細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)室工藝流程2

1、細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)室工藝流程細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)室工藝流程按種類分為：一、試劑耗材入庫(kù)記錄，試劑耗材使用記錄，試劑配制記錄，配制的試劑使用記錄。入庫(kù)需要記錄產(chǎn)品的名稱、批號(hào)、有效期、數(shù)量、存放位置、入庫(kù)時(shí)間。試劑耗材使用記錄包括名稱、批號(hào)、用途，時(shí)間。試劑配制記錄包括原料的名稱、批號(hào)，配制試劑的時(shí)間、有效期、批號(hào)。配制的試劑使用記錄包括使用的時(shí)間、批號(hào)、用途。二、實(shí)驗(yàn)記錄，包括采血、分血、細(xì)胞接種、補(bǔ)液、質(zhì)檢、回輸。采血有 2 個(gè)信息實(shí)驗(yàn)室需要記錄，包括濃縮白細(xì)胞體積和血漿體積。分血有需要記錄使用的分離液的量和單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞接種需要記錄DC、 CIK、 CD3AK、 T、NK 等細(xì)胞接種數(shù)量、培養(yǎng)基體

2、積、細(xì)胞因子添加的量。補(bǔ)液需要記錄補(bǔ)液的時(shí)間和體積。質(zhì)檢需要做細(xì)菌真菌培養(yǎng)、內(nèi)毒素檢測(cè)、革蘭氏檢測(cè)，記錄做這些質(zhì)檢的時(shí)間?；剌斝枰涗浕剌?shù)募?xì)胞種類、時(shí)間、細(xì)胞體積、細(xì)胞數(shù)量。三、細(xì)胞檢測(cè)記錄，包括細(xì)菌真菌培養(yǎng)，內(nèi)毒素檢測(cè)，革蘭氏檢測(cè)，流式檢測(cè)。記錄內(nèi)容包括樣品的來(lái)源、檢測(cè)時(shí)間、結(jié)果、檢測(cè)人。四、清洗消毒記錄。包括清洗消毒的時(shí)間、方式、消毒有效期。DC細(xì)胞2 小時(shí)后洗版第5天加成熟劑 1第6天加成熟劑 2第7天收細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞存活率、細(xì)胞數(shù)后凍存或回輸CIK細(xì)胞第 2天加CIK 混合因子根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況補(bǔ)液回輸前3天細(xì)菌真菌培養(yǎng)回輸前12小時(shí)革蘭氏染色計(jì)算細(xì)胞存活率、細(xì)胞數(shù)后給病人回輸細(xì)胞培養(yǎng)

3、流程圖采血分血細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞接種CD3AK細(xì)胞T細(xì)胞NK 細(xì)胞其它細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況生長(zhǎng)情況生長(zhǎng)情況補(bǔ)液補(bǔ)液補(bǔ)液回輸前 3回輸前 3回輸前 3天細(xì)菌真天細(xì)菌真天細(xì)菌真菌培養(yǎng)菌培養(yǎng)菌培養(yǎng)回輸前12回輸前12回輸前12小時(shí)革蘭小時(shí)革蘭小時(shí)革蘭氏染色氏染色氏染色計(jì)算細(xì)胞計(jì)算細(xì)胞計(jì)算細(xì)胞存活率、細(xì)存活率、細(xì)存活率、細(xì)胞數(shù)后給胞數(shù)后給胞數(shù)后給病人回輸病人回輸病人回輸NO：_自體細(xì)胞制劑制備記錄患者基本情況采血日期：姓名年 齡性別科室病案號(hào)主管醫(yī)生床號(hào)傳染病臨床診斷病理切片細(xì)胞制備標(biāo)準(zhǔn)操作記錄分血數(shù)量單位日期操作人復(fù)核人備注自體血漿體積ml白細(xì)胞體積mlFicol 體積ml批號(hào)：PBMC

4、總量9× 10DC細(xì)胞制備數(shù)量單位日期操作人復(fù)核人備注1、 PBMC 用量8× 102、鋪瓶（板）瓶（板）3、加 DC 培養(yǎng)液體積ml4、 DC誘導(dǎo)因子（ 100X）ml批號(hào)：5、第五天加 DC成熟劑 1（ 100X）ml批號(hào)：6、 第六天補(bǔ)加 DC成熟劑 2（ 100X）ml批號(hào)：7、第七（八）天收集 DC7× 10CIK細(xì)胞制備數(shù)量單位日期操作人復(fù)核人備注1、添加 IFN-rIU2、 PBMC 用量8× 103、接種體積ml4、添加 CIK 混合因子（ 100X）ml批號(hào)：第 1 次第 2 次第 3 次ml5、補(bǔ)液第 4 次第 5 次第 6 次CD3

