生物大分子實驗報告

1、高級生物化學與分子生物學綜合實驗報告1、 實驗目的以特定酶基因在大腸桿菌中的克隆、表達和純化為主線，進行基因操作、蛋白質(zhì)表達、親和層析純化等的訓練，通過集中訓練熟練生物化學和分子生物學實驗操作，為獨立開展研究生課題研究奠定實驗基礎。2、 實驗原理利用基因重組技術，將目的基因與載體質(zhì)粒DNA在體外進行重組，然后把這種重組DNA轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞，通過一定的誘導條件，使之在受體細胞內(nèi)增值表達相應的目標蛋白。為了得到相應的目標蛋白，需要通過親和層析等手段純化目標蛋白。三、 實驗內(nèi)容 一）內(nèi)容一：重組質(zhì)粒的分離、鑒定與轉(zhuǎn)化實驗1. 重組質(zhì)粒的分離、純化及檢測實驗2. 質(zhì)粒的酶切及瓊脂糖凝膠電泳回收實驗3

2、. 感受態(tài)細胞的制備、連接與轉(zhuǎn)化 二）內(nèi)容二：重組蛋白在大腸桿菌中的表達實驗4. 細菌的大量培養(yǎng)及重組蛋白的誘導 三）內(nèi)容三：重組蛋白的提取、純化與鑒定 實驗5. 細菌的收集、破碎與目標蛋白的純化實驗6.目標蛋白的SDS-PAGE鑒定 實驗1 質(zhì)粒DNA的分離、純化及檢測材料、設備及試劑一、材料 轉(zhuǎn)化的細菌，1.5ml塑料離心管,離心管架。 二、設備 微量取液器(20l,200l,1000l)， 臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床， 高壓蒸汽滅菌鍋，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。三、試劑 1. LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani) ：稱取蛋白胨(Tryptone)5

3、g，酵母提取物(Yeast extract) 2.5g，NaCl 5g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5, 加去離子水至總體積500 mL，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。2. LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉，高壓滅菌。 3. 氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20保存?zhèn)洹?. 質(zhì)粒提取試劑盒。操作步驟 1. 細菌的培養(yǎng)和收集 將含有質(zhì)粒的菌種用無菌牙簽挑取平板上的單菌落接種到2-5ml LB液體培養(yǎng)基(含50g/ml Amp)中，37振蕩培養(yǎng)約12小時至對數(shù)生長后期。 2. 取液體培養(yǎng)物1.2 mL于Eppendorf

4、 管中，然后6000 g/min離心2 min，棄上清。3. 質(zhì)粒的提取，參照質(zhì)粒提取試劑盒說明。4 -20保存DNA以備電泳檢測。實驗2 質(zhì)粒的酶切及瓊脂糖凝膠電泳回收 材料、設備及試劑 一、 材料 質(zhì)粒； Hind酶及其酶切緩沖液；瓊脂糖(Agarose) 二、 設備 水平式電泳裝置,電泳儀,臺式高速離心機, 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀。 三、 試劑 50×TAE電泳緩沖液； 6×電泳載樣緩沖液。操作步驟 一、 DNA酶切反應 1. 反應體系組成： 10X Buffer 5 L HindIII 1 L Plasmid 20 L H2O 24 L

5、2. 混勻反應體系后，將eppendorf管置于泡沫板上，37水浴保溫1小時，使酶切反應完全。 3. 停止反應，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?二、 瓊脂糖凝膠電泳 1. 取50×TAE緩沖液4ml加水至200ml，配制成1×TAE稀釋緩沖液，待用。 2. 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 1×TAE稀釋緩沖液，輕輕搖勻，溶脹30min，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化。3. 膠板的制備：將有機玻璃膠槽放好，插上樣品梳子。將冷卻至50-60的瓊脂糖膠液小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。 4. 加樣：取10l酶解液與2l 6×

6、;載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。5. 電泳：加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳。6. 染色觀察和拍照。7. 回收條帶，用回收試劑盒。步驟參見試劑盒說明書。實驗3 感受態(tài)細胞的制備、連接與轉(zhuǎn)化 材料、設備及試劑 一、材料E. coli BL21/DE3菌株: Amp-；無菌eppendorf管。 2、 試劑LB液體培養(yǎng)基、T4 DNA連接酶、氨芐青霉素、含Amp的LB固體培養(yǎng)基操作步驟一、 連接反應 1. 取新的經(jīng)滅菌處理的1.5ml eppendorf管, 編號。 2. 體系組成：共

7、10lBuffer 1X回收的DNA片段 100 ngT4 DNA ligase 1 L去離子水 3. 順序：去離子水、回收的DNA片段、回收的DNA片段、T4 DNA ligase。4. 混勻后用小離心機將液體全部甩到管底,于16保溫8-24h。2、 E. coli感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化1. 從4冰箱中取200l感受態(tài)細胞懸液，立即置冰上。2. 加入連接產(chǎn)物溶液(體積不超過10l)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘。 3. 42水浴中熱擊90秒,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。 4. 向管中加入0.8ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37低轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)45min，使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)

