葉綠體轉(zhuǎn)基因方法

1、葉綠體轉(zhuǎn)基因方法，超表達(dá)和純化人血清白蛋白，蛋白質(zhì)很容易受到蛋白降解艾麗西亞費(fèi)爾南德斯 - 圣米1，天使明戈卡斯特2，邁克爾米勒3，和亨利丹尼爾1，*分子生物學(xué)的佛羅里達(dá)州中部，生物分子大學(xué)1系和微生物學(xué)，科學(xué)樓20，336室，奧蘭多，佛羅里達(dá)州32816-2360，USA農(nóng)業(yè)生物技術(shù)和自然資源的納瓦拉，CSIC的公立大學(xué)2研究所，Mutilva巴哈31192西班牙納瓦拉3奧本大學(xué)研究?jī)x器設(shè)備 - 先進(jìn)的顯微及成像實(shí)驗(yàn)室，赤褐色，AL 36849，USA概要人血清白蛋白（HSA）占血清中總蛋白的60，它是最廣泛使用的靜脈內(nèi)的蛋白質(zhì)中的一些人的療法。 HSA，但是，目前提取的只有從血液因?yàn)槿狈ι?/p>

2、業(yè)上可行的重組表達(dá)的系統(tǒng)。 HSA是高度敏感蛋白水解降解在重組系統(tǒng)和是昂貴的凈化。 HSA使用的Shine-Dalgarno順序在轉(zhuǎn)基因葉綠體表達(dá)（SD），這通常有利于超表達(dá)轉(zhuǎn)基因，導(dǎo)致在僅在0.02的HSA總蛋白（TP）。使用葉綠體非翻譯HSA調(diào)節(jié)序列的修飾區(qū)（UTR）導(dǎo)致了過度表達(dá)的HSA（最高達(dá)11.1，TP）的，補(bǔ)償過度蛋白水解降解。這是藥物蛋白在轉(zhuǎn)基因表達(dá)最高植物和500倍高于轉(zhuǎn)基因葉子HSA表達(dá)以前的報(bào)告。電子對(duì)免疫標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因葉綠體的顯微照片顯示HSA包涵體，這提供了用于從其它細(xì)胞蛋白純化的簡(jiǎn)單方法。 HSA包容機(jī)構(gòu)可以很容易地溶解，以便獲得用適當(dāng)?shù)脑噭┮詥误w形式。該在這項(xiàng)研究中

3、使用的調(diào)節(jié)元件應(yīng)作為一個(gè)模型系統(tǒng)用于增強(qiáng)的表達(dá)外源蛋白是高度敏感的蛋白水解降解，并提供在優(yōu)勢(shì)純化，包涵體形成的時(shí)候。關(guān)鍵詞葉綠體基因工程;生物制藥;轉(zhuǎn)基因作物;分子農(nóng)業(yè);重組人血蛋白介紹可用性重組人蛋白發(fā)生了革命性的使用治療寶貴的蛋白質(zhì)在臨床醫(yī)學(xué)。植物提供了一個(gè)合適的替代微生物或因?yàn)樗鼈兊膬r(jià)格低廉的生產(chǎn)生物藥物蛋白質(zhì)的動(dòng)物表達(dá)成本和不存在的人類病原體。但是，也有一定的局限性。尤其是，2003 Blackwell出版有限公司*通訊（傳真+1 407 823 0956; ）。美國國立衛(wèi)生研究院公共訪問作者手稿植物生物工程學(xué)家作者的手稿;可在PMC 2012年1

4、0月26發(fā)表在最后的編輯形式：植物生物工程學(xué)家2003年3月; 1（2）：71-79。 DOI：10.1046 / j.1467-7652.2003.00008.x。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿核轉(zhuǎn)基因植物的人類蛋白質(zhì)的表達(dá)已經(jīng)低得令人失望，例如：人血清白蛋白的總可溶性蛋白（TSP）的0.02，人干擾素0.000017鮮重，人表皮生長(zhǎng)因子茶匙和促紅細(xì)胞生成素0.00260.001茶匙（丹尼爾等，2001D）。因此，為了增加在表達(dá)水平是很重要為了利用植物生產(chǎn)藥用重要的蛋白質(zhì)。作為替代核表達(dá)，葉綠體轉(zhuǎn)基因的方法已經(jīng)開發(fā)作為有效的工具，生物制藥的蛋白質(zhì)在植物中的表達(dá)（

