實驗室好幫手

1、實驗室好幫手 光學顯微鏡原理分析可以使其放大一、光學顯微鏡的發(fā)展歷史早在公元前一世紀， 人們就已發(fā)現(xiàn)通過球形透明物體去觀察微小物體時，成像。后來逐漸對球形玻璃表面能使物體放大成像的規(guī)律有了認識。1610 年前后，得出合1590 年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經(jīng)造出類似顯微鏡的放大儀器。 意大利的伽利略和德國的開普勒在研究望遠鏡的同時， 改變物鏡和目鏡之間的距離， 理的顯微鏡光路結(jié)構(gòu)，當時的光學工匠遂紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進。17 世紀中葉，英國的胡克和荷蘭的列文胡克，都對顯微鏡的發(fā)展作出了卓越的貢獻。 1665 年前后，胡克在顯微鏡中加入粗動和微動調(diào)焦機構(gòu)、照明系統(tǒng)和承載標本片的工作臺

2、。 這些部件經(jīng)過不斷改進，成為現(xiàn)代顯微鏡的基本組成部分。16731677年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡，其中九臺保存至今。胡克和列文胡克利用自制的顯微鏡，在動、植物機體微觀結(jié)構(gòu)的研究方面取得了杰出成就。19 世紀，高質(zhì)量消色差浸液物鏡的出現(xiàn)， 使顯微鏡觀察微細結(jié)構(gòu)的能力大為提高。 1827 年阿米奇第一個采用了浸液物鏡。 19世紀 70年代，德國人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理 論基礎(chǔ)。這些都促進了顯微鏡制造和顯微觀察技術(shù)的迅速發(fā)展，并為19 世紀后半葉包括科赫、巴斯德等在內(nèi)的生物學家和醫(yī)學家發(fā)現(xiàn)細菌和微生物提供了有力的工具。在顯微鏡本身結(jié)構(gòu)發(fā)展的同時，顯微觀察技術(shù)也在不斷創(chuàng)新：

3、1850 年出現(xiàn)了偏光顯微術(shù)； 1893年出現(xiàn)了干涉顯微術(shù)； 1935年荷蘭物理學家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術(shù)，他為此 在 1953 年獲得了諾貝爾物理學獎。古典的光學顯微鏡只是光學元件和精密機械元件的組合， 它以人眼作為接收器來觀察放 大的像。 后來在顯微鏡中加入了攝影裝置， 以感光膠片作為可以記錄和存儲的接收器。 現(xiàn)代 又普遍采用光電元件、 電視攝像管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接收器， 配以微型電子計算 機后構(gòu)成完整的圖像信息采集和處理系統(tǒng)。目前全世界最主要的顯微鏡廠家主要有：奧林巴斯、蔡司、徠卡、尼康。國內(nèi)廠家主要 有：江南、麥克奧迪等。二、顯微鏡的基本光學原理一）折射和折射率光線在均勻的

4、各向同性介質(zhì)中， 兩點之間以直線傳播， 當通過不同密度介質(zhì)的透明物體 時，則發(fā)生折射現(xiàn)象， 這是由于光在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。 當與透明物面不垂直 的光線由空氣射入透明物體 （如玻璃 ）時，光線在其介面改變了方向，并和法線構(gòu)成折射角。二）透鏡的性能透鏡是組成顯微鏡光學系統(tǒng)的最基本的光學元件， 物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個和 多個透鏡組成。依其外形的不同，可分為凸透鏡（正透鏡 ）和凹透鏡 （負透鏡 ）兩大類。當一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后相交于一點， 這個點稱 "焦點 " ，通過交點并垂直 光軸的平面， 稱"焦平面 "。焦點有兩個， 在物方空

5、間的焦點， 稱"物方焦點 "，該處的焦平面， 稱" 物方焦平面 "；反之，在象方空間的焦點，稱 "象方焦點 "，該處的焦平面，稱 " 象方焦平 面" 。光線通過凹透鏡后，成正立虛像，而凸透鏡則成正立實像。實像可在屏幕上顯現(xiàn)出來， 而虛像不能。三）凸透鏡的五種成象規(guī)律1. 當物體位于透鏡物方二倍焦距以外時， 則在象方二倍焦距以內(nèi)、 焦點以外形成縮小的 倒立實象；2. 當物體位于透鏡物方二倍焦距上時，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實象；3. 當物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)， 焦點以外時， 則在象方二倍焦距以外形成

6、放大的 倒立實象；4. 當物體位于透鏡物方焦點上時，則象方不能成象；5. 當物體位于透鏡物方焦點以內(nèi)時， 則象方也無象的形成， 而在透鏡物方的同側(cè)比物體 遠的位置形成放大的直立虛象。三、光學顯微鏡的成象（幾何成象）原理y=L £只有當物體對人眼的張角不小于某一值時， 肉眼才能區(qū)別其各個細部， 該量稱為目視分 辨率 £ 。在最佳條件下， 即物體的照度為 5070lx 及其對比度較大時， 可達到 1'。為易于 觀測，一般將該量加大到 2'，并取此為平均目鏡分辨率。物體視角的大小與該物體的長度尺寸和物體至眼睛的距離有關(guān)。有公式距離 L 不能取得很小， 因為眼睛的調(diào)