8、粒編碼的抗生素抗性基因。5. 將上述菌液搖勻后取200l 涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置5-10min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)16-24小時。 同時做兩個對照: 對照組1: (-)感受態(tài)細胞，此組正常情況下應不產(chǎn)生菌落。 對照組2: （+）1l質(zhì)粒，此組正常情況下應產(chǎn)生大量。 實驗四 細菌的大量培養(yǎng)及外源蛋白的誘導 操作步驟 種子培養(yǎng)液的準備和外源蛋白的誘導表達 1. 取凍存的菌種，接種入裝有5-10ml LB培養(yǎng)基的瓶中，37，200rpm/min過夜培養(yǎng)后接入100ml LB培養(yǎng)基，接種濃度為2%。 2. 37，200rpm/min培養(yǎng)3小時后，將搖床溫度調(diào)

9、節(jié)到誘導溫度20并平衡30min，然后加入IPTG至終濃度0.4mM，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。實驗五 細菌的收集、破碎與目標蛋白的純化材料及試劑 一、材料 經(jīng)誘導表達目的蛋白的大腸桿菌、Ni-NTA介質(zhì)（Ni親和介質(zhì)） 二、試劑 1緩沖液: 20mmol/L Tris-HCl，pH8.0；2緩沖液配制10mM、50 mM、100 mM、250 mM咪唑。操作步驟一（細菌破碎） 1.將菌液轉(zhuǎn)入大離心瓶中，離心收菌，4000rpm，10min；2.倒掉上清，將菌體懸于10mL緩沖液中 ，超聲破碎細菌；3.將破菌產(chǎn)物離心，12000rpm，15 min；4. 分別對上清和沉淀留樣，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

10、鑒定表達情況和蛋白操作步驟二（目標蛋白純化）1.處理介質(zhì)：向柱中加入0.5mL NiTA介質(zhì)后，用5倍柱體積的去離子水洗滌介質(zhì)；再用5倍柱體積的緩沖液洗滌介質(zhì)； 以下步驟根據(jù)蛋白性質(zhì)在16下進行操作；2.加入蛋白樣品：加入超聲破菌后的蛋白上清樣品；3.洗滌雜蛋白：用5倍柱體積的10mM咪唑洗滌介質(zhì)；4.洗滌目標蛋白：用50 mM、100 mM、250 mM不同濃度的咪唑各2.5ml，梯度洗脫介質(zhì) ，回收流出液，保存于4，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。實驗六目標蛋白的SDS-PAGE鑒定 試劑 10十二烷基硫酸鈉（SDS）貯存液、30%丙烯酰胺單體液、濃縮膠緩沖液1M pH6.8的Tris

11、緩沖液和分離膠緩沖液1.5M pH8.8的Tris緩沖液、10%過硫酸銨、TEMED、Tris-甘氨酸電泳緩沖液、樣品處理液、染色液、脫色液操作步驟一、 蛋白電泳用膠的配制 1. 安裝玻璃板。2. 按表1中給出的數(shù)值在一小燒杯中配制分離膠溶液。 表2-1 SDS不連續(xù)電泳凝膠配方貯液分離膠/12%濃縮膠/3%30%丙烯酰胺單體貯液/mL4.00.85分離膠緩沖液1.5M Tris/mL (pH8.8)2.5-濃縮膠緩沖液1M Tris /mL(pH6.8)-0.6雙蒸水/mL3.43.510的SDS溶液/L1005010的過硫酸銨溶液/L158TEMED/L108 3. 迅速在玻璃板的間隙中灌

12、注丙稀酰胺溶液，留出灌注濃縮膠所需的空間。再在膠面上小心注入一層水（約23 mm）高，以阻止氧氣進入凝膠溶液。4. 分離膠聚合完全后（約30分鐘），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。5. 按表1中給出的濃縮膠配置方法制備濃縮膠。注意一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應快速操作。6. 在聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入干凈梳子。7. 在等待濃縮膠聚合時，可對樣品進行處理，在樣品中按1：1體積比加入樣品處理液，在100加熱5min以使蛋白質(zhì)變性。8. 濃縮膠聚合完全后（30-60 min），小心移出梳子。將凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液。二、上樣

13、電泳1. 按預定順序加樣，加樣量通常為10 25L。電泳檢測樣品至少包括：蛋白Marker、上樣液（原液）、上樣后的穿透液、10mM咪唑沖洗液、50mM咪唑沖洗液、100mM咪唑沖洗液、250mM咪唑沖洗液。2. 將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/ cm。當染料前沿進入分離膠后，把電壓提高到15 V/ cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部上方約1 cm，然后關閉電源。3. 從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔凝膠下部切去一角以標注凝膠的方位。三、用考馬斯亮藍對SDS聚丙稀酰胺凝膠進行染色和脫色染色時間：現(xiàn)溫度下不少于2h。脫色需310小時，期間應多次更換脫色液直

