流式細胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用

1、第二十二章流式細胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用本章要點1. 流式細胞儀的分析及分選原理2. 數(shù)據(jù)的顯示與分析3. 流式細胞儀免疫分析的技術(shù)要求4. 流式細胞術(shù)在免疫學(xué)檢查中的應(yīng)用概述：流式細胞術(shù)（FCM是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確地對單個細胞理化特性進行 多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。流式細胞儀的發(fā)展綜合了激光技術(shù)、計算機技術(shù)、顯微熒光光度測定技 術(shù)、流體噴射技術(shù)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等多門學(xué)科的知識。流式細胞儀：是集光電子物理，光電測量， 計算機，細胞熒光化學(xué)，單抗技術(shù)為一體的高科技細胞分析儀。第一節(jié)流式細胞儀的分析及分選原理流式細胞計的基本結(jié)構(gòu)流式細胞計主要由四部分組成。它們是：流動室和液

2、流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計算機和分析系統(tǒng)。一、工作原理（一）基本組成結(jié)構(gòu)1. 流動室和液流系統(tǒng)：流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的 材料制作。設(shè)計和制作均很精細，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個細胞懸液在液流壓力作用下 從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一 般限制液流速度iom/s。由于鞘液的作用，被檢測細胞被限制在液流的軸線上。流動室上裝有壓電晶體, 受到振蕩信號可發(fā)生振動。廠1T-MAv qvv 1111L1 1J I 1y s*!/丿12. 激光源和光學(xué)系統(tǒng)：經(jīng)特異熒光染色

3、的細胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測。常 用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配合氟離子激光器或染料激光器。光源 的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍光488nm的譜線最強，約占總光強的 80%氟離子激光器光譜多集中在可見光部分，以647nm較強。免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長在 550nm以上，可使用染料激光器。將有機染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原 激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodam ine 6G水溶液的染料激光器， 則可得到550650n

4、m連續(xù)可調(diào)的激光，尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率最高，約可占到一半。 為使細胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細胞直徑相近。因此需將激光 光束經(jīng)透鏡會聚。色散棱鏡用來選擇激光的波長，調(diào)整反射鏡的角度使調(diào)諧到所需要的波長入，為了進一步使檢測的發(fā)射熒光更強，并提高熒光訊號的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有 選擇性地使某一濾長區(qū)段的光線濾除或通過。例如使用525nm帶通濾片只允許 FITC （異硫氰熒光素）發(fā)射的525nm綠光通過。長波通過二向色性反射鏡只允許某一波長以上的光線通過而將此波長以下的另一特定 波長的光線反射。在免疫分析中常要同時探測兩種以上的波長

5、的熒光信號，就采用二向色性反射鏡，或二 向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。3. 光電管和檢測系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號而進行測量的。光電倍增管（PMT最為常用。PMT的響應(yīng)時間短，僅為 ns數(shù)量級；光譜響應(yīng)特性好，在200900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從103到108可連續(xù)調(diào)節(jié)，因此對弱光測量十分有利。光電管運行時特別要注意穩(wěn)定性問題，工作電壓要十分穩(wěn)定，工作電流及功率不能太大。 一般功耗低于0.5W;最大陽極電流在幾個毫安。此外要注意對光電管進行暗適應(yīng)處理，并注意良好的磁屏 蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的P

6、MT因為光譜響應(yīng)特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強光下穩(wěn)定性比 PMT好。從PMT俞出的電信號仍然較弱，需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。流式細胞計中一般備有兩類放大 器。一類是輸出信號輻度與輸入信號成線性關(guān)系，稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化 的信號以及代表生物學(xué)線性過程的信號，如DNA測量等。另一類是對數(shù)放大器，輸出信號和輸入信號之間成常用對數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測量中常使用對數(shù)放大器。因為在免疫分析時常要同時顯示陰性、陽性和強陽 性三個亞群，它們的熒光強度相差12個數(shù)量級；而且在多色免疫熒光測量中，用對數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。此外還有調(diào)節(jié)便利、細胞群體分布形狀不易