7、節(jié)能力有一定限度， 尤其是眼睛在接近調(diào)節(jié)能力的 極限范圍工作時，會使視力極度疲勞。對于標準（正視）而言，最佳的視距規(guī)定為 250mm陰視距離 ） 。這意味著，在沒有儀器的條件下，目視分辨率 £ =2'的眼睛，能清楚地區(qū)分大小 為0.15mm的物體細節(jié)。在觀測視角小于 1'的物體時，必須使用放大儀器。放大鏡和顯微鏡是用于觀測放置在 觀測人員近處應(yīng)予放大的物體的。一）放大鏡的成像原理表面為曲面的玻璃或其他透明材料制成的光學透鏡可以使物體放大成像，光路圖如圖 1所示。位于物方焦點F以內(nèi)的物AB,其大小為y，它被放大鏡成一大小為 y'的虛像A B'。放大鏡的放

8、大率r =250/f '式中 250- 明視距離，單位為 mmf'- 放大鏡焦距，單位為 mm該放大率是指在250mm的距離內(nèi)用放大鏡觀察到的物體像的視角同沒有放大鏡觀察到 的物體視角的比值。二）顯微鏡的成像原理顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用， 就是把近處的微小物體成一放大的像， 以供人眼觀察。 只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。圖2是物體被顯微鏡成像的原理圖。圖中為方便計，把物鏡L1和目鏡L2均以單塊透鏡表示。物體AB位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所 以，它經(jīng)物鏡以后，必然形成一個倒立的放大的實像A B'。A B'位于

9、目鏡的物方焦點F2上，或者在很靠近 F2的位置上。再經(jīng)目鏡放大為虛像 A ' B''后供眼睛觀察。虛像 A ' B''的位置取決于 F2和A B'之間的距離，可以在無限遠處（當 A B'位于F2上 時），也可以在觀察者的明視距離處（當 A B'在圖中焦點 F2之右邊時）。目鏡的作用與 放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身， 而是物體被物鏡所成的已 經(jīng)放大了一次的像。三）顯微鏡的重要光學技術(shù)參數(shù)在鏡檢時，人們總是希望能清晰而明亮的理想圖象， 這就需要顯微鏡的各項光學技術(shù)參 數(shù)達到一定的標準，并且要求在使用

10、時，必須根據(jù)鏡檢的目的和實際情況來協(xié)調(diào)各參數(shù)的關(guān) 系。只有這樣，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的性能，得到滿意的鏡檢效果。顯微鏡的光學技術(shù)參數(shù)包括：數(shù)值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆蓋差、 工作距離等等。這些參數(shù)并不都是越高越好， 它們之間是相互聯(lián)系又相互制約的， 在使用時， 應(yīng)根據(jù)鏡檢的目的和實際情況來協(xié)調(diào)參數(shù)間的關(guān)系，但應(yīng)以保證分辨率為準。1 數(shù)值孔徑數(shù)值孔徑簡寫NA數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術(shù)參數(shù)，是判斷兩者（尤其對物鏡而言）性能高低的重要標志。其數(shù)值的大小，分別標刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。數(shù)值孔徑（NA是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（n）和孔徑角（U）半數(shù)的正弦之乘積。用

11、公式表示如下： NA=nsinu/2孔徑角又稱 "鏡口角 "，是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度?？讖浇窃酱螅M入物鏡的光通亮就越大， 它與物鏡的有效直徑成正比， 與焦點的距離成反比。顯微鏡觀察時，若想增大 NA值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質(zhì)的折射 率n值。基于這一原理，就產(chǎn)生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質(zhì)的折射率n值大于1，NA值就能大于 1 。數(shù)值孔徑最大值為 1.4 ，這個數(shù)值在理論上和技術(shù)上都達到了極限。目前，有用折射率高的溴萘作介質(zhì)，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4 。NA值應(yīng)等于這里必須指出，為了充分發(fā)揮物鏡數(shù)值孔徑

12、的作用，在觀察時，聚光鏡的 或略大于物鏡的 NA值。數(shù)值孔徑與其他技術(shù)參數(shù)有著密切的關(guān)系， 它幾乎決定和影響著其他各項技術(shù)參數(shù)。 它 與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場寬度與工作距離都會相應(yīng)地變小。又稱 "鑒別率 " 。其計2分辨率顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個物點的最小間距，算公式是(T =入/NA式中d為最小分辨距離；入為光線的波長；NA為物鏡的數(shù)值孔徑。 可見物鏡的分辨率 是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定。 NA值越大，照明光線波長越短，則 d 值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即減小 d值，可采取以下措施降低波長

13、入值，使用短波長光源。增大介質(zhì)n 值以提高 NA值(NA=nsinu/2 )。增大孔徑角u值以提高NA值。4)增加明暗反差。3 放大率和有效放大率由于經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大， 所以顯微鏡總的放大率 r應(yīng)該是物鏡放大率 3和目 鏡放大率r 1的乘積：顯然， 和放大鏡相比， 顯微鏡可以具有高得多的放大率， 并且通過調(diào)換不同放大率的物 鏡和目鏡，能夠方便地改變顯微鏡的放大率。放大率也是顯微鏡的重要參數(shù)， 但也不能盲目相信放大率越高越好。 顯微鏡放大倍率的 極限即有效放大倍率。分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有聯(lián)系的概念。有關(guān)系式：500NA<r <1000NA當選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠

