實(shí)驗(yàn)5氨基酸類物質(zhì)的紫外光譜分析和定量測(cè)定(20210111031517)

1、氨基酸類物質(zhì)的紫外光譜分析和定量測(cè)定張明鉉 PB15030833開課實(shí)驗(yàn)室：環(huán)境資源樓312【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、掌握紫外分光光度法的分析原理與基本操作，熟悉紫外分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)，掌握其使用方法。2、學(xué)習(xí)紫外可見吸收光譜的繪制及定量測(cè)定方法。3、了解氨基酸類物質(zhì)的紫外吸收光譜的特點(diǎn)?！净驹怼吭砀攀觯鹤贤夤庾V等物質(zhì)的吸收光譜可以反映物質(zhì)在不同的光譜區(qū)域內(nèi)吸收能力的分布情況，不同的物質(zhì)因分子結(jié)構(gòu)不同，吸收光譜也不同，可以從波形、波峰的強(qiáng)度、位置及其數(shù)目反映出來，因此，吸收光譜帶有分子結(jié)構(gòu)與組成的信息。紫外分光光度法:類型：吸收光譜法。原理：電子的躍遷：電子由于受到光、熱、電等的激發(fā)，從一個(gè)能

2、級(jí)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)能級(jí)的現(xiàn)象。這是因?yàn)榉肿又械碾娮涌偸翘幵谀骋环N運(yùn)動(dòng)狀態(tài)中，每一種狀態(tài)都具有一定的能量，屬于一定的能級(jí)。當(dāng)這些電子吸收了外來輻射的能量，就從一個(gè)能量較低的能級(jí)躍遷到另一個(gè)能量較高的能級(jí)。作圖原理:物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光線具有不同的吸收能力，如果改變通過某一吸收物質(zhì)的入射光的波長(zhǎng),并紀(jì)錄該物質(zhì)在每一波長(zhǎng)處的吸光度A,然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖，這樣得到的譜圖為該物質(zhì)的吸收光譜或吸收曲線;定量關(guān)系:、/當(dāng)一定波長(zhǎng)的光通過某物質(zhì)的溶液時(shí)，入射光強(qiáng)度Io與透過光強(qiáng)度It之比的對(duì)數(shù)與該物質(zhì)的濃度c及厚度b成正比。其數(shù)學(xué)表達(dá)式，即Lambert-Beer定律，為:這是是分光光度法定量

3、分析的基礎(chǔ),log ¥ = -logT = kbcT為透光率（比）。儀器構(gòu)造:圖1紫外分光光度計(jì)儀器簡(jiǎn)圖池 品 樣氨基酸:定義：含有氨基和羧基的有機(jī)物，是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位。光學(xué)性質(zhì)：對(duì)光有吸收作用。20種氨基酸在可見光區(qū)域均無光吸收，在遠(yuǎn)紫外區(qū)（<220 nm）均有光吸收,在（近）紫外區(qū)（220 nm 300 nm）只有三種氨基酸有光吸收能力（苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr八色氨酸（Trp）,因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)構(gòu)均含有含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)。苯丙氨酸最大吸收波長(zhǎng)在 259 nm、酪氨酸在278 nm、色氨酸在279 nm，蛋白質(zhì)一般都含有這三種氨基酸殘基，所以其最

4、大光吸收在大約280 nm波長(zhǎng)處，因此能利用紫外分光光度法很方便的測(cè)定蛋白質(zhì)的含量?！緝x器與試劑】1、儀器：紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)（UV-3600或UV-2401）；0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL 移液管若干;10 mL帶塞比色管若干；2、試劑：標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）: 100mg/L的酪氨酸溶液;標(biāo)準(zhǔn)溶液（b）: 100mg/L的色氨酸溶液;標(biāo)準(zhǔn)溶液（C）: 1000mg/L的苯丙氨酸溶液（所有溶液均用去離子水配制）；酪氨酸待測(cè)樣?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1.分別移取標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）（ 100mg/L，2.0 mL ）、標(biāo)準(zhǔn)溶液（b） （ 100mg/L，1.0 mL ）和標(biāo)準(zhǔn)溶液（c） （ 10

