基因工程復(fù)習(xí)題匯總(研究生課程)

1、名詞解釋：1. 鳥(niǎo)槍法：隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組 DNAt段，然后通過(guò)快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。2. cDNA法：互補(bǔ)DNA（Complementary DNA cDNA是一種利用逆轉(zhuǎn)錄酶，以RNA（通常是mR明為模板作成的復(fù)制品，經(jīng)常用來(lái)將真核生物的基因（以 mRNA 形式）復(fù)制到原核生物細(xì)胞中。3. PCR法：又稱為聚合酶鏈反應(yīng)或 PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快速的體外 DNA聚合程序。4. 基因庫(kù) : 特定生物體全基因組的集合（天然存在）。5. 基因文庫(kù)：從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建）6. PCR

2、（多聚酶鏈反應(yīng)）：是一種在體內(nèi)快速擴(kuò)增特定基因或 DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。在待擴(kuò)增的DNAt段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩 個(gè)寡核甘酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNAT增2n倍。7. 原位PCR5術(shù)：即聚合酶原位擴(kuò)增技術(shù)。將PC曲術(shù)與原位雜交技術(shù)結(jié)合起來(lái)， 不改變周圍組織的原有位置，直接在組織、細(xì)胞或病原體原位研究基因變化的技術(shù)。8. 熒光定量PCR在普通PCR勺基礎(chǔ)上加入非特異性的嵌入熒光染料或者特異性熒光探針，來(lái)反映或者更具特異性和專一性地反映PCR反應(yīng)體系中總的核酸量。9. 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：是指在PCRS應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PC

3、Fffi程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見(jiàn)”，最后通過(guò) Ct值和標(biāo) 準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA（或cDNA的起始濃度進(jìn)行定量的方法。10. 質(zhì)粒：通過(guò)不同途徑將承載的外源 DN*段（基因）帶入受體細(xì)胞且能在其中維持的DNA子。也成為DNAS隆載體。11. 同尾酶：識(shí)別位點(diǎn)不同，酶切后產(chǎn)生同樣的粘性末端的兩種酶。12. 同裂酶：識(shí)別序列相同，對(duì)甲基化位點(diǎn)敏感性不同的兩種酶。13. 轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒DN的子通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過(guò)程。14. 轉(zhuǎn)導(dǎo)：轉(zhuǎn)導(dǎo)是指通過(guò)病毒將一個(gè)宿主的 DNA專移到另一個(gè)宿主的細(xì)胞中而引 起的基因重組現(xiàn)象。15. 轉(zhuǎn)染：是針對(duì)真核細(xì)胞而言的，等同于轉(zhuǎn)導(dǎo)。真

4、核細(xì)胞由于外源DNAt入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過(guò)程16. 包涵體 ： 在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地聚集在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)成為包涵體。17. 端粒重復(fù)序列（ TEL） ： 定位于染色體末端一段序列，用于保護(hù)線狀的DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。18. 著絲粒（CEN） ：有絲分裂過(guò)程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過(guò)程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)人工染色體 的作用。19. 自主復(fù)制序列（ARS : 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNAa行雙向復(fù) 制所必須的信號(hào)。20. 原生質(zhì)

5、體：原生質(zhì)體指在人為條件下，去除原有細(xì)胞壁或抑制新生細(xì)胞壁后所得到的僅有一層細(xì)胞膜包裹著的圓球狀對(duì)滲透敏感的細(xì)菌。21. 模式生物：生物學(xué)家通過(guò)對(duì)選定的生物物種進(jìn)行科學(xué)研究，用于揭示某種具有普遍規(guī)律的生命現(xiàn)象，這種被選定的生物物種就是模式生物。22. 基因擴(kuò)增現(xiàn)象：基因擴(kuò)增是外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊方式。經(jīng)過(guò)壓力篩選，相應(yīng)的基因/ 酶高表達(dá)，附近的基因都會(huì)相應(yīng)的擴(kuò)增的一種現(xiàn)象。23. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：就是把外源性目的基因?qū)雱?dòng)物的受精卵或其胚囊細(xì)胞中，后改用注入受精卵的任何一個(gè)前核，并在細(xì)胞基因組中穩(wěn)定整合，再將合格的重組受精卵或胚囊細(xì)胞篩選出來(lái)，采用借腹懷孕法寄養(yǎng)在雌性動(dòng)物