14、大,即分辨率不夠高時,顯微鏡不能分清物體的微細結(jié)構(gòu), 此時即使過度地增大放大倍率, 得到的也只能是一個輪廓雖大但細節(jié)不清的圖像, 稱為無效 放大倍率。 反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足, 則顯微鏡雖已具備分辨的能力, 但 因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。 所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力, 應(yīng)使數(shù)值孔 徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。4 焦深焦深為焦點深度的簡稱, 即在使用顯微鏡時, 當焦點對準某一物體時, 不僅位于該點平 面上的各點都可以看清楚, 而且在此平面的上下一定厚度內(nèi), 也能看得清楚, 這個清楚部分 的厚度就是焦深。焦深大 , 可以看到被檢物體的全層,而焦深小,則只能看到被檢

15、物體的一 薄層,焦深與其他技術(shù)參數(shù)有以下關(guān)系：1 ）焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔徑成反比。2）焦深大，分辨率降低。由于低倍物鏡的景深較大, 所以在低倍物鏡照相時造成困難。 在顯微照相時將詳細介紹。5 視場直徑（ FieldOfView ）觀察顯微鏡時, 所看到的明亮的圓形范圍叫視場, 它的大小是由目鏡里的視場光闌決定 的。視場直徑也稱視場寬度, 是指在顯微鏡下看到的圓形視場內(nèi)所能容納被檢物體的實際范 圍。視場直徑愈大,愈便于觀察。有公式F=FN/ 3式中F:視場直徑，F(xiàn)N：視場數(shù)（FieldNumber,簡寫為FN,標刻在目鏡的鏡筒外側(cè)），3 : 物鏡放大率。由公式可看出：1 ）視場直徑與視

16、場數(shù)成正比。（ 2）增大物鏡的倍數(shù),則視場直徑減小。因此,若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全 貌,而換成高倍物鏡,就只能看到被檢物體的很小一部份。6 覆蓋差顯微鏡的光學系統(tǒng)也包括蓋玻片在內(nèi)。 由于蓋玻片的厚度不標準, 光線從蓋玻片進入空 氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變, 從而產(chǎn)生了相差, 這就是覆蓋差。 覆蓋差的產(chǎn)生影響了顯 微鏡的成響質(zhì)量。國際上規(guī)定，蓋玻片的標準厚度為 0.17mm許可范圍在0.16-0.18mm ,在物鏡的制造上 已將此厚度范圍的相差計算在內(nèi)。物鏡外殼上標的 0.17，即表明該物鏡所要求的蓋玻片的 厚度。7 工作距離 WD工作距離也叫物距， 即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間

17、的距離。 鏡檢時， 被檢物體 應(yīng)處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。 因此，它與焦距是兩個概念， 平時習慣所說的調(diào)焦，實 際上是調(diào)節(jié)工作距離。在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。四）物鏡物鏡是顯微鏡最重要的光學部件， 利用光線使被檢物體第一次成象， 因而直接關(guān)系和影響成象的質(zhì)量和各項光學技術(shù)參數(shù)，是衡量一臺顯微鏡質(zhì)量的首要標準。物鏡的結(jié)構(gòu)復(fù)雜， 制作精密， 由于對象差的校正， 金屬的物鏡筒內(nèi)由相隔一定距離并被 固定的透鏡組組合而成。物鏡有許多具體的要求，如合軸 , 齊焦。齊焦既是在鏡檢時，當用某一倍率的物鏡觀察圖象清晰后，在轉(zhuǎn)換另一倍率的物鏡時， 其

18、成象亦應(yīng)基本清晰， 而且象的中心偏離也應(yīng)該在一定的范圍內(nèi)， 也就是合軸程度。 齊焦性 能的優(yōu)劣和合軸程度的高低是顯微鏡質(zhì)量的一個重要標志， 它是與物鏡的本身質(zhì)量和物鏡轉(zhuǎn) 換器的精度有關(guān)。現(xiàn)代顯微物鏡已達到高度完善， 其數(shù)值孔徑已接近極限， 視場中心的分辨率與理論值之 區(qū)別已微乎其微。 但繼續(xù)增大顯微物鏡視場與提高視場邊緣成象質(zhì)量的可能性仍然存在，這種研究工作，至今仍在進行。顯微物鏡與目鏡在參于成象這點上是有區(qū)別的。物鏡是顯微鏡最復(fù)雜和最重要的部分， 在寬光束中工作 （孔徑大） ，但這些光束與光軸的傾角較小 （視場?。?；目鏡在窄光束中工作， 但其傾角大（視場大）。當計算物鏡與目鏡，在消除象差上

19、有很大差別。場曲、畸與寬光束有關(guān)的象差是球差、慧差以及位置色差；與視場有關(guān)的象差是象散、 變以及倍率包差。顯微物鏡是一消球差系統(tǒng)。 這意味著： 就軸上的一對共軛點而言， 消除了球差并且實現(xiàn) 了正弦條件時， 每一物鏡僅有兩個這種消球差點。 因此， 物體與象的計算位置的任何改變均 導致象差變大。1 物鏡的主要參數(shù)（1）放大率32）數(shù)值孔徑 NA160 毫米。我國規(guī)定機械筒長是（3）機械筒長L:在顯微鏡中，物鏡支承面到目鏡支承面之間的距離稱為機械筒長。 對于一臺顯微鏡來說，機械筒長是固定的。4）蓋玻片厚度 d5）工作距離 WD這些參數(shù)，大多刻在物鏡筒上，如圖3 所示。這種物鏡的后方一般帶有輔助物鏡