7、受外界工作條件影響等優(yōu)點。4. 計算機和分析系統(tǒng)：經(jīng)放大后的電信號被送往計算機分析器。多道的道數(shù)是和電信號的脈沖高度相對應(yīng)的，也是和光信號的強弱相關(guān)的。對應(yīng)道數(shù)年縱坐標通常代表發(fā)出該信號的細胞相對數(shù)目。多道分析器 出來的信號再經(jīng)模-數(shù)轉(zhuǎn)換器輸往微機處理器編成數(shù)據(jù)文件，或存貯于計算機的硬盤和軟盤上，或存于儀器 內(nèi)以備調(diào)用。計算機的存貯容量較大，可存貯同一細胞的68個參數(shù)。存貯于計算機內(nèi)的數(shù)據(jù)可以在實測后脫機重現(xiàn)，進行數(shù)據(jù)處理和分析。最后給出結(jié)果。除上述四個主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。（二）基本工作原理將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷酸緩

8、沖液在高 壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動， 組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。流式細胞儀通常以激光作 為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散 射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小 角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列 雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內(nèi)物質(zhì)

9、的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可 轉(zhuǎn)換為電信號，再通過 AD 轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號。計算機把所測量 到的各種信號進行計算機處理，將分析結(jié)果顯示在計算機屏幕上，也可以打印出來，還可以數(shù)據(jù)文件的形 式存儲在硬盤上以備日后的查詢或進一步分析。檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同有多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達，其 X 軸為 測量強度，Y軸為細胞數(shù)目。一般來說，流式細胞儀坐標軸的分辨率有512或1024通道數(shù)，這視其模數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù)，既可以單獨顯示每個參數(shù)的直方圖，也可以選擇二維的三 點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。二、散射光的

10、測定散射光信號的產(chǎn)生是細胞在液柱中與激光束相交時向周圍 360 度立體角方向散射的光線信號，散射光 的強弱與細胞的大小、形狀、光學(xué)同性、胞內(nèi)顆粒折射有關(guān)，與接收散射光的方向也有關(guān)。流式細胞儀中 涉及的散射光信號分為前向散射光和側(cè)向散射光。散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(shù)（如染色），因 此被稱為細胞的物理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。（1） 前向角散射：前向角散射與被測細胞的大小有關(guān)，通常在FCM應(yīng)用中，選取FSC作閾值，來排除 樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對被測細胞的干擾。（2） 側(cè)向角散射：側(cè)向角散射是指與激光束正交90度方向的散射光信號，側(cè)向散射光對細胞膜、胞 質(zhì)、核膜的折射率更為敏

11、感，可提供有關(guān)細胞內(nèi)精細結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。三、熒光測量 熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激光激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不相同。每種熒光染料都有特定的激發(fā)波長，激發(fā)后又會產(chǎn)生特定波長熒光和顏色，例如綠色、紅色、黃色等。當激光光束與細胞正交時，一般會產(chǎn)生兩種熒光信號。一種是細胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光 信號，稱為細胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒光素標記細胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號，通過對這 類熒光信號的檢測和定量分析就能了解所研究細胞參數(shù)的存在與定量。熒光染料可選用的熒光素多種多樣， 由于它們分子結(jié)構(gòu)不同，其熒光激發(fā)譜與發(fā)射譜也各異。選擇染料或單抗所標記的熒光素

12、必須考慮儀器所 配置光源的波長，目前臺式機FCM常配置的激光器為 488nm通常可用染料有 PI、PE、FITC、PerCP、CY5等。四、細胞分選原理 細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。在流動室的噴口上配有一個超高頻電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測定細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同 的電荷，當液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不予 充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現(xiàn)細胞的分離。分選指標主要包括：分選速度、分選純度、分選收獲率及分選得率。1. 分選速度：指每秒可提取所要細胞的個數(shù)，目前臺式機的分選

13、速度為300個秒，大型機的最高分選速度可達每秒上萬個細胞。2. 分選純度：指被分選出細胞所占的百分比，一般臺式機和大型機的分選純度均可達到99%左右。3. 分選收獲率：指被分出細胞與原來溶液中該細胞的百分比。通常情況下，分選純度和收獲率是互相 矛盾的，純度提高，收獲率降低，反之亦然。這是由于樣品在液流中并不是等距離一個接著一個有序地排 著隊，而是隨機的，因此，一旦兩個不同細胞挨得很近時，在強調(diào)純度和收獲率不同條件下，儀器會作出 取或舍的決定，因此，選擇不同模式要視具體實驗要求而定。4. 分選得率：是指從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經(jīng)分選后獲得到目的細胞的實際得 率。該得率與分選得速