5、丹尼爾和Dhingra，2002;丹尼爾等人，2001年，B; DeGray等人，2001;阿骨打等人，2000;的Staub等人，2000）?；诟叻肿拥鞍踪|(zhì)的表達(dá)與第一示范后，多樣的醫(yī)療應(yīng)用（阿骨打等人，2000），轉(zhuǎn)基因葉綠體已經(jīng)顯示快遞非常小的抗菌肽沒有融合蛋白（DeGray等人。，2001），裝配官能低聚物與霍亂毒素亞單位的二硫鍵（丹尼爾等人，2001年b），和表達(dá)的單克隆抗體與協(xié)同表達(dá)和裝配的重和輕鏈與正確折疊和形成二硫橋的（丹尼爾等人，2001年），這表明適當(dāng)?shù)难趸€原環(huán)境或需要伴侶蛋白是本在葉綠體中。功能的人類生長(zhǎng)激素在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)葉綠體證實(shí)葉綠體能夠人類蛋白的正確折疊的

6、用二硫鍵（的Staub等人，2000）。表達(dá)多基因在一個(gè)單一的能力轉(zhuǎn)化事件（丹尼爾和Dhingra，2002;德小筑等，2001），積累非常大量的外來蛋白質(zhì)（德小筑等，2001），成功番茄有色體用于水果高水平轉(zhuǎn)基因表達(dá)的工程（聯(lián)陣等人，2001年），其耦合到超表達(dá)疫苗抗原（丹尼爾。等，2001年b），以及使用植物來源的無抗生素選擇標(biāo)記（丹尼爾等人，2001年c），好兆頭口服交貨可食用疫苗和生物制藥是目前鞭長(zhǎng)莫及那些誰最需要它們。此外，葉綠體基因工程是一個(gè)環(huán)保的方式，提供了轉(zhuǎn)基因的遏制和解決基因沉默和核轉(zhuǎn)基因植物（Bogorad，2000遇到位置效應(yīng);丹尼爾和Dhingra，2002;丹尼爾等人

7、，2002年;丹尼爾，2002）。HSA是最廣泛使用的靜脈內(nèi)蛋白質(zhì)和被規(guī)定在multigram數(shù)量在創(chuàng)傷和其它各種臨床情況（彼得斯，1995年），以取代血容量。HSA是單體球狀前原蛋白，其成熟形式由一個(gè)單一的585個(gè)氨基酸的多肽鏈（66.5 kDa的17個(gè)二硫鍵）。每年世界需要超過500噸占超過$ 1.5十億市值。至今，白蛋白已經(jīng)主要生產(chǎn)的血清的分餾。缺乏糖基化有助于生產(chǎn)官能的HSA原核系統(tǒng)中。雖然HSA基因和cDNA已被表達(dá)在多種微生物系統(tǒng)，其中包括大腸桿菌（拉塔等人，1987），枯草芽孢桿菌（Saunders等人，1987），釀酒酵母（夸克等人，1989），克魯維（冷嘲熱諷等人，1991）

8、或畢赤酵母（大谷等人，1998），沒有系統(tǒng)尚未商業(yè)上可行的。 Sijmons等人。 （1990）取得的第一報(bào)告試圖表達(dá)HSA在轉(zhuǎn)基因植物，但非常低的表達(dá)水平達(dá)到（0.02TSP）。 HSA無法檢測(cè)，如果在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，提示該蛋白質(zhì)在該隔室并不穩(wěn)定，由于高敏感性的蛋白水解降解。有10倍增加的HSA累積已經(jīng)最近報(bào)道通過核馬鈴薯植物的轉(zhuǎn)化和靶向于HSA的塊莖質(zhì)外體（法倫等。，2002年）。估計(jì)行業(yè)，然而，表明具有成本效益的產(chǎn)量藥品生產(chǎn)是每克鮮重0.1毫克的HSA（法倫等人，2002）。此外，良好的重組系統(tǒng)中仍然沒有可用的許多人類蛋白質(zhì)是昂貴的純化或高度易感對(duì)蛋白水解降解。已知的是傳統(tǒng)使用的列生物藥品

