,作用5min

9、。于Bio2Rad酶標儀492nm下測定光密度。1.6多抗血清檢測IBV感染的Vero細胞將Vero細胞接種到6孔板內(nèi),待細胞長到90%后用PBS洗3遍,每孔接種未濃縮的Beaudette株IBV2DMEM混合液0.5mL,放置于375%CO2細胞育1h,加山羊抗兔HRP2IgG二抗室溫孵育1h,DAB避光顯色。2結果2.1瓊脂擴散試驗瓊脂擴散試驗結果如圖1,抗培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h,每隔20min輕微振蕩1次,1h后每孔加病毒維持液至2mL繼續(xù)培養(yǎng),直至50%細胞出現(xiàn)細胞病變。將細胞培養(yǎng)液倒掉,PBS洗3遍,預冷的4%多聚甲醛4固定15min,然后用PBS洗3遍。山羊血清封閉,37孵育1h,PBS

10、洗3遍。加入適當稀釋倍數(shù)的兔抗血清,37孵育1h,PBS洗3遍。適當稀釋的二抗工作液37孵育20min,PBS洗3遍。辣根酶標工作液37孵育20min,PBS洗3遍。0.05%DAB顯色液室溫避光原18和抗體11、12及14孔之間出現(xiàn)明顯的沉淀線,沉淀線為彌撒的多條細帶,說明制備的多克隆抗體與疫苗稀釋液中存在不止一種抗原-抗體的結合。2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測結果將獲得的抗原按11000和12000稀釋進行包被,被檢血清按1100、1500、11000及110000稀釋。陰性對照組分別采用11000稀釋的抗原包被、1100稀釋的正常家兔血清檢測,12000稀釋的抗原包被、1100稀釋的正常家兔

11、血清檢測。檢測結果如表1,在抗原12000包被孔、血清110000稀釋所得到的值為0.7795,與陰性對照組相比較差異極顯著,且P/N值遠遠大于2,因此可以鑒定為陽性,同時可以判斷血清具有很高的抗體效價。顯色5min;自來水沖洗5min,蒸餾水洗1min。蘇木素復染5min;自來水藍化10min,蒸餾水洗滌2min;風干,二甲苯透明,樹膠封片。1.7多抗血清檢測IBVS1基因在Vero細胞中的表達將Vero細胞培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板內(nèi),待細胞長到70%80%時進行轉染。在轉染前30min,吸去細胞培養(yǎng)液時,加入新鮮的不含抗生素的完全培養(yǎng)液2mL。取2g待轉染的pcDNA3.12IBVS1基圖1血清瓊

12、脂擴散結果中國畜牧獸醫(yī)2010年第37卷第1期表1多克隆抗體ELISA檢測結果(X SD,n=3)抗原1100012000生物技術67抗體11002.8350.1431.7750.12115002.2660.1361.72560.098110002.0900.1871.6340.1361100001.4390.1350.7790.102對照組0.0880.1370.0720.1422.3細胞免疫組化檢測IBV感染Vero細胞通過IBV人工感染Vero細胞,在細胞出現(xiàn)典型“合胞體”病變,同時病變達到50%時進行固定,然后利用所制備的抗體進行細胞免疫組化試驗,與未感染組相比較,結果發(fā)現(xiàn)被感染細胞的

13、細胞核上有棕黃色顆粒沉著(圖2A),而正常細胞中沒有發(fā)現(xiàn)(圖2B)。圖2免疫組織化學檢測IBV感染的Vero細胞注:A,感染了IBV的Vero細胞;B,正常的Vero細胞。2.4細胞免疫熒光檢測IBVS1基因在體外的表達通過細胞免疫熒光技術,利用所制備的抗體檢測S1基因在體外表達情況。在熒光顯微鏡下可以觀察到特異性的綠熒光信號,綠熒光信號主要集中在細胞核表面少量分布在細胞漿中(圖3A);在陰性對照中未發(fā)現(xiàn)此信號(圖3B)。圖3免疫熒光檢測重組質(zhì)粒在Vero細胞中的瞬時表達注:A,pcDNA3.1-IBVS1轉染后的Vero細胞;B,pcDNA3.1轉染后的Vero細胞。2.5Westernbl

14、otting檢測重組蛋白的表達利用3討論大腸桿菌表達系統(tǒng)誘導表達了pET30a2IBVS1重組蛋白,然后應用制備的多抗血清通過Westernblotting技術檢測其表達情況,試驗結果表明在預期位置出現(xiàn)了特異性棕黃色免疫條帶,大小約為65ku,如圖4。實驗室常規(guī)抗病毒抗體制備方法包括單克隆抗體的制備及多克隆抗體的制備,其中多克隆抗體可以通過表達重組亞單位蛋白制備,也可以通過全病毒粒子制備。單克隆抗體具有特異性強,能夠與特異性抗原決定簇相結合等特點,但其制備周期長、制備工藝繁瑣、成本高,同時存在制備失敗的危險。與單克隆抗體相比較,抗全病毒的多克隆抗體具有制備周期短、所得效價高及制備工藝簡單等特點

15、;通過圖4免疫印記試驗檢測多抗血清活性生物技術68中國畜牧獸醫(yī)2010年第37卷第1期表達重組蛋白制備多抗血清時,如果采用的重組蛋白以包涵體形式存在時,則制備的多抗血清會存在生物活性低的潛在危險。經(jīng)比較后,本試驗選擇采用全病毒粒子進行多抗血清的制備,其中抗原選擇的是商品化的H120疫苗株IBV,采取的免疫方式是直接將H120疫苗毒與佐劑混合肌肉注射大白兔,同時借鑒相關研究(李翠等,2008),首免采用40羽/份的注射劑量免疫大白兔,相隔15d后進行第2次免疫,免疫劑量減半,同時在之后的2周內(nèi)又進行了第3次免疫及第4次免疫。本試驗采用商品化弱毒疫苗制備的多抗血清,身并未得到純化,2,在瓊擴,本試

16、驗又同時應用了ELISA方法對多抗血清的效價進行了檢測,包被用抗原選用了與H120株IBV同源性較近的Beaudette株IBV純化后病毒粒子(陳德勝等,2003;馬德興等,2007;劉勝旺等,2004;朱毓永等,2003),ELISA結果表明制備多抗血清能夠與Beau2dette株IBV結合,同時具有很高的抗體效價。另外,本試驗同時采用了細胞免疫組化、細胞免疫熒光及Westernblotting技術,初步嘗試應用該多抗血清檢測不同形式存在的抗原。試驗結果表明,本方法制備的多抗血清能夠與pET30a2IBVS1大腸桿菌表達的重組蛋白、pcDNA3.12IBVS1質(zhì)粒在Vero細胞中瞬時轉染的產(chǎn)

17、物及IBV全病毒粒子特異性結合。本試驗利用商品化的IBVH120株弱毒疫苗,通過簡單、方便、快捷的免疫方法制備了IBV多抗血清,獲得的血清具有較高的效價,而且可以用于檢測不同形式存在的IBV相關抗原,本試驗結果為病毒多抗血清的制備提供了試驗依據(jù),同時為今后進一步開展IBV的研究提供了基礎。參考文獻1馬德星,潘龍,任曉峰,等.雞傳染性支氣管炎病毒HH06分離株的鑒定及其S1基因的分子特征J.中國獸醫(yī)科學,2007,37(11):926930.2王新衛(wèi),何宏軒,王澤霖,等.單抗介導的銀加強金標免疫技術檢測傳染性支氣管炎病毒J.,2009,29(4):394398.3M:,1999,7504,劉玉芬

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