14、度密切相關(guān)。第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析峰值脈沖信號：指的是脈沖的高度。 面積脈沖信號：指的是電壓脈沖曲線內(nèi)區(qū)域的大小。一、參 數(shù) 流式細胞儀的數(shù)據(jù)參數(shù)是指儀器采集的用于分析的信號，包括： 前向散射光：反映顆粒的大小。側(cè)向散射光：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度、表面的光滑程度。 熒光：反映顆粒被染上熒光部分數(shù)量的多少，根據(jù)儀器的不同配置，同一顆粒上可以同時檢測多種熒 光信號。二、數(shù)據(jù)顯示方式流式細胞儀的數(shù)據(jù)顯示方式有如下幾種：（一）單參數(shù)直方圖 單參數(shù)直方圖是一維數(shù)據(jù)用得最多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一 般 X-Y 平面描圖儀給出的曲線。 根據(jù)選擇放大器類型不同， 橫坐標

15、可以是線性標度或?qū)?shù)標度。 用“信道” 來表示，實質(zhì)上是所測的熒光或散射光的強度?？v坐標一般表示的是細胞的相對數(shù)。只能顯示一個參數(shù)與 細胞之間的關(guān)系是它的局限性。（二）雙參數(shù)直方圖 雙參數(shù)直方圖是一種細胞數(shù)與雙測量參數(shù)的圖形。常見有以下三種：1. 二維點圖：能夠顯示兩個獨立參數(shù)與細胞相對數(shù)之間的關(guān)系。橫坐標和縱坐標分別為與細胞有關(guān)的 兩個獨立參數(shù)，平面上每一個點表示同時具有相應(yīng)坐標值的細胞存在?？梢杂啥S點圖得到兩個一維直方 圖，但是由于兼并現(xiàn)象存在，二維點圖的信息量要大于兩個一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說多個細 胞具有相同的二維坐標在圖上只表現(xiàn)為一個點，這樣對細胞點密集的地方就難于顯示它

16、的精細結(jié)構(gòu)。2. 二維等高圖：類似于地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點圖的不足而設(shè)置的顯示方法。等 高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。曲線層次越高所代表的細胞數(shù)越多。 一般層次所表示的細胞數(shù)間隔是相等的，因此等高線越密集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化平 衡。3. 假三維圖：是利用計算機技術(shù)對二維等高圖的一種視覺直觀的表現(xiàn)方法。它把原二維圖中的隱坐標 細胞數(shù)同時顯現(xiàn)，但參數(shù)維圖可以通過旋轉(zhuǎn)、傾斜等操作，以便多方位的觀察“山峰”和“谷地”的結(jié)構(gòu) 和細節(jié)，這無疑是有助于對數(shù)據(jù)進行分析的。假三維圖列表模式其實只是多參數(shù)數(shù)據(jù)文件的一種計算機存 儲方式，三個以上的

17、參數(shù)數(shù)據(jù)顯示是用多個直方圖、二維圖和假三維圖來完成的。（三）三參數(shù)直方圖 目前，由于計算機軟件的發(fā)展，很多商品化的軟件均提供三參數(shù)直方圖功能，意指這一類直方圖的三 維坐標均為參數(shù)而非細胞數(shù)。這種立體圖以點圖為顯示方式，同樣可以作全方位旋轉(zhuǎn)以便仔細觀察。（四）流式細胞儀的多參數(shù)分析當細胞標記了多色熒光在流式細胞儀上被激光激發(fā)后，所得到的熒光信號和散射信號可以根據(jù)需要組合分析以獲得所需的信息，這就是流式細胞儀的多參數(shù)分析。第三節(jié) 流式細胞儀免疫分析的技術(shù)要求一、免疫檢測樣本制備 流式細胞儀測定的標本，不論是外周血細胞、培養(yǎng)細胞或組織來源細胞，首先要保證是單細胞懸液， 對不同來源的細胞制備成單細胞懸