9、的純化占30生產(chǎn)成本和的設(shè)置成本的70（佩德里迪斯等人，1995）。蛋白水解降解文瀾等。第2頁植物生物工程學(xué)家作者的手稿;可在PMC 2012 10月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿另一個(gè)嚴(yán)重的問題，工業(yè)生物處理。日益增加的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的在通過使用重組DNA技術(shù)的異源宿主帶來這問題成為關(guān)注的焦點(diǎn);異源蛋白顯得更容易蛋白水解（Enfors，1992年）。重組蛋白質(zhì)通常通過細(xì)胞視為外國，因此降低比大多數(shù)內(nèi)源性蛋白（Rozkov等人，2000）要快得多。的蛋白水解穩(wěn)定性重組蛋白是影響最終產(chǎn)量一個(gè)顯著因子。本研究試圖開發(fā)重組體HSA的生產(chǎn)更有效的方法，其可以用作模型系

10、統(tǒng)，以豐富或純化來自生物制藥蛋白轉(zhuǎn)基因植物，這是高度敏感的蛋白水解降解。結(jié)果與討論兩個(gè)葉綠體轉(zhuǎn)化載體被設(shè)計(jì)具有不同5調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)HSA表達(dá)和轉(zhuǎn)基因最大化蛋白積累葉綠體。 PLD的基本載體，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)室葉綠體轉(zhuǎn)化開發(fā)，使用（丹尼爾等人，1998;丹尼爾等人，2001年b;德科薩等人，2001;阿骨打等人，2000;哥打等人，1999）。在質(zhì)粒pLDAsdHSA（圖1a），所述的aadA基因，其賦予壯觀霉素抗性，和HSA的基因被表達(dá)為從質(zhì)多順反子Prrn啟動(dòng)子。閃耀 - 達(dá)爾加諾（SD）共有序列GGAGG放在上游的兩個(gè)基因。葉綠體高水平的外源蛋白的表達(dá)（TSP的3-21）有研究表明，使用該5序列不

11、同的蛋白質(zhì)（丹尼爾等人，2001年b; DeGray等人，2001;哥打等人，1999）。在pLDApsbAHSA向量（圖1a），在204 bp的煙草插入含有啟動(dòng)子和體psbA 5UTR葉綠體DNA片段立即于HSA編碼序列的上游并且所述的aadA基因的下游。它是眾所周知，psbA啟動(dòng)子和非翻譯的控制下的外源基因區(qū)域被表達(dá)以非常高的水平（丹尼爾等人，1990）。這增強(qiáng)翻譯可能是由于在5UTR元件（EIBL等人，1999）。載體如先前所述（丹尼爾，1997）并轟擊到煙草葉子，5周后，幾個(gè)主芽出現(xiàn)從每個(gè)轟擊葉片作為獨(dú)立的結(jié)果轉(zhuǎn)化事件。推定的轉(zhuǎn)化的枝條上500微克/毫升確定增長(zhǎng)對(duì)大觀霉素。外來基因盒引