20、（也叫補償物鏡或有一種所謂筒長無限的顯微物鏡， 鏡筒物鏡），被觀察物體位于物鏡前焦點上，經(jīng)過物鏡以后，成像在無限遠，再經(jīng)過輔助物 鏡成像在輔助物鏡的焦平面上， 如圖 4 所示。在物鏡和輔助物鏡之間是平行光， 所以中間距 離比較自由一些，可以加入棱鏡等光學元件。2 物鏡的基本類型（1）按顯微鏡鏡筒長度（以 mm十）：透射光用160鏡筒，帶0.17mm厚或更厚的蓋玻 片；反射光用 190 鏡筒，不帶蓋玻片；透射光與反射光用鏡筒，筒長無限大。）。2）按浸法特征：非浸式 （干式 ）、浸式 （油浸、水浸、甘油浸及其它浸法 3）按光學裝置：透射式、反射式以及折反射式。（4）按數(shù)值孔徑和放大倍數(shù)：低倍（NA

21、W 0.2與3 < 10X）,中倍（NAW 0.65與3 <40X）,高倍（NA> 0.65 與 3 > 40X）。（5）按校正象差的情況不同，通常分為消色差物鏡，半復(fù)消色差物鏡，復(fù)消色差物鏡， 平視場消色差物鏡，平視場復(fù)消色差物鏡和單色物鏡。a. 消色差物鏡( Achromaticobjective )這是應(yīng)用最廣泛的一類顯微物鏡，外殼上常有 "Ach" 字樣。它校正了軸上點的位置色差 （紅，藍二色）、球差（黃綠光）和正弦差，保持了齊明條件。軸外點的象散不超過允許值 （4 屬光度 ） ，二級光譜未校正。數(shù)值孔徑為 0.10.15 的低倍消色差物鏡一

22、般由兩片透鏡膠合在一起的雙膠物鏡構(gòu)成。 數(shù)值孔徑至 0.2 的消色差物鏡由兩組雙膠透鏡構(gòu)成。 當數(shù)值孔徑增大到 0.3 時，再加入一平 凸透鏡， 該平凸透鏡決定著物鏡的焦距， 而其它透鏡則補償由其平面與球面產(chǎn)生的象差。 高 倍物鏡的平面象差可用浸法消除。 高倍消色差物鏡一般均為浸式， 由四部分構(gòu)成： 前片透鏡、 新月形透鏡及兩個雙膠透鏡組。b. 復(fù)消色差物鏡( Apochromaticobjective )這類物鏡的結(jié)構(gòu)復(fù)雜， 透鏡采用了特種玻璃或螢石等材料制作而成， 物鏡的外殼上標有 "Apo" 字樣。它對兩個色光實現(xiàn)了正弦條件，要求嚴格地校正軸上點的位置色差（紅，藍二

23、色）、球差（紅，藍二色）和正弦差，同時要求校正二級光譜（再校正綠光的位置色差）。 其倍率色差并不能完全校正，一般須用目鏡補償。這樣不適用由于對各種象差的校正極為完善， 比響應(yīng)倍率的消色差物鏡有更大的數(shù)值孔徑， 僅分辨率高，象質(zhì)量優(yōu)而且也有更高的有效放大率。因此，復(fù)消色差物鏡的性能很高， 于高級研究鏡檢和顯微照相。c. 半復(fù)消色差物鏡( Semiapochromaticobjective )半復(fù)消色差物鏡又稱氟石物鏡， 物鏡的外殼上標有 "FL" 字樣。在結(jié)構(gòu)上透鏡的數(shù)目比消 色差物鏡多， 比復(fù)消色差物鏡少， 成象質(zhì)量上， 遠較消色差物鏡為好， 接近于復(fù)消色差物鏡。d. 平視

24、場物鏡（ Planobjective ）對于平視場平場物鏡是在物鏡的透鏡系統(tǒng)中增加一快半月形的厚透鏡， 以達到校正場曲的缺陷， 提 高視場邊緣成像質(zhì)量的目的。 平場物鏡的視場平坦， 更適用于鏡檢和顯微照相。 消色差物鏡，其倍率色差不大， 不必用特殊目鏡補償。而平視場復(fù)消色差物鏡，則必須用目 鏡來補償它的倍率色差。e. 單色物鏡這類物鏡由石英、 熒石或氟化鋰制的一組單片透鏡構(gòu)成。 只能在紫外線光譜區(qū)的個別區(qū) 內(nèi)使用（寬度不超過20mm）,可見光譜區(qū)不能采用單色物鏡。這類物鏡均制成反射式與折反 射式系統(tǒng)。主要缺點是相當大一部分光束在中心被遮蔽（ 入瞳面積的 25%）。在新型折反射系統(tǒng)中， 由于采用

25、半透明反射鏡以及物鏡的膠合結(jié)構(gòu)， 使這一缺點大為減輕， 從而可以取消反 射鏡框的遮光。 并且兩同軸反射鏡的殘余象差是互相補償?shù)模?同時用透鏡組來增大數(shù)值孔徑。 若系統(tǒng)的校正滿意，孔徑達到 NA=1.4 時，中心遮蔽可不超過入瞳面積的 4%。f. 特種物鏡所謂 "特種物鏡 "是在上述物鏡的基礎(chǔ)上，專門為達到某些特定的觀察效果而設(shè)計制造 的。主要有以下幾種：(a) 帶校正環(huán)物鏡( Correctioncollarobjective在物鏡的中部裝有環(huán)裝的調(diào)節(jié)環(huán)，當轉(zhuǎn)動調(diào)節(jié)環(huán)時，可調(diào)節(jié)物鏡內(nèi)透鏡組之間的距離， 從而校正由蓋玻片厚度不標準引起的覆蓋差。 調(diào)節(jié)環(huán)上的刻度可從 0.11-