18、液有不同的處理程序。（一）外周血淋巴細胞樣品的制備血和骨髓：天然單細胞懸液。當有血凝塊時，應(yīng)用50卩m尼龍網(wǎng)過濾，同時進行細胞計數(shù)和血涂片以判斷靶細胞群體是否仍然存在。一般采取密度梯度離心法。（二）培養(yǎng)細胞的樣品制備 貼壁生長的單層細胞需要用蛋白酶消化后用機械法分離。（三）新鮮實體組織單細胞懸液的制備 一般采取機械法、酶處理法、化學(xué)試劑處理法和表面活性劑處理法等方法。分離不僅是要獲得最大產(chǎn)量的單細胞懸液，還要盡量保證細胞結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性。大多數(shù)淋巴樣組織可用輕柔的機械方法快速 分離，并保持收獲細胞的相對完整。某些組織由于細胞間連接緊密，需在機械分離的基礎(chǔ)上用蛋白水解酶 如胰蛋白酶、胃蛋白酶

19、。骨髓標本亦可能因骨細胞成分污染而需要酶消化。但使用酶法一定要確認酶的使 用沒有改變、減弱靶抗原的表達，細胞活性沒有顯著降低。（四）單細胞懸液的保存 常用的處理方法有三種：1. 深低溫保存法。2. 乙醇或甲醇保存法。3. 甲醛或多聚甲醛固定法。二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色（一）免疫熒光標記最常用的熒光染料最常用的染料有FITC和藻紅蛋白類（PE）及羅丹明等。FITC （異硫氰酸熒光素）：綠色 530nmPE （藻紅蛋白）：橙黃色 575nmPerCP（多甲藻黃素葉綠素蛋白）：深紅色 675nmPI （碘化丙啶）：橙紅色 620nm488nm波長的氬離子激光激發(fā)APC（別藻青蛋白）：紅

20、色 660nm630nm波長的氦氖激光或紅色二極管激光激發(fā)（二）免疫熒光標記常用的標記染色為直接免疫熒光染色和間接免疫熒光染色。在進行雙參數(shù)或多參數(shù)分析時，常常需要 進行熒光抗體的組合標記，目前已經(jīng)有雙色、三色以及四色標記。（三）細胞自發(fā)熒光 自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學(xué)等測量中，對于結(jié)合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關(guān)鍵。一般說來，細胞成分中能夠產(chǎn)生自 發(fā)熒光的分子（例如核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強；培養(yǎng)細胞中死細胞活細胞比例 越高，自發(fā)熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發(fā)熒光越強。三、流式細胞免疫

21、學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制（一）單細胞懸液制備的質(zhì)量控制1. 采用適當?shù)闹苽浞绞健?. 紅細胞的處理。3. 實體組織來源標本的單細胞懸液制備最好采用機械法。4. 溫度與pH。（二）細胞懸液免疫熒光染色的質(zhì)量控制1. 溫度對熒光染色的影響。2. pH對熒光發(fā)射強度的影響。3. 熒光染料濃度的控制。4. 固定劑對免疫熒光染色的影響。（三）儀器操作技術(shù)的質(zhì)量控制1. 光路與流路校正。2. PMT校準。3. 絕對計數(shù)的校準。（四）免疫檢測的質(zhì)量控制1. 同型對照。2. 全程質(zhì)控。第四節(jié) 流式細胞術(shù)在免疫學(xué)檢查中的應(yīng)用一、淋巴細胞及其亞群的分析FCM通過熒光抗原抗體檢測技術(shù)對細胞表面抗原分析。進行細胞分類和亞群分

22、析。這一技術(shù)對于人體細胞免疫功能的評估以及各種血液病及腫瘤的診斷和治療有重要作用。（一）T淋巴細胞及亞群分析1. Th細胞。2. Tc細胞。（二）B淋巴細胞及亞群分析（三）NK細胞分析圖流式細胞術(shù)分析雙色血液淋巴細胞免疫表型，根據(jù)前向角散射（FSC和側(cè)向角散射（SSQ設(shè)門,分不同區(qū)域（R）R1為淋巴細胞，R2為單核細胞，R3為中性粒細胞。7 it1 ?行tw圖 只分析R1內(nèi)的淋巴細胞，見散點圖。2004年第1版IA)-親和-抗體復(fù)上述兩圖引自王建中主編：實驗診斷學(xué)，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,二淋巴細胞功能分析（一）細胞介導(dǎo)細胞毒性試驗（二）細胞內(nèi)細胞因子測定三、淋巴造血系統(tǒng)分化抗原及白血病免疫分型（