12、入所述葉綠體基因組的整合通過PCR確認(rèn)篩選主芽。該戰(zhàn)略使用的土地一個(gè)引物在本機(jī)相鄰的結(jié)合點(diǎn)和上的aadA第二引物葉綠體基因組基因。該P(yáng)CR產(chǎn)物不能在核轉(zhuǎn)基因植物或自發(fā)獲得突變體，從而這兩種可能性可以消除。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，90的總枝條得到的是真實(shí)的葉綠體轉(zhuǎn)化。證實(shí)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行一第二輪大觀霉素選擇來實(shí)現(xiàn)同質(zhì)性。他們植根于大觀霉素的存在下，然后轉(zhuǎn)移到盆中用于進(jìn)一步表征。南方的進(jìn)行印跡分析，以選擇同質(zhì)性T 0的線，并確認(rèn)穩(wěn)定維持的在T 1代轉(zhuǎn)基因整合（圖1b-d）中。側(cè)翼區(qū)的探針（P1）的確定了未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物中7.45千堿基的片段，如預(yù)期的（圖1c）。在葉綠體轉(zhuǎn)基因系中，只有轉(zhuǎn)化的基因組拷貝的觀察所證明由1

13、0.5和10.7 kb的雜交的pLDAsdHSA和pLDApsbAHSA片段轉(zhuǎn)基因系，分別。要確認(rèn)10.5和10.7 kb的片段包含在HSA的基因，同樣的印跡再次探測(cè)與HSA P2探頭。正如預(yù)期的，雜交檢測(cè)只在葉綠體轉(zhuǎn)基因系（圖1d）。其他的缺失雜交片段消除同核與葉綠體積分事件轉(zhuǎn)基因株系。文瀾等。第3頁植物生物工程學(xué)家作者的手稿;可在PMC 2012 10月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿HSA數(shù)量在轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體ELISA法檢測(cè)。一個(gè)多植物轉(zhuǎn)化的之間觀察HSA積累360倍的差異兩個(gè)不同的載體（圖3a）：0.02和7.2TP在pLDAsdHSA和pLDAp

14、sbAHSA轉(zhuǎn)基因系，分別。葉綠體結(jié)構(gòu)與SD序列已證明直接CTB的表達(dá)非常有效（最多茶匙的4;丹尼爾等人，2001年b）。類似構(gòu)建體，但在質(zhì)體基因組的其它區(qū)域插入，也已經(jīng)成功（3-21小勺; DeGray等人，2001;哥打等人，1999），這表明高蛋白質(zhì)表達(dá)水平可以通過使用這個(gè)結(jié)構(gòu)中的操縱子帶的SD來實(shí)現(xiàn)序列。因此，HSA表達(dá)水平低，在pLDAsdHSA轉(zhuǎn)基因植物可以不能因的調(diào)控信號(hào)的構(gòu)建體的效果。在的量的差異HSA可能是由于轉(zhuǎn)錄后，翻譯或翻譯后的效果。學(xué)習(xí)在HSA表達(dá)的差異，轉(zhuǎn)錄豐度進(jìn)行了檢查，RNA印跡，這是使用3psbA基因區(qū)域的探針（圖2）執(zhí)行。該5psbA / HSAmonocis

15、tron成績(jī)單遠(yuǎn)遠(yuǎn)比的aadA / SD / HSA dicistron更豐富，但這樣的差異不顯示與HSA 360倍的差異線性相關(guān)這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系之間積累。這種缺乏轉(zhuǎn)錄物之間的相關(guān)性豐度和蛋白質(zhì)積累已報(bào)道從幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室當(dāng)psbA基因5UTR被使用（梅菲爾德等人，1995;的Staub和Maliga，1993，1994年），這意味著一個(gè)在5UTR的psbA在提高翻譯的重要作用。 EIBL等。 （1999年）也表明，缺失psbA基因5UTR的末端序列的降低的能力非編碼區(qū)，以增強(qiáng)翻譯。因此，在轉(zhuǎn)基因pLDApsbAHSA有效翻譯線可能在建立高水平的HSA積累的一個(gè)重要因素。有幾個(gè)研究，表明psbA基因

