人胎盤絨毛提取物體外對T細胞應答的抑制效應

1、人胎盤絨毛提取物體外對T細胞應答的抑制效應    作者：肇靜嫻，曾耀英，江遜，季煜華，劉毅 【關鍵詞】  胎盤絨毛；滋養(yǎng)層；免疫抑制；T淋巴細胞；色氨酸加氧酶    【Abstract】 AIM: To have a progressive knowledge of the inhibitory capacity of placental villi on T cell response and its changes in the 3 trimesters of pregnancy. METHODS: 

2、 Tissue extracts were prepared from early (10 weeks), middle (20 weeks) and late (37 weeks) placental villi, and their impacts on T cell activation were evaluated by detecting CD69 and CD25 expressions, impacts on proliferation were analyzed by method of WST1, and impacts on Th1/Th2 cytokine reperto

3、ire were measured by cytometric bead array (CBA). Content of indoleamine 2,3dioxygenase (IDO) in the tissue extracts was detected by Western blotting. RESULTS: All tissue extracts from the 3 trimesters showed inhibitory effects on activation, proliferation and cytokine secretion of human peripheral

4、T cells stimulated by PHA, and also on activation of mouse T cell activation stimulated by ConA (P<0.01). In general, the 20 week extracts had the strongest immunosuppressive effects. The content of IDO was much more in 20 week extracts than in 37 week extracts, and there was only trace amount of

5、 IDO in 10 week extracts. CONCLUSION: Villous extracts from the 3 trimesters of pregnancy had different degrees of inhibitory effects on T cell response, and their inhibitions to different T cell behaviors were not consistent, indicating their different expression patterns (quality and quantity) of

6、inhibitory factors.    【Keywords】 placental villus; trophoblast; immunosuppression; T lymphocytes; tryptophan oxygenase    【摘要】 目的： 了解胎盤絨毛對T細胞應答的抑制能力及其在妊娠周期不同階段的變化. 方法： 制備孕10，20和37 wk的絨毛提取物，通過檢測CD69和CD25分子的表達，評價其對T細胞活化的影響，WST1法分析其對T細胞增殖的影響，流式微球陣列（CBA）法分析其對Th1/Th2細胞因子譜的影

7、響，并以Western印跡法分析提取物中吲哚胺2,3雙加氧酶（IDO）的含量. 結果： 孕早、中、晚期的胎盤絨毛提取物均能顯著抑制植物血凝素(PHA)誘導的人T細胞活化，增殖，細胞因子分泌以及ConA誘導的小鼠T細胞活化（P<0.01）. 但三個時期的提取物對上述不同T細胞行為的抑制強度不同，以20 wk提取物的抑制作用最強. 提取物中IDO蛋白的含量20 wk最高，37 wk次之，10 wk最低. 結論： 妊娠不同時期的絨毛滋養(yǎng)細胞均能夠抑制T細胞應答，但抑制強度不一致，且對T細胞不同行為的抑制存在分離現(xiàn)象，提示妊娠不同時期的絨毛滋養(yǎng)細胞表達抑制因子的模式不同.  

8、  【關鍵詞】 胎盤絨毛；滋養(yǎng)層；免疫抑制；T淋巴細胞；色氨酸加氧酶     0引言    在胎盤局部，受精卵來源的絨毛滋養(yǎng)細胞和絨毛外滋養(yǎng)細胞作為胎兒細胞的代表，處于母胎界面的最前沿，因此已成為研究母胎耐受機制中胎兒因素的最重要靶點. 雖然已知絨毛滋養(yǎng)細胞表達HLAG, FasL, 吲哚胺2,3雙加氧酶（indoleamine 2,3dioxygenase, IDO），以及分泌高濃度的雌、孕激素都可能參與了降低母體免疫系統(tǒng)對胎兒抗原的應答1-4，但以往研究多是對上述單個因素的作用進行分析，而對胎盤絨毛所具有的整體

9、的免疫抑制能力，及其在妊娠不同階段有何變化等問題的研究報道較少. 本研究擬從胎盤絨毛提取物的角度，對妊娠早、中、晚期胎盤絨毛的細胞免疫抑制能力進行評價，并希望通過此研究思路為發(fā)現(xiàn)新的免疫耐受相關機制奠定基礎.&n    %這2個濃度研究其對T細胞增殖的影響. 培養(yǎng)48 h后，WST1法檢測各孔細胞吸光值. PHA對照組與空白對照組比較細胞明顯增殖（P<0.01）；加入5%或10%各期絨毛提取物，PHA誘導的增殖被明顯抑制（P<0.01），其中以20 wk提取物的抑制作用最強（圖1）.表1不同體積百分比各期絨毛提取物對PHA誘導的人T細