5、AK 細(xì)胞制備數(shù)量單位日期操作人復(fù)核人備注1、添加 CD3AK 混合因子批號(hào)：（ 100X）ml2、 PBMC 用量8× 103、接種體積ml第 1 次第 2 次4、補(bǔ)液第 3 次ml第 4 次第 5 次T細(xì)胞制備數(shù)量單位日期操作人復(fù)核人備注1、 PBMC 用量9× 102、接種體積ml3 、添加T混合因子批號(hào)：（ 100X）ml第 1 次第 2 次4、補(bǔ)液第 3 次ml第 4 次第 5 次NK 細(xì)胞制備數(shù)量單位日期操作人復(fù)核人備注1、 PBMC 用量8× 102、接種體積ml3、添加 NK 細(xì)胞混合因子批號(hào)：（ 100X）ml第 1 次第 2 次4、補(bǔ)液第 3

6、次ml第 4 次第 5 次細(xì)胞凍存及復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)操作記錄細(xì)胞凍存標(biāo)準(zhǔn)操作記錄日期細(xì)胞細(xì)胞凍存數(shù)量?jī)龃嬉捍娣艔?fù)核人備注編號(hào)數(shù)量（支）編號(hào)操作人類型位置細(xì)胞復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)操作記錄日期細(xì)胞細(xì)胞復(fù)蘇數(shù)量復(fù)蘇存放復(fù)核人備注編號(hào)數(shù)量（支）用途操作人類型位置自體細(xì)胞制劑回輸記錄姓名年齡性別科室病案號(hào)床號(hào)次數(shù)日期細(xì)胞類型批號(hào)體積（ ml）回輸方式運(yùn)送人接收人復(fù)核人123456789101112131415161718自體細(xì)胞制劑檢控記錄次數(shù)細(xì)胞外觀細(xì)菌真菌革蘭氏染色細(xì)菌內(nèi)毒素最終檢定結(jié)果存活率數(shù)量操作人復(fù)核人培養(yǎng)回輸細(xì)胞批均勻懸濁液，無(wú)第一次回輸前 3每次回輸當(dāng)天每次回輸當(dāng)天需經(jīng)檢定合格后存活率號(hào)異物天方可回輸 85%

7、1是 否陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性 陰性合格不合格2是 否陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性 陰性合格不合格3是 否陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性 陰性合格不合格4是 否陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性 陰性合格不合格5是 否陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性 陰性合格不合格6是 否陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性 陰性合格不合格7是 否陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性 陰性合格不合格8是 否陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性 陰性合格不合格9是 否陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性 陰性合格不合格10是 否陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性 陰性合格不合格11是 否陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性 陰性合格不合格12是 否陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性 陰性合格不合格13是 否陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性合格不合格CIK 細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操

8、作流程一、溶液的配置1、 熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無(wú)菌的離心管內(nèi)，放入40 分鐘，取出用2500 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘，取出上清備用。2、 IFN-r 母液（ 1000X）：用無(wú)血清培養(yǎng)基配成100 萬(wàn) IU/ml 。3、 CIK混合因子 (100X)：冰箱 4 度保存。56 攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活4、CIK完全培養(yǎng)基：無(wú)血清培養(yǎng)基加1%-2%熱滅活自體血漿。二、CIK細(xì)胞制備：1、 血細(xì)胞單采機(jī)采集病人濃縮白細(xì)胞和血漿（80-100ml）。2、 準(zhǔn)備 2 支 50ml 離心管，每管加入淋巴細(xì)胞分離液20ml。3、 將濃縮白細(xì)胞從血袋中取出， 直接等量加到上述2 支 50ml 離心管淋