6、的子宮內(nèi)，使之發(fā)育成具表達(dá)目的基因的胚胎動(dòng)物，并能傳給下一代。這樣， 生育的動(dòng)物為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。24. 細(xì)胞系： 從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可無(wú)限繁殖。25. 細(xì)胞株：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。26. 凝膠過(guò)濾：是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對(duì)混合物中各組分按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)，又稱為分子篩。27. 電泳 ：帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象28. 鹽溶現(xiàn)象：加入離子有助于分散大分子上所帶的電荷而使溶解度提高。29. 鹽析 ：離子強(qiáng)度提高到超多某一數(shù)值，帶點(diǎn)分子將會(huì)沉淀下來(lái)。30. 親和層析：酶的底物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑通過(guò)共價(jià)

7、鍵與惰性載體相連接，形成親和載體。當(dāng)混合物通過(guò)親和載體時(shí)，酶由于與底物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑之間由非共價(jià)鍵特異性相互作用而保留在柱子上，其他酶和雜蛋白被洗出柱子。然后加入底物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，或改變pH 或離子強(qiáng)度使結(jié)合的酶解吸，從而達(dá)到分離的目的。31. 酶的必需基團(tuán)：與酶活性有關(guān)的基因。32. 酶的活性中心：由必需基因構(gòu)成的與酶催化活性有關(guān)的特定區(qū)域。33. 酶的化學(xué)修飾： 通過(guò)化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。34. 定向進(jìn)化技術(shù)：人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外對(duì)基因驚醒隨機(jī)突變，從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的親本酶出發(fā)，經(jīng)過(guò)基因的突變和重組， 構(gòu)建一個(gè)人工突變酶庫(kù)，通過(guò)一定的

8、篩選或選擇方法最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進(jìn)化酶。35. 核酸分子雜交：分子單鏈之間的互補(bǔ)堿基通過(guò)非共價(jià)鍵（主要是氫鍵）的形成即出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)。36. 生物芯片：指通過(guò)自動(dòng)印跡或光引導(dǎo)化學(xué)合成技術(shù)在硅片、玻璃、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微陣列，根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過(guò)程集成于芯片表面，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、 基因及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。37. 蛋白芯片：又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)分子作為配基，將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其他分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測(cè)方式

9、測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，來(lái)分析蛋白之間或蛋白與其他分子之間的相互作用關(guān)系。38. 微流控芯片實(shí)驗(yàn)室：是以微流控技術(shù)為基礎(chǔ)，把各種基本操作單元（細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解、樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等）集成到一塊幾平方厘米的芯片上， 由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)而取代常規(guī)生物或化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的各種功能。簡(jiǎn)答題：一、基因工程技術(shù)的主要內(nèi)容或步驟：1 .從復(fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過(guò)酶切消化或PCFT增等步驟，分離出帶有目的 基因的DN端段。2 .在體外，將帶有目的基因的外源DNNt段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇 記號(hào)的載體分子上，形成重組 DN的子。3 .將重組DNA子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱

10、寄主細(xì)胞），并與之一起增殖。4 .從大量的細(xì)胞繁殖群體中,篩選出獲得了重組 DN6子的受體細(xì)胞克隆。5 . 從這些篩選出來(lái)的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用。6 . 將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。二、PCR術(shù)的原理：1. 變性在加熱或堿性條件下可使DNA螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈 DNA稱之為變 性。2. 退火是模板與引物的復(fù)性。引物是與模板某區(qū)序列互補(bǔ)的一小段DNRt段。3. 延伸從結(jié)合在特定DNA真板上的引物為出發(fā)點(diǎn)，將四種脫氧核甘酸以堿基配對(duì)形式按5 -3的方向沿著模板順序合成新的 DNA

11、o三、成為質(zhì)粒的必備條件1. 克隆位點(diǎn)（一個(gè)或多個(gè)）2. 能攜帶外源DNRt段進(jìn)入受體細(xì)胞：能自我復(fù)制，或整入染色體隨受體細(xì)胞 DN限制而復(fù)制。3. 有選擇克隆子的標(biāo)記基因。4. 安全性（不含損害受體的基因，不任意轉(zhuǎn)入別的，尤其人的細(xì)胞）四、質(zhì)粒克隆載體構(gòu)建的基本策略（提高基因的表達(dá)，應(yīng)如何增加質(zhì)粒上的元件）1. 能進(jìn)行有效復(fù)制復(fù)制起始位點(diǎn)（最好是多拷貝）2. 克隆位點(diǎn)一一組裝MCS1桿3. 選擇標(biāo)記基因抗性基因， Lac Z 基因4. 分子盡可能?。ㄞD(zhuǎn)化率高），若分子量15kb,轉(zhuǎn)化率大大降低5. 組裝各種“元件”，如啟動(dòng)子、終止子等。五、核酸內(nèi)切酶的分類1. 識(shí)別和切割位點(diǎn)不固定，隨機(jī)性。