23、從略）四、腫瘤耐藥基因分析（從略）五、在AIDS病檢測中的分析（從略）六、自身免疫性疾病相關(guān) HLA抗原分析（從略）第二十三章免疫自動化儀器分析本早考點：1. 概述2. 自動化免疫比濁分析技術(shù)3. 化學(xué)發(fā)光自動免疫分析4. 熒光免疫自動化分析免疫學(xué)是一門迅速發(fā)展的學(xué)科，免疫學(xué)理論和技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和檢驗醫(yī)學(xué)。免疫測定（ 是指利用抗原和抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的特點來檢測標本中微量物質(zhì)的方法。免疫測定的應(yīng)用范圍不僅是具 有免疫原性的物質(zhì)，而且遍及檢驗醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域?？蓽y定的物質(zhì)有許多，包括免疫球蛋白及其片段、單 個補體成分、細胞因子及其受體、細胞粘附分子及其配體、微生物抗原成分及相應(yīng)抗體、血液

24、中多種凝血 因子、酶及同工酶、小分子。各種自動化免疫分析儀在設(shè)計原理中都使用了新的免疫分析基本技術(shù)，如：酶免疫分析；生物素 素技術(shù)；熒光免疫分析；化學(xué)發(fā)光技術(shù)等。自動化儀器設(shè)計中主要采用的技術(shù)指標有：檢測用抗體必須具有高特異性和高親和力；通常采用 磁性微球作為固相載體。增加反應(yīng)面積；常放大抗原抗體的反應(yīng)信號的系統(tǒng)；結(jié)合計算機軟件系統(tǒng)自 動處理分析信號及數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換；人工智能化的設(shè)計，自動檢測及校對功能。第一節(jié)自動化免疫比濁分析技術(shù)20世紀70年代末期以來，Ritchie提出了用激光散射法來測定補體C3和觸珠蛋白形成的抗原合物，并將其稱為散射比濁。1977年Stemberg提出了更快速的比濁法，稱為

25、速率散射比濁法。 圖散射免疫濁度法及透射免疫濁度法示意圖一、散射免疫比濁分析原理散射比濁法是指一定波長的光沿水平軸照射，通過溶液使遇到抗原抗體復(fù)合物粒子，光線被粒子顆粒 折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長和抗原抗體復(fù)合物顆粒大小和多少密切相關(guān)。散射光的 強度與復(fù)合物的含量成正比，即待測抗原越多，形成的復(fù)合物也越多，散射光也越強。散射光的強度還與 各種物理因素，如加入抗原或抗體的時間、光源的強弱和波長、測量角度等密切相關(guān)。（一）散射顆粒與散射光懸浮在反應(yīng)溶液中的分子，無論是固體或膠體粒子都可以是散射中心，當入射光通過時，如果顆粒直 徑比入射光的波長小很多，則散射光的分布比較均勻，稱為R

26、ayleigh散射。如果顆粒直徑接近于入射光的波長，則散射光的分布明顯不均勻，稱為Mile散射。（二）反應(yīng)物含量與散射濁度抗原抗體結(jié)合反應(yīng)中，遵守典型的Heidelberger曲線，即當抗體量恒定時，抗原與抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物的反應(yīng)與散射信號響應(yīng)值的上升呈正比。二、定時散射比濁分析（一）基本原理定時散射比濁分析采用的是免疫沉淀反應(yīng)與散射比濁分析相結(jié)合的技術(shù)。（二）抗原過量檢測在本方法中采用了兩項保證措施。1. 抗體過量。2. 對抗原過量進行閾值限定。三、速率散射比濁分析（一）基本原理速率散射比濁分析是一種 動力學(xué)測定方法，在一定條件下，抗原和相應(yīng)的抗體很快結(jié)合成抗原抗體免 疫復(fù)合物顆粒，速