10、胞CD69和CD25表達的抑制率 圖1胎盤絨毛提取物對PHA誘導的人T細胞增殖的影響    2.3胎盤絨毛提取物對小鼠T細胞活化的影響10%體積比的各期胎盤絨毛提取物對ConA誘導的小鼠T細胞CD69和CD25表達均具有顯著的抑制作用（P<0.01，圖2）.  bP<0.01 vs ConA.圖2胎盤絨毛提取物對ConA誘導的小鼠T細胞活化的影響    2.4胎盤絨毛提取物對細胞活力的影響培養(yǎng)24 h后，加入不同百分比20 wk提取物的各組死亡細胞百分率略高于空白對照組（P<0.05）；PHA對照組死亡細胞

11、百分率明顯高于空白對照組（P<0.01），但PHA加提取物的各組死亡細胞百分率均明顯低于PHA對照組（P<0.01，圖3）.     2.5孕早、中、晚期胎盤絨毛提取物IDO蛋白含量Western 印跡法檢測，20 wk提取物中IDO蛋白的含量最高，37 wk提取物次之，而10 wk提取物中只含有微量的IDO蛋白（圖4）. 圖4各期胎盤絨毛提取物中IDO蛋白的相對含量    2.6胎盤絨毛提取物對PBMC分泌細胞因子的影響培養(yǎng)6 h后，未加刺激劑的各組無論有否加胎盤絨毛提取物，培養(yǎng)上清中6種細胞因子均未檢出；培養(yǎng)24 h后

12、，空白對照組培養(yǎng)上清IFN為（54.2±5.1） pg/mL，加入10%體積各期提取物后，均檢測不出. 經(jīng)PHA刺激6和24 h后，10%體積比各期提取物對細胞因子的影響見表2. 全部樣品IL4, IL5和IL10均未檢出.表2各期10%胎盤絨毛提取物對細胞因子分泌的抑制作用    3討論    胎兒對于母體來說相當于半同種異基因移植物，而同種移植排斥反應的實質(zhì)是受者T細胞介導的針對供者同種異基因抗原的免疫應答，因此本課題主要研究絨毛提取物對T細胞應答的影響. 結果顯示，孕早、中、晚期的胎盤絨毛提取物均能抑制PHA誘導的人外

13、周血T細胞活化、增殖和細胞因子分泌，而且這些作用并非由細胞毒性引起. 提示在母胎免疫耐受的維持中，胎兒來源的滋養(yǎng)細胞除不表達某些主要的MHC I類分子而減少母體免疫系統(tǒng)的攻擊外，還具有一套能夠主動抑制母體免疫攻擊的“防御系統(tǒng)”. 人胎盤絨毛提取物對小鼠T細胞活化的抑制作用提示，絨毛提取物中存在一些保守的、無種屬特異性的免疫抑制因素，如高濃度的雌、孕激素對人和小鼠的T細胞活化、增殖均具有抑制作用6.    IDO是細胞內(nèi)一種催化色氨酸（Trp）沿犬尿氨酸途徑降解的限速酶，體內(nèi)、外研究都表明，IDO能夠抑制T細胞增殖，是機體天然存在的免疫抑制機制3，7. 一般認為，I

14、DO抑制T細胞增殖的原因是它降解Trp，造成缺乏Trp的微環(huán)境，這對一般細胞影響似不明顯，而T 細胞由于存在一個對Trp 敏感的檢查點，使細胞增殖停滯于G1期中期8. 胎盤滋養(yǎng)層細胞產(chǎn)生的IDO能阻斷針對胎兒組織表達的父本HLA等位基因產(chǎn)物的母體活化T細胞攻擊，因而是防止母體T細胞排斥同種異基因胎兒的必要因素4. 本研究結果顯示，20 wk提取物中IDO的濃度最高，37 wk提取物次之，而10 wk提取物中只含有微量的IDO，與文獻報道的IDO于胎盤種植后13 wk時才明顯表達相符9. 這一結果與前述絨毛提取物對T細胞增殖的抑制能力20 wk最強，37 wk次之，10 wk最弱有很好的一致性；

15、由于IDO并不影響T細胞的活化10，因此，與前述37 wk和10 wk提取物對T細胞活化的抑制效應相近并不矛盾，20 wk提取物對活化的抑制作用最強可能是由提取物中的其他因素引起的.    本研究發(fā)現(xiàn)，妊娠不同時期的胎盤絨毛提取物對T細胞不同行為的抑制效應存在分離現(xiàn)象，提示妊娠不同時期滋養(yǎng)細胞表達抑制因子的模式（質(zhì)和量）不同，不同時期提取物中IDO含量的差異就是一個例子. 母胎耐受是多種因素整合的結果，在妊娠期的不同時空組合中，各種耐受機制可能有著不同的貢獻度. 以胎盤絨毛提取物為切入點，借助蛋白組學等高通量的研究手段，很可能發(fā)現(xiàn)新的耐受相關分子和耐受相關機制.    【參考文獻】    1  Thellin O, Coumans B, Zorzi W, et al. Tolerance to the foetoplacental graft: Ten ways to support a child for nine months J. Curr Opin Immunol, 2000,12(6):731-737.