26、.023, 在物鏡的外 殼上也標科有此數(shù)字，表明可校正蓋玻片從 0.11-0.23mm 厚度之間的誤差。（b）帶虹彩光闌的物鏡（ Irisdiaphragmobjective ）在物鏡鏡筒內(nèi)的上部裝有虹彩光闌， 外方也可以旋轉(zhuǎn)的調(diào)節(jié)環(huán)， 轉(zhuǎn)動時可調(diào)節(jié)光闌孔徑 的大小， 這種結(jié)構(gòu)的物鏡是高級的油浸物鏡， 它的作用是在暗視場鏡檢時， 往往由于某些原 因而使照明光線進入物鏡， 使視場背景不夠黑暗， 造成鏡檢質(zhì)量的下降。 這時調(diào)節(jié)光闌的大 小，使背景變黑，使被檢物體更明亮，增強鏡檢效果。(c) 相襯物鏡( Phasecontrastobjective )這種物鏡是由于相襯鏡檢術(shù)的專用物鏡，其特點是在物

27、鏡的后焦平面處裝有相板。(d) 無罩物鏡( Nocoverobjective )有些被檢物體，如涂抹制片等，上面不能加用蓋玻片，這樣在鏡檢時應(yīng)使用無罩物鏡， 否則圖象質(zhì)量將明顯下降，特別是在高倍鏡檢時更為明顯。這種物鏡的外殼上常標刻NC，同時在蓋玻片厚度的位置上沒有 0.17 的字樣，而標刻著 "0" 。(e) 長工作距離物鏡這種物鏡是倒置顯微鏡的專用物鏡， 它是為了滿足組織培養(yǎng)， 懸浮液等材料的鏡檢而設(shè) 計。五) 目鏡目鏡的作用是把物鏡放大的實象(中間象)再放大一級，并把物象映入觀察者的眼中， 實質(zhì)上目鏡就是一個放大鏡。 已知顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數(shù)值孔徑所決定的，

28、而目鏡只是起放大作用。 因此， 對于物鏡不能分辨出的結(jié)構(gòu)， 目鏡放的再大， 也仍然不能分辨出。六) 聚光鏡聚光鏡裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40 以上的物鏡時， 則必須具有聚光鏡。 聚光鏡不僅可以彌補光量的不足和適當改變從光源射來的光的 性質(zhì)，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。聚光鏡的的結(jié)構(gòu)有多種， 同時根據(jù)物鏡數(shù)值孔徑的大小， 相應(yīng)地對聚光鏡的要求也不同。1 阿貝聚光鏡( Abbecondenser )這是由德國光學大學大師恩斯特 . 阿貝 (ErnstAbbe) 設(shè)計。阿貝聚光鏡由兩片透鏡組成， 有較好的聚光能力，但是在物鏡數(shù)值孔徑高于 0

29、.60 時，則色差，球差就顯示出來。因此， 多用于普通顯微鏡上。2 消色差聚光鏡 (Achromaticaplanaticcondenser)這種聚光鏡又名 "消球差聚光鏡 " 和"齊明聚光鏡 " ，它由一系列透鏡組成， 它對色差球差 的校正程度很高，能得到理想的圖象，是明場鏡檢中質(zhì)量最高的一種聚光鏡，其NA值達1.4。因此，在高級研究顯微鏡常配有此種聚光鏡。它不適用于4X以下的低倍物鏡，否則照明光源不能充滿整個視場。3 搖出式聚光鏡( Swingoutcondenser )在使用低倍物鏡時（如 4X）,由于視場大，光源所形成的光錐不能充滿真整個視場，

30、造成視場邊緣部分黑暗， 只中央部分被照亮。 要使視場充滿照明， 就需將聚光鏡的上透鏡從 光路中搖出。4 其它聚光鏡聚光鏡除上述明場使用的類型外， 還有作特殊用圖的聚光鏡。 如暗視場聚光鏡， 相襯聚光鏡，偏光聚光鏡，微分干涉聚光鏡等，以上聚光鏡分別適用于相應(yīng)的觀察方式?？煞譃?"透射式照明 " ，和"落射式照明 " 兩大類。 絕大數(shù)生物顯微鏡屬于此類照明法； 后者則適用于非 "" 反射式照明 " 。主要應(yīng)用與金相顯微鏡或熒光鏡檢七）照明方法顯微鏡的照明方法按其照明光束的形成， 前者適用于透明或半透明的被檢物體， 透明的被檢物體

31、，光源來自上方，又稱 法。1 透射式照明生物顯微鏡多用來觀察透明標本，需要以透射光來照明。有兩種照明方式（ 1）臨界照明（ Criticalillumination）光源經(jīng)過聚光鏡后，成像于物平面上，如圖5 所示。若忽略光能的損失，則光源像的亮度與光源本身相同，因此，這種方法相當于在物 平面上放置光源。顯然， 在臨界照明中， 如果光源表面亮度不均勻，或明顯地表現(xiàn)出細小的 結(jié)構(gòu)， 如燈絲等，那么就要嚴重影響顯微鏡觀察效果，這是臨界照明的缺點。其補救的方法 是在光源的前方放置乳白和吸熱濾色片， 使照明變得較為均勻和避免光源的長時間的照射而 損傷被檢物體。 用透射光照明時， 物鏡成像光束的孔徑角，