12、2 .能在識(shí)別位點(diǎn)處切割DNA切割位點(diǎn)固定。核酸內(nèi)切酶活性和甲基化活性是分開(kāi)的。常用。3 . 核酸內(nèi)切酶活性和甲基化活性是不分開(kāi)的。六、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：1. DNA 的純度2. DNA 的甲基化（ 1）基因工程使用失去甲基化酶的大腸桿菌（2）研究基因工程DNA甲基化程度（ 3）改變限制酶的識(shí)別特性3. 溫度4. 分子結(jié)構(gòu) （對(duì)于具有超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒來(lái)說(shuō)，切割時(shí)間要長(zhǎng)，一般都是過(guò)夜；而對(duì)線性結(jié)構(gòu)的DN端段來(lái)說(shuō)，2-3小時(shí)即可）5. 限制酶的緩沖液【星號(hào)活性】： 在非理想的條件下，內(nèi)切酶切割與識(shí)別位點(diǎn)相似但不完全相同的序列的現(xiàn)象。七、作為基因工程的宿主細(xì)胞必須具備以下特性:1. 便于重

13、組DNA子的導(dǎo)入2. 能使重組DN的子穩(wěn)定存在于細(xì)胞3. 便于重組體的篩選4. 遺傳性穩(wěn)定高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長(zhǎng)5. 安全性高，無(wú)致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成生物污染6. 在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價(jià)值八、影響轉(zhuǎn)化率的因素1 .分子質(zhì)量較小的重組質(zhì)粒DNA子轉(zhuǎn)化率較高2 .組成重組DN的子的載體類型及其結(jié)構(gòu)3 .重組DNA子的濃度和純度九、大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素1. SD序列將mRNAg位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯2. 翻譯起始密碼子3. SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成（一般距離7 個(gè)堿基較好）4. 基因編碼區(qū)5端若干密碼子的堿基序列十、包涵體的

14、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 1. 能簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作2. 能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定缺點(diǎn)： 以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過(guò)有效的變性復(fù)性操作，而這一操作實(shí)現(xiàn)起來(lái)較困難。十一、分泌性異源蛋白的表達(dá)以及其優(yōu)缺點(diǎn)在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白按其在細(xì)胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；或者通過(guò)運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過(guò)外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號(hào)肽序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前 提條件。優(yōu)點(diǎn)：1.目的蛋白穩(wěn)定性高2.目的蛋白易于分離3.目的蛋白末端完整缺點(diǎn)：1.大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制不健全 2.外源真核生物基因很難在大腸桿 菌

15、中分泌表達(dá)，少數(shù)即便能表達(dá)其效率也很低十二、融合型異源蛋白的表達(dá)以及優(yōu)缺點(diǎn)將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個(gè)開(kāi)放型閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。優(yōu)點(diǎn)：1.目的蛋白穩(wěn)定性高2.目的蛋白易于分離3.目的蛋白表達(dá)率高4.目的蛋白溶解性好缺點(diǎn)：1.融合時(shí)要將目的基因切開(kāi)，可能會(huì)造成結(jié)構(gòu)的改變2.目的蛋白需要回收：融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲得目的蛋白。十三、酵母雙雜交的基本原理1 .酵母雙雜交系統(tǒng)首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。2 .典型的真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：DNA吉合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。前者可識(shí)別DNA1的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄酶激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié) 的基

16、因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域不但可以在其連接區(qū)適當(dāng)部位打開(kāi)仍具有各自的功 能，而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。十四、噬菌體展示ScFv抗體操作示例。PCR產(chǎn)物的酶切（先平連再消化）電穿?蕾化EColi TGI細(xì)胞的制備 I庫(kù)的遙反應(yīng)I載體的酶切抗體庫(kù)的構(gòu)建頓幅入hflAAM喉性為枸震輕輻，Rm領(lǐng)加入蛹崛施體,力nA卡那森素-PEG Nd。收集活畦雌制 臣粒DNA，VM 二二二奉新 金屋宇通用載 體，利用通用 引瞬序口* PC R亙MS序a） E USA植刎 用特異型鏤剜 c|惇列刻定 親和性刎定 日普性別定檢測(cè)分泌型Scfv