27、率比濁法就是在一定時間內(nèi)抗原抗體結(jié)合過程中，測定二者結(jié)合的最大反應(yīng)速度，即反 應(yīng)達頂峰峰值。所謂速率是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)過程中，在單位時間內(nèi)兩者結(jié)合的速度。速率法是測定最大 反應(yīng)速率，即在抗原抗體反應(yīng)達最高峰時，通常為數(shù)十秒鐘，測定其復(fù)合物形成的量。峰值的高低在抗體 過量情況下與抗原的量成正比。峰值出現(xiàn)的時間與抗體的濃度及其親和力直接相關(guān)。不同抗原含量其速率 峰值不同，通過電腦處理，求出抗原含量。（二）抗原過量檢測真正的抗原過量檢測是為保證速率散射比濁分析檢測的準確性和精確度，在Beckma n公司的生產(chǎn)的ARRY360系統(tǒng)中，設(shè)計有抗原過量檢測系統(tǒng)。其原理是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)形成的濁度不斷增加而

28、設(shè)計的。在 抗體固定的情況下，免疫復(fù)合物的生成量隨抗原的增加而增加，當抗原量超過抗體量時，免疫復(fù)合物的量 反而減少。根據(jù)這一原理，當標本中的抗原和反應(yīng)液中的抗體結(jié)合后，若反應(yīng)液中有未結(jié)合的抗體存在， 再加入抗原時，可見新的速率峰值信號。如果沒有游離的抗體存在，即抗原過剩的情況下，就不會有或者 只有很小的新的速率信號出現(xiàn)，儀器會重新對標本進行更高稀釋（1：6、1：36、1：216及 1：1296等），然后進行測定，使結(jié)果準確可靠。附：終點散射比濁法 其原理是讓抗原抗體作用一定時間，使其反應(yīng)達到平衡后，測定其復(fù)合物的量。復(fù)合物的濁度不再受 時間的影響，但反應(yīng)復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前（大約反應(yīng)數(shù)十

29、分鐘）進行濁度測定。敏感度達mg L水平，可自動化，但反應(yīng)時間較長。四、免疫透射比濁分析 透射比濁法的基本原理是測定一定體積的溶液通過的光線量，當光線通過時，由于溶液中存在的抗原抗體復(fù)合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光的減少，測定的光通量和抗原抗體復(fù)合物的量成反比。（一）原理抗原抗體在一定緩沖液中形成免疫復(fù)合物（IC ），當光線透過反應(yīng)溶液時，由于溶液內(nèi)復(fù)合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，免疫復(fù)合物量越多，透射光越少，即光線吸收越多，可用吸光度表 示。吸光度和復(fù)合物的量成正比，當抗體量固定時，與待檢抗原量成正比。用抗原標準品建立標準曲線， 可測出待檢抗原含量。附：免疫膠乳比濁法

30、原理：選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當遇到相應(yīng)抗原時，則發(fā)生凝集，單 個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)，光線可透過，當兩個膠乳凝集時，則使透過光減少。這種減少的程度與膠 乳凝集成正比，與抗原量成正比。該法敏感度高，試劑穩(wěn)定，因反應(yīng)液中無PEC沉淀劑的影響，個體IC對結(jié)果影響也小，所以結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設(shè)備，一般分光光度計、自動化生化分析 儀均可使用。（二）實驗要求1. 溶液中存在的抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大，分子太小則阻擋不了光線的通過。2. 溶液中抗原抗體復(fù)合物的數(shù)量要足夠多，如果數(shù)量太少，溶液濁度變化不大，對光通量的影響不大。3. 透射比濁是依據(jù)溶液中顆粒

31、形成或增加而使透射光減弱的原理來定量檢測抗原，檢測仍需抗原抗體 反應(yīng)的溫育時問，檢測時間較長。4. 檢測用抗體一般應(yīng)選擇高親和力的抗體，在檢測中要保證抗體過量。應(yīng)制備標準曲線。五、免疫濁度分析的注意事項（一）校準程序（二）定標程序（三）自動控制（四）自動系統(tǒng)第二節(jié) 化學(xué)發(fā)光自動化免疫分析一、化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是將發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，以檢測抗原或抗體的方法。其既具有免疫反 應(yīng)的特異性，更兼有發(fā)光反應(yīng)的高敏感性。一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射，稱為發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光是指伴隨 化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)在進行化學(xué)反應(yīng)時，吸收了