9、巴細(xì)胞分離液上面， 2000轉(zhuǎn)離心 25 分鐘，升降速調(diào)到最低值。4、 取出上層的血漿收集到一支50ml 離心管中，余下的部分除紅細(xì)胞外全部收集到2 支 50ml 離心管中，加生理鹽水到50ml，1500 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘，去除上清，合并2 支管內(nèi)的細(xì)胞到一支50ml 離心管中，加 50ml 生理鹽水，取 20ul 樣品用于計(jì)數(shù)， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘，去除上清。5、 所有的血漿留出 12 支 5ml 用于回輸，其余全部56 攝氏度滅活 40 分鐘，滅活完成后2500 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘，收集上清備用。6、 將細(xì)胞用 CIK完全培養(yǎng)基配成1X106/ml ，加入 IFN-r 母液至 1

10、000IU/ml ，接種 1 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)袋，袋內(nèi)加 200ml CIK完全培養(yǎng)基。7、 24 小時(shí)后，按 1:100 加入 CIK混合因子。8、 第 5 天，按 4 倍稀釋添加含 300IU/ml IL-2 的 CIK完全培養(yǎng)基。9、 第 8 天到第 9 天，按 2 倍稀釋添加含 300IU/ml IL-2 的 CIK完全培養(yǎng)基。同時(shí)取樣做細(xì)菌真菌培養(yǎng)。10、以后每隔一天按2 倍稀釋補(bǔ)一次液，第一次回輸前1 天取樣送檢做革蘭氏染色檢查。11、等拿到細(xì)菌真菌培養(yǎng)結(jié)果后， 檢查所有結(jié)果是否為陰性。 CIK培養(yǎng)到第 10 天 -15 天內(nèi)回輸。12、回輸時(shí)收集細(xì)胞于離心管內(nèi)，1200 轉(zhuǎn)離心 7 分

11、鐘，去除上清，收集細(xì)胞后加生理鹽水再離心 2 次， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘。13、將收集到的細(xì)胞加入到150ml 注射用生理鹽水中，加入5ml 自體血漿， 2 萬(wàn) IU IL-2，留1ml 細(xì)胞懸液到 1.5ml 離心管中， 4 攝氏度存放 3 月備查。14、 將完成的細(xì)胞懸液封好瓶口，核對(duì)病人姓名、性別、年齡、住院號(hào)、細(xì)胞數(shù)、無(wú)菌結(jié)果、病區(qū)及治療項(xiàng)目，確認(rèn)無(wú)誤后，貼上標(biāo)簽，送病區(qū)進(jìn)行回輸。DC 細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程一、溶液的配置1、熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無(wú)菌的離心管內(nèi)，放入56 攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活40分鐘，取出用 2500 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘，取出上清備用。2、DC基礎(chǔ)培

12、養(yǎng)基：用無(wú)血清培養(yǎng)基+2%熱滅活自體血漿。3、DC誘導(dǎo)劑 (100X）：冰箱 4 度保存。4、DC培養(yǎng)基： DC基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入DC 誘導(dǎo)劑4、DC成熟劑 1(100X）：冰箱 4 度保存。5、DC成熟劑 2（100X）：冰箱 4 度保存。二、DC細(xì)胞制備：6養(yǎng)箱。2、 2 小時(shí)后，取出，晃動(dòng)去除上層雜細(xì)胞，留下貼壁的單核細(xì)胞（體積比其它細(xì)胞稍大），每孔加入 3ml DC 培養(yǎng)基。3、 第 5 天，按每孔 30ul 加入 DC成熟劑 1，取樣做細(xì)菌、真菌培養(yǎng)。4、 收集細(xì)胞前 12 小時(shí)每孔加入 30ul DC成熟劑 2，同時(shí)取樣送檢做革蘭氏染色檢查。5、 DC培養(yǎng)到第 7-8 天，收集細(xì)胞，用

13、生理鹽水洗3 次，分成 4 份，其中一份用于當(dāng)天回輸，其余凍存在 -80 度冰箱中。6、 將生理鹽水清洗過的DC 細(xì)胞加入到 150ml 注射用生理鹽水中，加入5ml 自體血漿，留1ml細(xì)胞懸液到 1.5ml 離心管中， 4 攝氏度存放 3 月備查。7、 將完成的細(xì)胞懸液封好瓶口，核對(duì)病人姓名、性別、年齡、住院號(hào)、細(xì)胞數(shù)、無(wú)菌結(jié)果、病區(qū)及治療項(xiàng)目，確認(rèn)無(wú)誤后，貼上標(biāo)簽，送病區(qū)進(jìn)行回輸。CD3AK細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程一、溶液的配置1、熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無(wú)菌的離心管內(nèi)，放入56 攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活 40 分鐘，取出用 2500 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘，取出上清備用。2、CD3AK混