5、00mg/L，2.1.0mL ）標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中，用去離子水稀釋、定容、搖勻，待用；分別移0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液（b）于5個(gè)10 mL比色管中，并用去離子水稀釋、定容,搖勻，待用;3.打開UVProbe軟件界面，點(diǎn)左下角“連接”，系統(tǒng)開始自檢，等系統(tǒng)自檢結(jié)束。預(yù)熱15-30分鐘。待儀器穩(wěn)定后方可使用;4.在光譜測(cè)量模式下，設(shè)置儀器參數(shù)：波長(zhǎng)范圍200600nm，掃描速度：快速；測(cè)樣間隔：0.2nm ;狹縫寬度：1.0nm，以去離子水為參比溶液，分別繪制步驟（1）中各溶液在200600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜。并記錄各標(biāo)準(zhǔn)溶液的?max;5.在定量測(cè)定

6、模式下，以去離子水為參比溶液，測(cè)定步驟（2）中的各標(biāo)準(zhǔn)溶液在屁ax處的吸光度;6.7.在步驟5同樣條件下，測(cè)定未知樣品溶液在亦ax處的吸光度;繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液一至四階導(dǎo)數(shù)，求出酪氨酸為零而色氨酸不為零的值，選出合適的導(dǎo)數(shù)，將所有圖像都求該階導(dǎo)數(shù);8.擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)樣中各物質(zhì)含量。【數(shù)據(jù)處理與實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析】1. 繪制三種氨基酸的紫外吸收光譜實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)置的掃描波長(zhǎng)為200 600nm但實(shí)際的光譜圖中只有 350nm以下才有吸收峰，故作圖的波長(zhǎng)范圍為200-350nm。度強(qiáng)收吸220波長(zhǎng)(nm)圖2苯丙氨酸紫外吸收光譜可以看到苯丙氨酸在波長(zhǎng)接近200nm時(shí)吸收強(qiáng)度突然升高，但仍可以看到在215 n

7、m處有一個(gè)強(qiáng)吸收峰，在258nm處有一個(gè)弱吸收峰，但由于強(qiáng)吸收峰吸收強(qiáng)度過強(qiáng)，弱吸收峰看不太出來，經(jīng)過放大后可以明顯看到。0.14苯丙氨酸紫外吸收光譜260nm處吸收峰放大后結(jié)果度 強(qiáng) 收 吸0.120.100.080.060.040.020.00240300260 280波長(zhǎng)(nm)圖3苯丙氨酸紫外吸收光譜將258nm左右的吸收峰放大3200 8 6 j a a 度強(qiáng)收吸0.4色氨酸紫外吸收光譜波長(zhǎng)-吸收強(qiáng)度關(guān)系曲線0.20.0-0.2180200220240260280300320340360波長(zhǎng)(nm)圖4色氨酸紫外吸收光譜可以看出色氨酸在279nm附近左右有最大吸收波長(zhǎng)，另外在218n

8、m附近也有強(qiáng)吸收峰。2.5酪氨酸紫外吸收光譜 波長(zhǎng)-吸收強(qiáng)度關(guān)系曲線2.0度強(qiáng)收吸a180200220240260280300320340360波長(zhǎng)(nm)圖5酪氨酸紫外吸收光譜可以看出酪氨酸在 276nm附近左右有最大吸收波長(zhǎng)，另外在223nm附近也有強(qiáng)吸收峰。將苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸溶液的吸收光譜疊加在一個(gè)坐標(biāo)系中，比較它們的吸收峰的變化:度 強(qiáng) 收 吸180200220240260280300320340360波長(zhǎng)（nm）圖6三種氨基酸紫外吸收光譜比較比較最大吸收波長(zhǎng)（220nm的吸收峰）：色氨酸（279nm） 酪氨酸（276nm） 苯丙氨酸（258nm）。結(jié)如圖7所示，由于三種氨基酸

