rBTI的內化及誘導Hep G2細胞自噬的研究

1、rBTI的內化及誘導Hep G2細胞自噬的研究【摘要】：蛋白酶抑制劑廣泛分布于自然界中,以不同形式存在于植物,動物及微生物體內,是一類可以作用于蛋白酶,并對酶有特異性抑制作用的小分子物質或蛋白質。它們按一定比例與酶結合形成可逆的蛋白質復合物,在血液凝固,補體級聯反應,細胞凋亡的調控以及激素加工處理等過程中發(fā)揮重要的作用。蕎麥胰蛋白酶抑制劑(BuckwheatTrypsinInhibitor,BTI)是由69個氨基酸組成的分子量為7.9kD的耐熱小分子蛋白,屬于PotatoI型蛋白酶抑制劑家族。本課題組的前期研究表明,重組的蕎麥胰蛋白酶抑制劑(recombinantBuckwheatTrypsi

2、nInhibitor,rBTI),對HepG2,EC9706,K562,HL60等腫瘤細胞株都有明顯的抑制生長并誘導其凋亡的作用,而對正常肝細胞HL7702沒有影響；rBTI可以誘導促凋亡基因表達上調,抗凋亡基因表達下降,可以使EC9706細胞周期阻滯于Go/G1期,但是具體的分子機制還不清楚。本研究選用pExSecI表達載體,構建了含有BTI基因的表達質粒pExSecI-BTI,經原核表達和純化,獲得了無融合標簽的rBTI,分析了rBTI內化進入HepG2細胞的機制,探討了其誘導HepG2細胞自噬的分子機制,以及與細胞表面的可能受體uPA的相互作用。主要結果如下：1.構建了原核表達載體pEx

3、Sec-BTI,并對其表達條件進行了優(yōu)化,當誘導劑IPTG的濃度為0.5mmol/L,誘導時間為3.5h時,rBTI的表達量最高。根據rBTI執(zhí)穩(wěn)定性好的特點,對rBTI的純化條件進行了優(yōu)化(80熱處理20min),經ResourceTMQ離子交換層析一步純化即可獲得純度大于95%的rBTI。這一純化步驟應用于rBTI的大規(guī)模制備亦十分有效。2.將rBTI用FITC標記,綜合運用多種內吞抑制劑及方法,如NH4CI,MDC,K+,蔗糖溶液等,以及RNA干擾,M期阻滯等技術和激光共聚焦顯微鏡研究了rBTI進入HepG2細胞的方式。提出rBTI以細胞膜上尿激酶型纖溶酶原激活子(uPA)為受體,通過網

4、格蛋白依賴性的內吞作用進入細胞,呈現濃度和能量依賴性,其中細胞膜電位在內吞過程中起著重要作用。3.采用透射電子顯微鏡,MDC染色,流式細胞術等技術研究了rBTI誘導的HepG2細胞自噬。rBTI作用HepG2細胞后,透射電子顯微鏡觀察到細胞內部出現自噬體以及自噬溶酶體結構,細胞發(fā)生了自噬,細胞的自噬活性與rBTI的濃度呈正相關。通過MDC染色以及pCMV-GFP-LC3轉染實驗,進一步確定了rBTI可以誘導細胞產生自噬,當rBTI誘導4h后,HepG2細胞即發(fā)生明顯的自噬現象。應用激光共聚焦顯微鏡觀察了rBTI作用前后胞內細胞器的變化。在rBTI作用12h后,HepG2細胞內質網和溶酶體發(fā)生較

5、大的變化,線粒體膜的通透性發(fā)生改變,但是細胞核的變化不明顯。通過自噬抑制劑3-MA的聯合使用以及細胞恢復實驗等方法,明確了rBTI誘導的細胞死亡主要是自噬性程序性細胞死亡。4.構建了pEGFP-N1-BTI單色熒光載體及pDsRed1-N1-EGFP-BTI雙色熒光載體,觀察了rBTI在HepG2細胞內的定位,確定了rBTI主要定位于胞質中的自噬體及自噬溶酶體。據此我們提出假說：作為外源物的rBTI被細胞內的自噬相關分子選擇性識別,進入自噬溶酶體被降解,過度的自噬誘發(fā)細胞失去固有的穩(wěn)態(tài),進而走向死亡。即rBTI介導的細胞死亡是一種底物特異性的死亡機制。通過RT-PCR的方法,對rBTI作用后三

6、個自噬相關分子(mTOR,Beclinl和PI3K)進行了RNA水平的分析,結合3-MA抑制劑實驗,初步確定rBTI誘導的細胞自噬主要受Beclin1復合物的調控。5.通過熒光光譜法、凝膠電泳法等,進一步確定了rBTI與uPA之間存在相互作用。在體外條件下,rBTI可作為uPA的底物,被uPA水解為兩個片段。采用RT-PCR的方法,對rBTI作用后,uPA以及uPA下游兩個分子(MMP-2和MMP-9)進行了檢測,并通過明膠酶譜和細胞劃痕實驗研究了rBTI對HepG2細胞遷移的影響。結果表明,rBTI可以誘導uPA,MMP-2和MMP-9的表達,并促進HepG2細胞遷移?！娟P鍵詞】：蕎麥胰蛋白