14、合因子 (100X）：冰箱 4 度保存。3、CD3AK完全培養(yǎng)基：無(wú)血清培養(yǎng)基+1%-2%熱滅活自體血漿 + CD3AK混合因子。二、CD3AK細(xì)胞制備：1X106/ml ，接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋培養(yǎng)。1、PBMC用 CD3AK完全培養(yǎng)基配成2、第 5 天，按 4 倍稀釋添加 CD3AK完全培養(yǎng)基。3、第 8 天到第 9 天，按 2 倍稀釋添加 CD3AK完全培養(yǎng)基。同時(shí)取樣做細(xì)菌真菌培養(yǎng)。4、以后每隔一天按 2 倍稀釋補(bǔ)一次液，第一次回輸前 1 天取樣送檢做革蘭氏染色檢查。5、等拿到細(xì)菌真菌培養(yǎng)結(jié)果后，檢查所有結(jié)果是否為陰性。CD3AK培養(yǎng)到第 10 天 -15 天內(nèi)回輸。6、回輸時(shí)收集細(xì)胞于離

15、心管內(nèi)， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘，去除上清，收集細(xì)胞后加生理鹽水再離心 2 次， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘。7、將收集到的細(xì)胞加入到 150ml 注射用生理鹽水中，加入5ml 自體血漿， 2 萬(wàn) IU IL-2，留1ml 細(xì)胞懸液到 1.5ml 離心管中， 4 攝氏度存放 3 月備查。8、將完成的細(xì)胞懸液封好瓶口，核對(duì)病人姓名、性別、年齡、住院號(hào)、細(xì)胞數(shù)、無(wú)菌結(jié)果、病區(qū)及治療項(xiàng)目，確認(rèn)無(wú)誤后，貼上標(biāo)簽，送病區(qū)進(jìn)行回輸。 T 細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程一、溶液的配置1、熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無(wú)菌的離心管內(nèi)，放入56 攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活 40 分鐘，取出用 2500 轉(zhuǎn)離心 10

16、分鐘，取出上清備用。2、 T 混合因子 (100X）：冰箱 4 度保存。3、完全培養(yǎng)基：無(wú)血清培養(yǎng)基 1%-2%熱滅活自體血漿。二、 T 細(xì)胞制備：1、將 PBMC用完全培養(yǎng)基配成 2X106/ml ，加入混合因子，接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋培養(yǎng)。2、第5天，按 2倍稀釋添加含 400IU/ml IL-2 的完全培養(yǎng)基。3、第8天到第 9天，按 2 倍稀釋添加含 400IU/ml IL-2 的完全培養(yǎng)基。 同時(shí)取樣做細(xì)菌真菌培養(yǎng)。4、以后每隔一天按 2 倍稀釋補(bǔ)一次液，第一次回輸前 1 天取樣送檢做革蘭氏染色檢查。5、等拿到細(xì)菌真菌培養(yǎng)結(jié)果后，檢查所有結(jié)果是否為陰性。T 培養(yǎng)到第 10 天 -15 天

17、內(nèi)回輸。6、回輸時(shí)收集細(xì)胞于離心管內(nèi)， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘，去除上清，收集細(xì)胞后加生理鹽水再離心2 次， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘。7、將收集到的細(xì)胞加入到150ml 注射用生理鹽水中，加入 5ml 自體血漿，留 1ml 細(xì)胞懸液到 1.5ml離心管中， 4 攝氏度存放 3 月備查。8、將完成的細(xì)胞懸液封好瓶口，核對(duì)病人姓名、性別、年齡、住院號(hào)、細(xì)胞數(shù)、無(wú)菌結(jié)果、病區(qū)及治療項(xiàng)目，確認(rèn)無(wú)誤后，貼上標(biāo)簽，送病區(qū)進(jìn)行回輸。NK 細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程一、溶液的配置1、熱滅活自體血漿的制備：將自體血漿裝在無(wú)菌的離心管內(nèi)，放入56 攝氏度水浴鍋內(nèi)熱滅活40 分鐘，取出用 2500 轉(zhuǎn)離心 10