9、的結(jié)構(gòu)均含有含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)。苯丙氨酸最大吸收波長(zhǎng)在258nm、酪果分析:氨酸在276 nm、色氨酸在 279 nm。COO" + I HaN-C-H1CHzCOO,HgNCHCHaC00- .I HgNC-HH三種氨基酸結(jié)構(gòu)4個(gè)共軛雙鍵,三種氨基酸均具有苯環(huán)、吲哚環(huán)等大的不飽和基團(tuán)，其中具有吲哚基團(tuán)的色氨酸的不飽和鍵數(shù)量及其面積最大，故發(fā)生紅移，具有最大的吸收波長(zhǎng)，大于苯丙氨酸和酪氨酸的波長(zhǎng)（苯丙氨酸有色氨酸有5個(gè)共軛雙鍵）；而酪氨酸中的羥基存在給電子共軛效應(yīng)，其相對(duì)苯丙氨酸發(fā)生了紅移，最大收波長(zhǎng)也大于苯丙氨酸。從共軛角度看，體系的共軛度增強(qiáng)，波長(zhǎng)紅移。對(duì)于吸收強(qiáng)度，因?yàn)楣曹楏w

10、系L mol-1 cm-1,三種氨基酸均有n 7 n *躍遷所產(chǎn)生的吸收帶的吸收強(qiáng)度大，摩爾吸收系數(shù)£ max > 10000nf n *躍遷，而酪氨酸還有n *躍遷（不過這種躍遷的吸收強(qiáng)度?。┧宰畲笪辗逄幍奈諒?qiáng)度苯丙氨酸較小，但總體差別不大。0.001。2. 繪制色氨酸和賴氨酸溶液的一至四階吸收光譜：要求當(dāng)干擾物質(zhì)酪氨酸的縱坐標(biāo)數(shù)值絕對(duì)值小于nm.圖8色氨酸（綠）和酪氨酸的一階導(dǎo)數(shù)nm.圖9色氨酸（紫）和酪氨酸的二階導(dǎo)數(shù)230.80，0.163)|nm.可以看到當(dāng)酪氨酸導(dǎo)數(shù)為零時(shí)色氨酸較大的導(dǎo)數(shù)值與對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)為：（圖10色氨酸（黃）和酪氨酸的三階導(dǎo)數(shù)(224.74，0.0

11、69)可以看到當(dāng)酪氨酸導(dǎo)數(shù)為零時(shí)色氨酸較大的導(dǎo)數(shù)值與對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)為:3. 工作曲線繪制nm.圖11各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和未知溶液一階導(dǎo)數(shù)曲線0.2、0. 4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，再根據(jù)未知溶液的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)樣濃度。(b) 100mg/L的色氨酸溶液稀釋至10 mL，對(duì)應(yīng)濃度分別為 2、4、6、8、10 mg/L)-0.1-0.2-0.3、值-0.4數(shù) 導(dǎo) 階-0.5Equationy = a + b*xInterce pt-0.0139 ?0.02461Slo pe-0.08015 ?0.00371Residual Sum of Squares0

12、.00165P earson's r-0.9968R-Square(COD)0.99361Adj. R-Square0.99148工作曲線Lin ear Fit of Sheet1 B" 一階導(dǎo)數(shù)值"-0.6-0.7-0.810濃度(mg/L)圖12工作曲線11，得到吸收值一次導(dǎo)數(shù)與溶液濃度的關(guān)系2得到工作曲線如圖I = -0.08015 c - 0.0139，相關(guān)系數(shù) R =0.99361，線性擬合較好。未知溶液的紫外吸收光譜一階導(dǎo)數(shù)在221.96nm處的值為-0.425,帶入工作曲線方程得到未知溶液中色氨酸濃度為:5.129 mg/L 。【思考題】1、導(dǎo)數(shù)光譜法