14、至背景清楚。為了永久性記錄，應盡快對凝膠進行拍照。4、 實驗結(jié)果與討論1、 質(zhì)粒的提取、酶切電泳圖譜M21 圖 1-1 第四組電泳圖譜 圖1-2 第三組電泳圖譜1：酶切后的質(zhì)粒 2：質(zhì)粒 M ：Marker 1、2：質(zhì)粒 4、5：酶切后質(zhì)粒觀察結(jié)果：通過對比第三組和第四組電泳圖譜，可以發(fā)現(xiàn)酶切后的質(zhì)粒條帶在原質(zhì)粒條帶的前面，并且質(zhì)粒泳道條帶比較多；電泳條帶模糊，呈凹凸形狀，拖尾現(xiàn)象比較嚴重，不能很明顯地觀察結(jié)果。 原因分析： （1）質(zhì)粒泳道條帶較多的原因可能是，質(zhì)粒有的是超螺旋的，有的可能是開環(huán)質(zhì)粒，還有的形成各種聚合物，因此呈現(xiàn)多條條帶。由于形成聚合物，分子量增大，因此條帶在酶切條帶的后面，

15、條帶最亮說明呈聚合狀態(tài)的質(zhì)粒的量是最多的。 （2）Marker條帶模糊，拖尾現(xiàn)象嚴重可能的原因有：電泳緩沖液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，可以提高電泳效果；瓊脂糖的濃度可能不是很適合，應盡可能摸索出該質(zhì)粒最適濃度；電泳時電壓不是最適電壓，而且電壓不是很穩(wěn)，電泳時間太長，可能是電泳儀器太老化了；正確合適的上樣量是條帶清晰的保證，條帶模糊可能是上樣量太大；有時候可能是由于DNA被蛋白質(zhì)或一些酶污染。2、轉(zhuǎn)化結(jié)果（培養(yǎng)基） 陽性對照是將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞，此組正常情況下應產(chǎn)生大量菌落。我們組的菌落效果總體比其他小組好，這與涂布平板時的一些注意事項有關，比如涂板的時候溫度不要太高，無菌操作等。陽性對照 實驗組菌落很多

16、，說明菌液濃度有點高，但是還是有明顯的單菌落。但是菌落培養(yǎng)時間有點長，影響因素可能有培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、感受態(tài)細胞的質(zhì)量等等。實驗組 陰性對照是將酶切以后沒有連接的質(zhì)粒用于感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化。由于細菌本身對外源DNA有降解作用，因此目標基因在細菌里不能表達，因此不能看到菌落。陰性對照3、目標蛋白的SDS-PAGE鑒定圖譜1）電泳檢測樣品包括：蛋白Marker、上樣液（原液）、上樣后的穿透液、50mM咪唑沖洗液、100mM咪唑沖洗液、250mM咪唑沖洗液。2）各個小組將100mM咪唑沖洗液在一塊膠上一起電泳。3）只有第二小組做了對照電泳，將未加IPTG誘導的菌液進行了相應的電泳。穿柱液4333kD4

17、5kD21M 圖3-1目標蛋白的SDS-PAGE鑒定圖譜以Marker為臨界線，右邊是我們第四組的電泳圖譜，左邊是第三組的電泳圖譜。1：破菌后的原液 2：50mM咪唑沖洗液 3：100mM咪唑沖洗液 4：250mM咪唑沖洗液 我們以第三組的穿柱液作為標本圖3-2 對照組，未加IPTG誘導1：原液 2：穿透液3：50mM咪唑洗脫液4、100mM咪唑洗脫液5、250mM咪唑洗脫液結(jié)果分析： 1）通過SDS-PAGE鑒定圖譜3-1我們可以看出，通過IPTG的誘導，我們成功得到了目標蛋白。通過與Marker標準蛋白對比，可以看到目標蛋白分子量在33kD-45kD之間；原液中含有大量的目標蛋白，穿柱液中沒有，說明目標蛋白被吸附到了層析柱中。通過第三組和第四組結(jié)果的比對，可以看到第四組在不同濃度咪唑洗脫液得到的目標蛋白的量比第三組多，有可能是因為第四組加樣量多于第三組，或者是50mM沒有完全洗脫便開始100mM咪唑進行洗脫。 2）我們從圖譜中可以看出目標蛋白在50mM咪唑洗脫液和100mM咪唑洗脫液中被洗脫下的量是比較多的，因此我們可以在50-10mM之間尋找最適咪唑液的濃度。3）圖3-2是未加IPTG誘導