18、分鐘，取出上清備用。2、NK 細(xì)胞混合因子 (100X）：冰箱 4 度保存。3、完全培養(yǎng)基： SCGM無(wú)血清培養(yǎng)基 +1%-2%熱滅活自體血漿。二、 NK 細(xì)胞制備：1、將 PBMC用完全培養(yǎng)基配成 1X106/ml ，加入 NK 細(xì)胞混合因子，接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋培養(yǎng)。2、第 5 天，添加 2 倍量完全培養(yǎng)基，加入 500IU/ml IL-2。3、第 8 天到第 9 天，按 2 倍稀釋添加含 500IU/ml IL-2 的完全培養(yǎng)基。 同時(shí)取樣做細(xì)菌真菌培養(yǎng)。4、以后每隔一天按 2 倍稀釋補(bǔ)一次液，第一次回輸前 1 天取樣送檢做革蘭氏染色檢查。5、等拿到細(xì)菌真菌培養(yǎng)結(jié)果后，檢查所有結(jié)果是否為陰

19、性。NK 培養(yǎng)到第 10 天-15 天內(nèi)回輸。6、回輸時(shí)收集細(xì)胞于離心管內(nèi)， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘，去除上清，收集細(xì)胞后加生理鹽水再離心2 次， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘。7、將收集到的細(xì)胞加入到 150ml 注射用生理鹽水中，加入 5ml 自體血漿，留 1ml 細(xì)胞懸液到 1.5ml離心管中， 4 攝氏度存放 3 月備查。8、將完成的細(xì)胞懸液封好瓶口，核對(duì)病人姓名、性別、年齡、住院號(hào)、細(xì)胞數(shù)、無(wú)菌結(jié)果、病區(qū)及治療項(xiàng)目，確認(rèn)無(wú)誤后，貼上標(biāo)簽，送病區(qū)進(jìn)行回輸。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)操作流程一、溶液的配置1、程序降溫盒的準(zhǔn)備：按程序降溫盒上的標(biāo)示量加入250ml 異丙醇作為冷凍液，室溫放置。2

20、、凍存液的配置：熱滅活自體血漿加入 10% DMSO。9、細(xì)胞凍存1、將要凍存的細(xì)胞離心 1200rpm，7min ，去除舊的培養(yǎng)液。62、 輕輕混勻細(xì)胞沉淀，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，DC 細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為5× 10/ml778，每管凍存 1-2ml。2× 10/ml ，每管凍存 0.5ml；PBMC調(diào)整細(xì)胞密度為 1× 10/ml2× 10/ml3、將細(xì)胞分裝入凍存管中，在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，病人名稱，病人編號(hào)，凍存時(shí)間。4、將凍存管放入室溫狀態(tài)的程序降溫盒，直接置入-80冰箱。5、程序降溫盒內(nèi)的異丙醇需要定期添加，防止蒸發(fā)造成冷凍液不足。1

21、0、細(xì)胞復(fù)蘇1、在離心管內(nèi)先準(zhǔn)備好凍存液體積 10 倍以上的清洗液 （DC用生理鹽水、 PBMC用培養(yǎng)基）。2、水浴鍋內(nèi)水溫達(dá)到 37 度。3、將凍存管放入水浴鍋內(nèi)，不?；蝿?dòng)，直到全部融化為止，一般要求在1 分鐘內(nèi)融化完畢。4、將細(xì)胞盡快轉(zhuǎn)移到清洗液中， 1200 轉(zhuǎn)離心 7 分鐘，去除上清，得到復(fù)蘇后的細(xì)胞。其中專業(yè)理論知識(shí)內(nèi)容包括：保安理論知識(shí)、消防業(yè)務(wù)知識(shí)、職業(yè)道德、法律常識(shí)、保安禮儀、救護(hù)知識(shí)。作技能訓(xùn)練內(nèi)容包括：崗位操作指引、勤務(wù)技能、消防技能、軍事技能。二培訓(xùn)的及要求培訓(xùn)目的安全生產(chǎn)目標(biāo)責(zé)任書為了進(jìn)一步落實(shí)安全生產(chǎn)責(zé)任制，做到“責(zé)、權(quán)、利”相結(jié)合，根據(jù)我公司2015 年度安全生產(chǎn)目標(biāo)的內(nèi)容，現(xiàn)與財(cái)務(wù)部 簽訂如下安全生產(chǎn)目標(biāo)：一、目標(biāo)值：1 、全年人身死亡事故為零，重傷事故為零，輕傷人數(shù)為零。2 、現(xiàn)