13、應(yīng)用于定量的方法有哪些？請(qǐng)?jiān)斒?。答：?dǎo)數(shù)光譜法是解決干擾物質(zhì)與被測(cè)物質(zhì)的吸收光譜互相重疊、消除膠體和懸浮物散射影響和背景吸收以及提高光譜分辨率的一種技術(shù)。符合L-B定律的吸收光譜都可以通過導(dǎo)數(shù)光譜法減小誤差影響,在本實(shí)驗(yàn)中的新型紫外光譜儀，以及舊型的分光光度計(jì)均可使用導(dǎo)數(shù)光譜法，定量測(cè)量混合溶液中某組分的濃度。2、吸收光譜的影響因素有哪些?答:有如下影響因素(1)共軛效應(yīng)：具有至少一個(gè)芳環(huán)或多個(gè)共軛雙鍵的物質(zhì)在近紫外區(qū)域才有吸收,共軛面積越大，波長(zhǎng)越大;(2)取代基的性質(zhì)：芳環(huán)上的取代基會(huì)引起吸收峰的改變，給電子基（電子基（-N02、-Cl）會(huì)使使最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移；-OH 、 -NH 2）會(huì)使

14、最大吸收波長(zhǎng)紅移；吸(3)溶劑的影響：一般溶劑極性增大，n- n躍遷吸收帶紅移，n - n躍遷吸收帶藍(lán)移。溶劑極性越大，分子與溶劑的靜電作用越強(qiáng)，使激發(fā)態(tài)穩(wěn)定 ，能量降低。即n軌道能量降低大于 n軌道能量降低，因此波長(zhǎng)紅移。而產(chǎn)生n -n躍遷的n電子由于與極性溶劑形成氫鍵，基態(tài)n軌道能量降低大，n-n躍遷能量增大，吸收帶藍(lán)移。；(4)pH 的影響：例如酚羥基、氨基等在不同酸堿性下會(huì)有不同的存在形式：酚羥基在堿性條件下變?yōu)?給電子能力加強(qiáng)，使最大吸收波長(zhǎng)紅移；-NH 2在酸性條件下變?yōu)?-NH 3+，從給電子基團(tuán)變?yōu)槲娮踊鶊F(tuán)，-O，使最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移。3、如何測(cè)量氨基酸中酪氨酸的含量，請(qǐng)寫出詳

15、細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟答：與本實(shí)驗(yàn)的思路相似，步驟剛好相反，大致步驟如下：(1)分別移 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 nL 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于 5 個(gè) 10 nL 比色管中，并用去離子水稀釋、定容，搖勻，待用；(2)打開儀器，預(yù)熱、校零、設(shè)置儀器參數(shù)（同本實(shí)驗(yàn)）；(3)分別繪制步驟色氨酸和賴氨酸在200350nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜。并記錄各標(biāo)準(zhǔn)溶液的Anax；(4)定量測(cè)定模式下，以去離子水為參比溶液，測(cè)定步驟（ 2）中的各標(biāo)準(zhǔn)溶液在 Amax 處的吸光度；繪制色氨 酸和賴氨酸溶液的一至四階吸收光譜，要求當(dāng)干擾物質(zhì)色氨酸的縱坐標(biāo)數(shù)值絕對(duì)值小于0.001：(5)在步驟 4 同樣條件下，測(cè)