7、酶抑制劑Potato型抑制劑細胞自噬尿激酶型纖溶酶原激活子抗腫瘤【學位授予單位】：山西大學【學位級別】：博士【學位授予年份】：2012【分類號】：Q25【目錄】：中文摘要14-16ABSTRACT16-19第一章文獻綜述19-481蛋白酶抑制劑概述19-241.1蛋白酶抑制劑的分類及特征19-221.1.1Bowman-Birk型抑制劑(BBI)19-201.1.2Kunitz型抑制劑20-211.1.3Potato型抑制劑21-221.2蛋白酶抑制劑的生理功能22-231.2.1營養(yǎng)積累221.2.2調節(jié)體內蛋白酶活性221.2.3抵御病蟲害22-231.3蛋白酶抑制劑的應用23-241.3

8、.1在轉基因植物方面的應用231.3.2在醫(yī)學方面的應用23-242細胞自噬的研究進展24-382.1細胞自噬的形態(tài)學特征及分類24-252.2細胞自噬的信號調控25-312.2.1MTOR復合物調控26-302.2.1.1PI3K/Akt/mTOR信號通路282.2.1.2AMPK/mTOR信號通路282.2.1.3mTOR對細胞自噬的調控28-302.2.2Beclin1的復合體調控30-312.3參與細胞自噬的相關分子及其功能31-352.4細胞自噬研究方法35-372.4.1電子顯微鏡35-362.4.2Monodansylcadaverine染色362.4.3細胞自噬的特異標志物36

9、2.4.3.1GFP-LC3定位362.4.3.2LC3-到LC3-的轉化362.4.4Beclin1的表達36-372.4.5特異抑制劑372.5細胞自噬與凋亡的關系37-383本研究的立題背景及意義38-403.1研究背景38-393.2研究目的與意義39-404參考文獻40-48第二章pExSecI-BTI載體的構建及純化48-561實驗材料48-491.1菌株及質粒481.2試劑及儀器48-492實驗方法49-512.1pExSecI-BTI表達載體的構建49-502.2rBTI的表達與純化502.3rBTI表達條件的選擇50-512.4rBTI的純化512.5抑制活性的測定513實驗

10、結果51-543.1pExSecI-BTI表達載體的構建51-523.2pExSecI-BTI表達條件的優(yōu)化52-533.3表達產物的預處理533.4rBTI純化及純度分析53-543.5rBTI抑制胰蛋白酶活性的測定544討論54-555參考文獻55-56第三章rBTI的內化機制56-701實驗材料56-571.1細胞株及試劑561.2實驗儀器56-571.3實驗試劑的配置572實驗方法57-602.1FITC標記rBTI57-582.2細胞培養(yǎng)582.3激光共聚焦標本的制作582.4rBTI最佳使用濃度的確定582.5rBTI與轉鐵蛋白的共轉運58-592.6內吞抑制劑的使用592.7M期

11、阻滯對內吞的影響592.8RNA干擾技術的應用592.9rBTI與uPA在細胞表面的共定位59-603實驗結果60-673.1FITC-BTI以能量和濃度依賴性的方式進入細胞603.2FITC-BTI可以和Rho-Tf同步內化60-613.3膜電位消除對FITC-BTI內吞的影響613.4內吞抑制劑的影響61-643.5M期阻滯抑制了FITC-BTI的內吞643.6FITC-BTI依賴網格蛋白64-653.7FITC-BTI和細胞表面的uPA共定位65-674討論67-685參考文獻68-70第四章rBTI誘導HepG2細胞自噬70-821實驗材料70-711.1實驗試劑與質粒70-711.2

12、實驗儀器712實驗方法71-732.1細胞培養(yǎng)712.2透射電鏡觀察712.3rBTI作用后細胞形態(tài)的變化712.4HepG2細胞恢復實驗71-722.5MDC染色722.6pCMV-GFP-LC3轉染72-732.7HepG2細胞自噬的定量檢測732.8HepG2細胞自噬對相關細胞器的影響733實驗結果73-793.1透射顯微鏡觀察HepG2自噬73-743.2細胞形態(tài)觀察743.3HepG2細胞恢復實驗74-763.4MDC染色觀察細胞自噬763.5GFP-LC3觀察細胞自噬76-773.6流式細胞術定量檢測HepG2細胞自噬773.7HepG2細胞自噬對相關細胞器的影響77-794討論7

13、9-805參考文獻80-82第五章rBTI誘導HepG2細胞自噬機制初探82-911實驗材料822實驗方法82-862.1雙色熒光載體構建82-832.2rBTI在HepG2細胞內的定位832.3rBTI中WXXL模體的突變及活性鑒定83-842.4自噬抑制劑3-MA的使用842.5RNA水平檢測自噬相關分子變化84-863實驗結果86-903.1pDsRed1-N1-EGFP-BTI熒光載體的構建86-873.2rBTI分子中WXXL模體的功能87-883.33-MA在rBTI誘導的細胞自噬中的作用883.4自噬相關基因的表達88-904討論905參考文獻90-91第六章rBTI和uPA相互作用研究91-1001實驗材料912實驗方法91-932.1pGEX-6p-1-BTI載體的構建與純化91-922.2熒光光譜法檢測rBTI與uPA的相互作用922.3凝膠電泳分析rBTI與uPA的相互作用922.4rBTI對HepG2細胞uPA及相關酶表達的影響92-932.5rBTI對細胞