17、的產(chǎn)生A 測(cè)序十五、單克隆抗體雜交瘤技術(shù)與噬菌體抗體展示技術(shù)的比較單克隆抗體雜父瘤技術(shù)噬國(guó)體抗體展小技術(shù)宿主細(xì)胞雜交瘤細(xì)菌免疫必須可避免基因獲取冉克隆直接篩選十六、Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制Ti質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制覆傷的植物根群會(huì)分 泌出丁香酸衍生物，它們 能德音11質(zhì)粒上的r“底因 以及根瘤菌染色體上的一 個(gè)操縱手表達(dá)n產(chǎn)基因產(chǎn) 物特Ti質(zhì)拉上的T DNA單鏈 切下.而根痼菌染色體上 的掾縱子表達(dá)產(chǎn)物則與單 能I-DNA結(jié)合形成復(fù)合物， 后者轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞十七、原生質(zhì)體的再生程序（理解）將原生質(zhì)體懸浮液滴在無(wú)菌濾紙片上， 并置于含有普通植物細(xì)胞（即所謂的 滋養(yǎng)細(xì)胞）的固體再生培養(yǎng)基的表面，使原生

18、質(zhì)體與滋養(yǎng)細(xì)胞不直接接觸， 但可 吸收由滋養(yǎng)細(xì)胞分泌擴(kuò)散出來(lái)的植物生長(zhǎng)因子及其他化合物；培養(yǎng)2-3周后，將濾紙上的植物細(xì)胞族轉(zhuǎn)移至含有高濃度分裂素和低濃度生長(zhǎng)素的固體培養(yǎng)基上 繼續(xù)培育2-4周，濾紙片上便長(zhǎng)出嫩芽；將嫩芽置入含有低濃度生長(zhǎng)素而無(wú)分裂 素的固體培養(yǎng)基上，使其根部發(fā)育；大約3周后再將之移植在土壤中，長(zhǎng)成整株 植物。十八、利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法分離基因的步驟1 .構(gòu)建含轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒載體2 .將質(zhì)粒載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)或其他適當(dāng)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入目標(biāo)植物中3 .分離和鑒定轉(zhuǎn)座子插入突變體4 .檢測(cè)轉(zhuǎn)座子在目標(biāo)植物體內(nèi)的活動(dòng)性能5 .利用轉(zhuǎn)座子序列或克隆轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列作為探針從插入突變體中分離克隆

19、目的基因。十九、昆蟲(chóng)基因工程的研究主要在三大物種果蠅系統(tǒng)：P元件蚊蟲(chóng)和農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)系統(tǒng)：轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化家蠶系統(tǒng)：表達(dá)異源功能蛋白及病毒轉(zhuǎn)染為特征二十、桿狀病毒作為載體的特性1 .病毒基因組較大，可以插入相當(dāng)大的外源 DNA2 .病毒對(duì)脊椎動(dòng)物細(xì)胞無(wú)致病性3 .病毒基因組可以大量表達(dá)外源基因。而且表達(dá)的產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外面不致引 起病毒或細(xì)胞的早日破裂，也有利于產(chǎn)物的分離提取。4 .外源DNA雨入多角體蛋白基因內(nèi)，使此基因功能失活，不能再合成多角體蛋 白，也就不能形成包涵體。用離心方法即可將其篩選出來(lái)。5 .桿狀病毒一一昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)能夠完成翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾，使外源產(chǎn)物具有生物活性。二十一、高等哺乳動(dòng)

20、物受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件1 .細(xì)胞系特征：?jiǎn)适Ъ?xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大規(guī)模培養(yǎng)2 .遺傳穩(wěn)定性：外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長(zhǎng)期保存3 .合適的標(biāo)記：便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持4 .生長(zhǎng)快且齊：分裂周期短，生長(zhǎng)均一，便于控制5 .安全性能好：不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌二十二、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞噂吟吟甘酸生物合成途徑麻嚀核昔酸生物合成除仔5-磷酸核糖仁焦磷酸(PRPP)從頭合成途徑宜基喋嶺(AP)原啜徒核甘一磷酸(UMP)氨基喋吟(An)GMP，次黃噤嶺核昔一瞬 (HMP . AMP胸腹嗒碇核苜一磷酸TMP(HPRT)補(bǔ)救合成途任次黃噤吟磷酸核耦轉(zhuǎn)移酶(TK)”胸展窟吃