16、定未知樣品溶液在Anax 處的吸光度，從而得到酪氨酸的濃度4、本實(shí)驗(yàn)是采用紫外吸收光譜中波長(zhǎng)最大的吸收峰下進(jìn)行測(cè)定的，是否可以在另外兩個(gè)吸收峰下進(jìn)行定量測(cè)定，為什么？答：因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)光譜中波長(zhǎng)最大的吸收峰是共軛環(huán)（苯環(huán)或吲哚環(huán)）發(fā)生nn躍遷的B吸收帶，在實(shí)驗(yàn)中，被測(cè)物的共軛體系只與氨基酸的濃度有關(guān)， 所以用 B 吸收帶的吸收強(qiáng)度可以測(cè)出氨基酸的濃度，無干擾。而在其他吸收峰中，由于溶液電離作用等的影響， nn歩遷的R吸收帶受影響較大，不能用其吸收強(qiáng)度準(zhǔn)確計(jì)算出苯酚的濃度。5、被測(cè)物濃度過大或過小對(duì)測(cè)量有何影響？應(yīng)如何調(diào)整？調(diào)整的依據(jù)是什么？答：濃度過大：可能超過量程,并且吸光度越大 , 會(huì)導(dǎo)致整個(gè)

17、濃度 -吸光度曲線偏離 L-B 定律的直線范疇 ,不易擬合 ,誤差越大；需要稀釋至線性范圍后再重新測(cè)量；通過濃度過?。簳?huì)超過檢測(cè)器的靈敏度 ,由于信噪比等影響檢測(cè)不出準(zhǔn)確的吸光度，同樣影響準(zhǔn)確性，適當(dāng)蒸發(fā)或者使用更精密的儀器測(cè)量。二者調(diào)整的依據(jù)都是 Lambert-Beer 定律，即入射光強(qiáng)度 I0 與透過光強(qiáng)度 It 之比的對(duì)數(shù)與該物質(zhì)的濃度c成正比。6、 思考紫外 - 可見分光光度法應(yīng)用于蛋白質(zhì)測(cè)量的依據(jù)，并設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案，測(cè)定奶粉中蛋白質(zhì)的含量。答：由于本實(shí)驗(yàn)測(cè)量的三種氨基酸的結(jié)構(gòu)均含有含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)。苯丙氨酸最大吸收波長(zhǎng)在259 nm 、酪氨酸在278 nm、色氨酸在279

18、nm,蛋白質(zhì)一般都含有這三種氨基酸殘基，所以其最大光吸收在大約280nm波長(zhǎng)處, 因此能利用分光光度法很方便的測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。在測(cè)量等梯度的蛋白質(zhì)溶液的紫外吸收曲線,Cu2+形成作出工作曲線,通過 L-B 定律得出奶粉中的蛋白質(zhì)含量。另外,由于蛋白質(zhì)在堿性溶液中,能與紫紅色絡(luò)合物,且顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,故通過這種方法進(jìn)行那個(gè)普通分光光度計(jì)測(cè)量,也可以用來測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。7、您對(duì)實(shí)驗(yàn)有何建議或意見？答：本實(shí)驗(yàn)原理較簡(jiǎn)單, 操作也較輕松, 通過紫外吸收光譜法定性測(cè)出了氨基酸的最大吸收波長(zhǎng),定量分析了氨基酸酸的濃度。 不過還是希望老師能更加細(xì)致的介紹一點(diǎn)紫外分光光度計(jì)的儀器原理,回顧儀器分析的主要內(nèi)容,并提示更加明確的實(shí)驗(yàn)要求和處理實(shí)驗(yàn)報(bào)告的要求。討論與體會(huì)】紫外吸收光譜法是化學(xué)與材料學(xué)科制備表征物相的基本表征手段之一。實(shí)驗(yàn)原理較簡(jiǎn)單,操作也較輕松,通過紫外吸收光譜法定性測(cè)出了氨基酸的最大吸收波長(zhǎng),定量分析了氨基酸的濃度。面是本實(shí)驗(yàn)的一些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)與體會(huì)：(1)在測(cè)量前溶液一定要配制準(zhǔn)確,以防影響實(shí)驗(yàn)效果,保證工作曲線上的點(diǎn)在一條直線上；