32、反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能， 使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)。當電子從激發(fā)態(tài)的最低振功能級回到基態(tài)的各個振動能級時產(chǎn)生輻射， 多余的能量以光子的形式釋放出來，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。發(fā)光可分為三種類型：光照發(fā)光、生物發(fā)光 和化學(xué)發(fā)光。二、化學(xué)發(fā)光免疫分析中的標記物質(zhì)及類型 化學(xué)發(fā)光免疫分析所使用的標記物可分為三類：1. 發(fā)光免疫分析反應(yīng)中直接參與發(fā)光反應(yīng)的標記物；2. 以催化作用或能量傳遞參與發(fā)光反應(yīng)的酶標記物；3. 以能量傳遞參與氧化反應(yīng)的非酶標記物。（一）直接參與發(fā)光反應(yīng)的標記物 這類標記物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特殊基團，在發(fā)光免疫分析過程中直接參與發(fā)光反應(yīng)，并沒有 本底發(fā)光。 最常用的標記

33、物主要有吖啶酯類化合物 。吖啶酯類化合物發(fā)光是典型的瞬間發(fā)光，其化學(xué)發(fā)光 分析時間很短，在加入氧化劑和pH糾正液后，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光，在1秒內(nèi)光子散射達到高峰，整個過程在 2 秒內(nèi)完成。（二）以催化反應(yīng)或能量傳遞參與發(fā)光的酶標記物 在這類發(fā)光反應(yīng)中，采用某些酶作為標記物。這類標記物作為發(fā)光反應(yīng)的催化劑或作為一種能量傳遞過程中的受體，其本身直接參與發(fā)光反應(yīng)。主要有兩種酶：1. 辣根過氧化物酶（ HRP）2. 堿性磷酸酶（ ALP）（三）以能量傳遞參與氧化反應(yīng)的非酶標記物 這類標記物作為化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的催化劑或能量傳遞過程中的中間體（或受體），不直接參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。最常用的有

34、三聯(lián)吡啶釕標記物。三、化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型化學(xué)發(fā)光反應(yīng)參與的免疫測定分為以下幾種類型：（一）化學(xué)發(fā)光酶免疫測定化學(xué)發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）是采用化學(xué)發(fā)光劑作為酶反應(yīng)底物的酶標記免疫測定。經(jīng)過酶和發(fā)光兩 級放大，具有很高的靈敏度。以過氧化物酶為標記酶、以魯米諾為發(fā)光底物、并加入發(fā)光增強劑以提高敏 感度和發(fā)光穩(wěn)定性。應(yīng)用的標記酶也可以為堿性磷酸酶，發(fā)光底物為dioxetane 磷酸酯，固相載體為磁性微粒。（二）化學(xué)發(fā)光免疫測定化學(xué)發(fā)光免疫測定（CLIA），是用化學(xué)發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的一類免疫測定方法。吖啶酯是較 為理想的發(fā)光底物，在堿性環(huán)境中即可被過氧化氫氧化而發(fā)光。用作標記的化學(xué)發(fā)光

35、劑應(yīng)符合以下幾個條件：1. 能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。2. 與抗原或抗體偶聯(lián)后能形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑。3. 偶聯(lián)后仍保留高的量子效應(yīng)和反應(yīng)動力。4. 應(yīng)不改變或極少改變被標記物的理化特性，特別是免疫活性。 魯米諾類和吖啶酯類發(fā)光劑等均是常用的標記發(fā)光劑 。（三）微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析 該免疫分析技術(shù)有兩種方法：一是小分子抗原物質(zhì)的測定采用競爭法；二是大分子的抗原物質(zhì)測定采用雙抗體夾心法。該儀器所用固相磁粉顆粒極微小，其直徑僅1.0卩m這樣大大增加了包被表面積，增加抗原或抗體的吸附量，使反應(yīng)速度加快，也使清洗和分離更簡便。其反應(yīng)基本過程：（1 ）競爭反應(yīng)：用過量包被磁顆粒的抗體，與待測的抗原和定量的標