32、被聚光鏡像方光束的孔徑角所決 定，為使物鏡的數(shù)值孔徑得到充分利用，聚光鏡應(yīng)有與物鏡相同或稍大的數(shù)值孔徑。（2）柯拉照明臨界照明中物面光照度不均勻的缺點，在柯拉照明中可以消除。在光源1 與所以物鏡的視場（標本）得聚光鏡 5 之間加一輔助聚光鏡 2，如圖 6 所示?？梢?，由于不是直接把光源，而是把被光源 均勻照明了的輔助聚光鏡 2（也稱為柯拉鏡）成像在標本 6 上， 到均勻的照明。往往是采用從側(cè)面或者從上 標本像的產(chǎn)生是靠進入物鏡2 落射式照明在觀察不透明物體時， 例如通過金相顯微鏡觀察金屬磨片， 面加以照明的方式。 此時， 被觀察物體的表面上沒有蓋玻璃片， 的反射或散射光線。如圖 7 所示。3

33、用暗視場來觀察微粒的照明方法用暗視場方法可以觀察超顯微質(zhì)點。 所謂超顯微質(zhì)點， 是指那些小于顯微鏡分辨極限的 微小質(zhì)點。 暗視場照明的原理是： 不使主要的照明光線進入物鏡， 能夠進入物鏡成像的只是 由微粒所散射的光線。 因此，在暗的背景上給出了亮的微粒的像， 視場背景雖暗， 但襯度（對 比）很好，可以使分辨率提高。暗視場照明又有單向和雙向之分（1）單向暗視場照明圖 8 是單向暗視場照明示意圖。由圖可見，由照明器 2 發(fā)出的光 線，經(jīng)不透明的標本片 1 反射后，主要的光線都沒有進入物鏡 3，進入物鏡的光線主要是由 微?；蛲拱疾黄降募毑克⑸涞墓饩€。 顯然， 這種單向的暗視場照明， 對觀察微粒的存

34、在和 運動是有效的，但對物體細節(jié)的再現(xiàn)不是有效的，即存在" 失真"的現(xiàn)象。（ 2）雙向暗視場照明雙向暗視場照明，可以消除單向所產(chǎn)生的失真缺點。在普通的三 透鏡聚光鏡前面， 安置一個環(huán)形光闌， 如圖 9 即可實現(xiàn)雙向暗視場照明。 在聚光鏡的最后一 片與載物玻璃片之間浸以液體， 而蓋玻璃片與物鏡之間是干的。 于是， 經(jīng)過聚光鏡的環(huán)形光 束，在蓋玻璃片內(nèi)全反射而不能進入物鏡， 形成如圖中的回路。 進入物鏡的只是由標本上的 微粒所散射的光線，形成了雙向暗視場照明。四、光學顯微鏡的組成結(jié)構(gòu)而數(shù)碼顯微鏡還包括數(shù)碼攝像系統(tǒng)，光學顯微鏡包括光學系統(tǒng)和機械裝置兩大部分， 分述如下：一）機械裝

35、置1 機架顯微鏡的主體部分，包括底座和彎臂。2 目鏡筒位于機架上方，靠圓形燕尾槽與機架固定，目鏡插在其上。根據(jù)有否攝像功 能，可分為雙目鏡筒和三目鏡筒；根據(jù)瞳距的調(diào)節(jié)方式不同，可分為鉸鏈式和平移式。3 .物鏡轉(zhuǎn)換器它是一個旋轉(zhuǎn)圓盤，上有35個孔，分別裝有低倍或高倍物鏡鏡頭。動物鏡轉(zhuǎn)換器就可讓不同倍率的物鏡進入工作光路。4 載物臺是放置玻片的平臺，其中央具有通光孔。臺上有一個彈性的標本夾，用來夾 住載玻片。右下方有移動手柄，使載物臺面可在XY雙方向進行移動。5 調(diào)焦機構(gòu)利用調(diào)焦手輪可以驅(qū)動調(diào)焦機構(gòu)，使載物臺作粗調(diào)和微調(diào)的升降運動，從 而使被觀察物體對焦清晰成像。6 聚光器調(diào)節(jié)機構(gòu)聚光器安裝在其上

36、，調(diào)節(jié)螺旋可以使聚光器升降，用以調(diào)節(jié)光線的 強弱。二）光學系統(tǒng)1 目鏡它是插在目鏡筒頂部的鏡頭，由一組透鏡組成，可以使物鏡成倍地分辨、放大 物像，例如 10X、15X 等。按照所能看到的視場大小，目鏡可分為視場較小的普通目鏡，和 視場較大的大視場目鏡 （或稱廣角目鏡 ） 兩類。較高檔顯微鏡的目鏡上還裝有視度調(diào)節(jié)機構(gòu)， 操作者可以方便快捷地對左右眼分別進行視度調(diào)整；此外， 在這些目鏡上可以加裝測量分劃板，測量分劃板的象總能清晰地調(diào)焦在標本的焦面上； 運輸中被損壞的可能性，這些目鏡可以被鎖定。并且， 為了防止目鏡被取走以及減少2 物鏡它安裝在轉(zhuǎn)換器的孔上，也是由一組透鏡組成的，能夠把物體清晰地放大