21、核昔激酶次黃喋吟核昔(HR)胸服啜喘核昔(TR)二十三、培育基因靶向性敲除小鼠的實(shí)施步驟1 .首先將某基因突變?yōu)辄c(diǎn)經(jīng)同源重組引入小鼠 ES細(xì)胞2 .將含有靶向敲除的突變基因位點(diǎn)的 ES細(xì)胞注入小鼠早期胚胎中，孕育出嵌 合小鼠3 .檢測(cè)嵌合小鼠交配后的生殖細(xì)胞內(nèi)是否整合有突變的基因位點(diǎn)4 .在各只敲除的突變基因位點(diǎn)雜合行小鼠之間交配，以產(chǎn)生純合性基因敲除小鼠二十四、細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題1 .培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例2 . pH :初培養(yǎng)pH應(yīng)為7.4 ,培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)不低于7.03 .培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的空間：一般培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:104 .容積、深度、表面面積5 .去除死細(xì)胞6

22、.溫度控制：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度波動(dòng)的敏感性很大。溫度低于36.5 C,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，高于37.5 C,細(xì)胞存活力降低。二十五、細(xì)胞克隆技術(shù)的方法1 .稀釋鋪板法2 .飼養(yǎng)層克隆法3 .膠原膜板或纖維蛋白膜板克隆法4 .瓊脂克隆法5 .在瓊脂基底上用甲基纖維素克隆法二十六、細(xì)胞系鑒定指標(biāo)1 .形態(tài)學(xué)：活細(xì)胞觀察；固定染色觀察培養(yǎng)細(xì)胞2 .染色體：采用染色體數(shù)目、核型分析以及染色體分帶技術(shù)檢測(cè)3 .同工酶譜：通常采用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、核甘磷酸化酶三種 方法，根據(jù)條件選擇4 .細(xì)胞DNA傳特性：一般采用Southern印跡雜交法檢測(cè)。二十七、哺乳動(dòng)物細(xì)胞冷凍以及解凍要點(diǎn)：慢凍快化二

23、十八、酶的分離方法依據(jù)方法大小或質(zhì)量離心、凝膠過(guò)濾、透析、超過(guò)濾電荷離了交換色譜、電泳、等電聚焦溶解度及化改變pH改變離子強(qiáng)度、降低介電常數(shù)特異性結(jié)合位置親和色譜、親和洗提其他方法熱變性、羥基磷灰石色譜、疏水色譜、 冷凍干燥濃縮二十九、離子交換介質(zhì)的選擇原則1）離子交換劑選擇：考慮酶穩(wěn)定性需要用陽(yáng)離子交換劑。用陰離子交換劑二種交換劑都可用酶蛋白在 pI的pH條件下穩(wěn)定 酶蛋白在pI的pH條件下穩(wěn)定 在 pI pH, pl pH條件下均穩(wěn)定2）如何選擇強(qiáng)型和弱型交換劑酶蛋白pl在6或9時(shí)考慮用強(qiáng)型離子交換劑酶蛋白是強(qiáng)型或弱型離子考慮到酶的不穩(wěn)定性，交換劑通用弱型三十、具有特異性親和作用的生物分子

24、1 .抗原與抗體2 . DNA 與互補(bǔ) DNM RNA3 .酶與其底物、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、輔酶因子4 .激素或藥物與其受體5 .維生素與其特異性結(jié)合蛋白6 .糖蛋白與其相應(yīng)的植物凝集素三十一、酶分離純化的基本原則1）切記酶是蛋白質(zhì)，防止酶失活變性a低溫b. 一般中性，pH4,10不穩(wěn)定c.蛋白變性d.重金屬，有機(jī)溶劑，微生物及蛋白酶污染2）不同的方法結(jié)合3）追蹤酶分離每一步的總活力和比活力，判別每步方法的可行性三十二、原核細(xì)菌表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)物的質(zhì)量檢測(cè)項(xiàng)目與方法檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)方法產(chǎn)品是否含有內(nèi)毒素家兔熱源法蛋白質(zhì)是否父異肽譜、HPLC等電聚焦甲硫氨酸是否被甲?；淖V、質(zhì)譜、HPLC Edmanb析蛋白質(zhì)是否父性、聚合、脫氨基SDS-PAGE凝膠層析、等電聚焦、質(zhì)譜、HPLC配體是否脫落SDS-PAGE免疫分析氨基酸是否發(fā)生取代氨基酸分析、肽譜、質(zhì)譜產(chǎn)品是否被細(xì)菌、病毒