36、記吖啶酯抗原同時加入反應(yīng)杯溫育，其免疫反應(yīng)的結(jié)合形 式有兩種，一是標記抗原與抗體結(jié)合成復(fù)合物；二是測定抗原與抗體的結(jié)合形式。（2）雙抗體夾心法：標記抗體與被測抗原同時與包被抗體結(jié)合成一種反應(yīng)形式，即包被抗體-測定抗原 - 發(fā)光抗體的復(fù)合物。（四）電化學(xué)發(fā)光免疫測定電化學(xué)發(fā)光免疫測定（ECLI）是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性發(fā)光反應(yīng)，包括電化學(xué)和化學(xué) 發(fā)光兩個部分。 分析中應(yīng)用的標記物為電化學(xué)發(fā)光的底物三聯(lián)吡啶釘或其衍生N-羥基琥珀酰胺（NHS酯，可通過化學(xué)反應(yīng)與抗體或不同化學(xué)結(jié)構(gòu)抗原分子結(jié)合，制成標記的抗體或抗原。ECLL的測定模式與ELISA相似。其基本原理是發(fā)光底物二價的三聯(lián)吡啶釕及

37、反應(yīng)參與物三丙胺在電極表面失去電子而被氧化。氧化 的三丙胺失去一個 H而成為強還原劑，將氧化型的三價釘還原為激發(fā)態(tài)的二價釘，隨即釋放光子而恢復(fù)為 基態(tài)的發(fā)光底物。這一過程在電極表面周而復(fù)始地進行，不斷地發(fā)出光子而常保持底物濃度的恒定。四、在臨床免疫檢測中的應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫測定具有明顯的優(yōu)越性：敏感度高，甚至超過RIA;精密度和準確性好，可與 RIA相比；試齊愴定無毒害；測定耗時短；測定項目多；已發(fā)展成自動化測定系統(tǒng)，因此在醫(yī)學(xué)檢驗中 可取代RIA，應(yīng)用十分廣泛，如測定激素、腫瘤標志物、藥物濃度、病毒標志物等。第三節(jié) 熒光免疫自動化分析一、時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定（TRFIA ）

38、是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據(jù) 鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術(shù)測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，可 有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。（一） TRFIA分析原理 在生物流體和血清中的許多復(fù)合物和蛋白本身就可以發(fā)熒光，因此使用傳統(tǒng)的發(fā)色團進而進行熒光檢 測的靈敏度就會嚴重下降。大部分背景熒光信號是短時存在的，因此將長衰減壽命的標記物與時間分辨熒 光技術(shù)相結(jié)合，就可以使瞬時熒光干擾減到最小化。時間分辨熒光分析法（TRFIA）實際上是在熒光分析（FIA）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它是一種特殊的熒 光分析。熒光分析利用了熒光的波長與其

39、激發(fā)波長的巨大差異克服了普通紫外-可見分光分析法中雜色光的影響，同時，熒光分析與普通分光不同，光電接受器與激發(fā)光不在同一直線上，激發(fā)光不能直接到達光電 接受器，從而大幅度地提高了光學(xué)分析的靈敏度。但是，當進行超微量分析的時候，激發(fā)光的雜散光的影 響就顯得嚴重了。因此，解決激發(fā)光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。解決雜散光影響的最好方法當然是測量時沒有激發(fā)光的存在。但普通的熒光標志物熒光壽命非常短，激發(fā)光消失，熒光也消失。不過有非常少的稀土金屬（Eu、Tb、Sm Dy）的熒光壽命較長，可達 I2ms,能夠滿足測量要求，因此而產(chǎn)生了時間分辨熒光分析法，即使用長效熒光標記物，在關(guān)閉激發(fā)光后再測定 熒光強度的分析方法。平時常用的稀土金屬主要是 Eu （銪）和Tb （鋱），Eu熒光壽命lms，在水中不穩(wěn)定，但加入增強劑后可以克服；Tb熒光壽命1.6ms，水中穩(wěn)定，但其熒光波長短、散射嚴重、能量大易使組分分解，因此從測 量方法學(xué)上看 Tb 很好，但不適合用于生物分析，故Eu 最為常用。（二）時間分辨信號原理 普通物質(zhì)熒光光譜分為激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，在選擇熒光物質(zhì)作為標記物時，必須考慮激發(fā)光譜和發(fā) 射光譜之間的波長差，即 S