37、。物 鏡上刻有放大倍數(shù)，主要有 鏡的下表面和標本片的上表面之間填充折射率為 提高顯微觀察的分辨率。10X、40X、60X、100X等。高倍物鏡中多采用浸液物鏡，即在物1.5 左右的液體 （如杉木油） ，它能顯著的3 光源有鹵素燈、鎢絲燈、汞燈、熒光燈、金屬鹵化物燈等。4 聚光器包括聚光鏡、孔徑光闌。聚光鏡由透鏡組成，它可以集中透射過來的光線， 使更多的光能集中到被觀察的部位。 孔徑光闌可控制聚光器的通光范圍， 用以調(diào)節(jié)光的強度。三）數(shù)碼攝像系統(tǒng)攝像頭 圖像采集卡 軟件 微機五、光學顯微鏡的分類按圖像是否按紫光學顯微鏡有多種分類方法： 按使用目鏡的數(shù)目可分為雙目和單目顯微鏡； 有立體感可分為立體

38、視覺和非立體視覺顯微鏡； 按觀察對像可分為生物和金相顯微鏡等； 光學原理可分為偏光、相襯和微差干涉對比顯微鏡等；按光源類型可分為普通光、熒光、外光、紅外光和激光顯微鏡等；按接收器類型可分為目視、數(shù)碼（攝像）顯微鏡等。常用的 顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、熒光顯微鏡等。1 雙目體視顯微鏡雙目體視顯微鏡又稱 "實體顯微鏡 "或"解剖鏡" ，是一種具有正象立體感地目視儀器。 生物、醫(yī)學領(lǐng)域廣泛用于切片操作和顯微外科手術(shù)； 在工業(yè)中用于微小零件和集成電路的觀 測、裝配、檢查等工作。它具有如下特點：（1）利用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束不是

39、平行，而是具有一定的夾角- 體視角（一般為 12 度-15 度），為左右兩眼提供一個具有立體感的圖像。它實質(zhì)上是兩個單 鏡筒顯微鏡并列放置，兩個鏡筒的光軸構(gòu)成相當于人們用雙目觀察一個物體時所形成的視 角，以此形成三維空間的立體視覺圖像。2）象是直立的，便于操作和解剖，這是由于在目鏡下方的棱鏡把象倒轉(zhuǎn)過來的緣故。3）雖然放大率不如常規(guī)顯微鏡，但其工作距離很長。4）焦深大，便于觀察被檢物體的全層。5）視場直徑大。對物體成象后的兩光束被兩組中間它的倍率變化是由改變中間鏡組" （ Zoom-stereomicroscope ）。隨照相，攝象，冷光源等等。目前體視鏡的光學結(jié)構(gòu)是： 由一個共用的

40、初級物鏡， 物鏡 變焦鏡分開， 并成一體視角再經(jīng)各自的目鏡成象，之間的距離而獲得的，因此又稱為 " 連續(xù)變倍體視顯微鏡 著應(yīng)用的要求，目前體視鏡可選配豐富的選購附件，如熒光，2金相顯微鏡金相顯微鏡是專門用于觀察金屬和礦物等不透明物體金相組織的顯微鏡。這些不透明物體無法在普通的透射光顯微鏡中觀察，故金相和普通顯微鏡的主要差別在于前者以反射光， 而后者以透射光照明。 在金相顯微鏡中照明光束從物鏡方向射到被觀察物體表面，被物面反射后再返回物鏡成像。這種反射照明方式也廣泛用于集成電路硅片的檢測工作。3 偏光顯微鏡( Polarizingmicroscope )偏光顯微鏡是用于研究所謂透明與不

41、透明各向異性材料的一種顯微鏡。 凡具有雙折射的 物質(zhì)， 在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚， 當然這些物質(zhì)也可用染色法來進行觀察， 但有些則 不可能，而必須利用偏光顯微鏡。1）偏光顯微鏡的特點將普通光改變?yōu)槠窆膺M行鏡檢的方法， 以鑒別某一物質(zhì)是單折射 （各向同行） 或雙折 射性（各向異性）。雙折射性是晶體的基本特性。因此，偏光顯微鏡被廣泛地應(yīng)用在礦物、 化學等領(lǐng)域，在生物學和植物學也有應(yīng)用。2）偏光顯微鏡的基本原理偏光顯微鏡的原理比較復(fù)雜，在此不作過多介紹, 偏光顯微鏡必須具備以下附件:起偏鏡，檢偏鏡，補償器或相位片，專用無應(yīng)力物鏡，旋轉(zhuǎn)載物臺。3）偏光鏡檢術(shù)的方式a. 正相鏡檢 （ Orthsc

42、ope ） : 又稱無畸變鏡檢，其特點是使用低倍物鏡，不用伯特蘭透鏡 （ BertrandLens ） , 被研究對象可直接用偏振光研究。同時為使照明孔徑變小，推開聚光鏡 的上透鏡。正相鏡檢用于檢查物體的雙折射性。b.錐光鏡檢（Conoscope）:又稱干涉鏡檢，研究在偏振光干涉時產(chǎn)生的干涉圖樣，這 種方法用于觀察物體的單軸或雙軸性。在該方法中，用強會聚偏振光束照明。4）偏光顯微鏡在裝置上的要求a. 光源：最好采用單色光， 因為光的速度，折射率， 和干涉現(xiàn)象由于波長的不同而有差 異。一般鏡檢可使用普通光。b.目鏡：要帶有十字線的目鏡。c.a.載物臺的中心與光軸同軸。b.起偏鏡和檢偏鏡應(yīng)處于正交

43、位置。c.制片不宜過薄。4 熒光顯微鏡熒光顯微鏡是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體， 波長的熒光，然后觀察。熒光顯微鏡廣泛應(yīng)用于生物，醫(yī)學等領(lǐng)域。使之受激發(fā)后而產(chǎn)生長1）熒光顯微鏡一般分為透射和落射式兩種類型。a. 透射式： 激發(fā)光來自被檢物體的下方， 聚光鏡為暗視野聚光鏡， 而使熒光進入物鏡。使激發(fā)光不進入物鏡，b. 落射式： 透射式目前幾乎被淘汰， 新型的熒光顯微鏡多為落射式， 的上方， 在光路中具有分光鏡， 所以對透明和不透明的被檢物體都適用。 鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實現(xiàn)整個視場的均勻照明。光源來自被檢物體由于物鏡起了聚光2）熒光鏡檢術(shù)的注意事項a. 激

44、發(fā)光長時間的照射， 會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象， 因此盡可能縮短觀察時間， 暫 時不觀察時，應(yīng)用擋板遮蓋激發(fā)光。b.作油鏡觀察時，應(yīng)用 " 無熒光油 " 。c.熒光幾乎都較弱，應(yīng)在較暗的室內(nèi)進行。聚光鏡：為了取得平行偏光，應(yīng)使用能推出上透鏡的搖出式聚光鏡。伯特蘭透鏡： 聚光鏡光路中的輔助部件， 這是把物體所有造成的初級相放大為次級相d.的輔助透鏡。它可保證用目鏡來觀察在物鏡后焦平面中形成的平涉圖樣。5）偏光鏡檢術(shù)的要求d.FISH）等等。電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。目前許多新興生物研究領(lǐng)域應(yīng)用到熒光顯微鏡，如基因原位雜交（5 相襯

45、顯微鏡( Phasecontrastmicroscope )在光學顯微鏡的發(fā)展過程中， 相襯鏡檢術(shù)的發(fā)明成功， 是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就。 我們知道，人眼只能區(qū)分光波的波長（顏色）和振幅（亮度），對于無色通明的生物標本， 當光線通過時，波長和振幅變化不大，在明場觀察時很難觀察到標本。將人這大相襯顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢， 也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象， 眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹睿?即使是無色透明的物質(zhì)也可成為清晰可見。 大便利了活體細胞的觀察，因此相襯鏡檢法廣泛應(yīng)用于倒置顯微鏡中。相襯鏡檢法在裝置上與明場不同，有一些特殊要求：a. 環(huán)狀光闌（ Ringslit ）

46、: 裝在聚光鏡的下方，而與聚光鏡組合為一體- 相襯聚光鏡。它是由大小不同的環(huán)形光闌裝在一圓盤內(nèi)，外面標有10X、20X、40X、100X 等字樣，與相對應(yīng)倍數(shù)的物鏡配合使用。b. 相板（ Phaseplate ） : 裝在物鏡的后焦平面處，它分為兩部分，一是通過直射光的部 分，為半透明的環(huán)狀，叫共軛面；另一是通過衍射光的部分， ?quot; 補償面 " 。有相板的物 鏡稱"相襯物鏡 " ，外殼上常有 "Ph" 字樣。相襯鏡檢法是一種比較復(fù)雜的鏡檢方法， 想要得到好的觀察效果， 顯微鏡的調(diào)試非常重 要。除此之外還應(yīng)注意以下幾個方面：a.光源要強，

47、全部開啟孔徑光闌；b.使用濾色片，使光波近于單色。6微分干涉對比顯微鏡( DifferentialinterferencecontrastDIC微分干涉對比鏡檢術(shù)出現(xiàn)于 60 年代，它不僅能觀察無色透明的物體，而且圖象呈現(xiàn)出浮雕壯的立體感，并具有相襯鏡檢術(shù)所不能達到的某些優(yōu)點，觀察效果更為逼真。1）原理微分干涉對比鏡檢術(shù)是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。 分裂出來的光束的振動方 向相互垂直且強度相等，光束分別在距離很近的兩點上通過被檢物體，在相位上略有差別。 由于兩光束的裂距極小，而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象，使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺。2）微分干涉對比鏡檢術(shù)所需的特殊部件：a.起偏鏡b.檢偏鏡c.渥拉

48、斯頓棱鏡 2 塊3）微分干涉對比鏡檢時的注意事項a.因微分干涉靈敏度高，制片表面不能有污物和灰塵。b.c.倒置顯微鏡應(yīng)用微分干涉時，不能用塑料培養(yǎng)皿。具有雙折射性的物質(zhì)，不能達到微分干涉對比鏡檢的效果。倒置顯微鏡（ Invertedmicroscope ）倒置顯微鏡是為了適應(yīng)生物學、醫(yī)學等領(lǐng)域中的組織培養(yǎng)、細胞離體培養(yǎng)、浮游生物、 環(huán)境保護、食品檢驗等顯微觀察。由于上述樣品特點的限制， 被檢物體均放置在培養(yǎng)皿 （或培養(yǎng)瓶） 中，這樣就要求倒置顯微鏡的物鏡和聚光鏡的工作距離很長，能直接對培養(yǎng)皿中的被檢物體進行顯微觀察和研究。因此，物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來，故稱為 " 倒置顯微鏡 "。由于工作距離的限制，倒置顯微鏡物鏡的最大