16、5UTR賦予光依賴翻譯不僅給體psbA基因（Zerges，2000），而且還與其他異源蛋白（EIBL等人，1999;的Staub和Maliga，1993，1994年）。 HSA下的psbA基因表達(dá)因此5UTR調(diào)控預(yù)期要輕有關(guān)。變化HSA積累后照明的不同時(shí)期通過ELISA（圖3b）監(jiān)測(cè)。 HSA數(shù)量被觀察到的最大可達(dá)成熟連續(xù)照明（TP的11.1）的50小時(shí)連續(xù)葉和2-4倍的下降是8小時(shí)黑暗時(shí)期后觀察。在這樣的差別HSA積累了十分明顯，它是通過檢測(cè)凝膠染色用考馬斯亮藍(lán)（圖3c）。的Staub和Maliga（1993年，1994年）和EIBL等。 （1999）表明雖然翻譯是在黑暗中被逮捕，該5psb

17、A / uidA基因mRNA的營業(yè)額非常低。此觀察通過Northern印跡分析，其顯示沒有大的確認(rèn)對(duì)HSA亮和暗量5psbA / HAS轉(zhuǎn)錄之間的差異（圖2，泳道3，4）。因此，在黑暗與光明之間的HSA積累的差異不可能是由于在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性的速率來逮捕的差別，但由于翻譯在黑暗中和HSA的在葉綠體的營業(yè)額。從轉(zhuǎn)化的植物蛋白分離，研究HSA積累的圖案在轉(zhuǎn)基因葉綠體。蛋白質(zhì)印跡證實(shí)HSA數(shù)量差異其中轉(zhuǎn)基因系（圖3d）。在pLDApsbAHSA轉(zhuǎn)基因品系，人血清白蛋白是部分地溶解與用于總蛋白提取的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。這一觀察建議形成HSA的內(nèi)部聚集在pLDApsbAHSA轉(zhuǎn)基因葉綠體轉(zhuǎn)化。電子顯微鏡和免疫

18、膠體金標(biāo)記，因此是在執(zhí)行轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化植株進(jìn)一步展開調(diào)查。正如預(yù)期的那樣，電子葉組織的顯微照片中顯示形成大的聚集體或包涵體pLDApsbAHSA轉(zhuǎn)基因葉綠體成熟轉(zhuǎn)化植物（圖4b-d）中。它是有趣地注意到，含有包涵體葉綠體中尺寸增大到HSA容納大量堆積（對(duì)比圖4a，D）。然而，表型這些植物的表現(xiàn)正常（圖5）。 HSA的pLDAsdHSA轉(zhuǎn)基因量葉綠體是如此之低，這是不能夠檢測(cè)上述免疫標(biāo)記背景。在葉綠體大小沒有顯著變化，觀察在這些植物中。文瀾等。第4頁植物生物工程學(xué)家作者的手稿;可在PMC 2012 10月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿包涵體已經(jīng)于原核生物和真核

19、生物的胞質(zhì)溶膠被經(jīng)常觀察當(dāng)異源蛋白的過表達(dá)。在該功能的發(fā)生葉綠體首先報(bào)道了Ketchner等。 （1995年）。眾所周知該蛋白質(zhì)聚集成包涵體大多涉及的部分分子間的關(guān)聯(lián)折疊中間體（Mitraki和King，1989）。高蛋白質(zhì)濃度通常會(huì)導(dǎo)致條件經(jīng)常超出正常的溶解度極限。即使是最豐富的蛋白質(zhì)光合細(xì)胞，RUBISCO，形成了在某些情況下，包涵體。許多自養(yǎng)細(xì)菌和藍(lán)藻的所有包了很多RUBISCO到包容機(jī)構(gòu)積極參與二氧化碳，被稱為羧的固定（夏夫利和英國，1991年）。我們的假設(shè)的基礎(chǔ)上，包涵體形成的過程中，是在對(duì)比pLDAs-DHSA轉(zhuǎn)基因品系，HSA下psbA基因5UTR合成形成大聚集體主要是由于該蛋白

20、質(zhì)的高局部濃度。包涵體形成是策略之一用于減少不穩(wěn)定的蛋白水解重組蛋白（Enfors，1992）。大多數(shù)重組蛋白質(zhì)的研究有被證明是對(duì)蛋白水解包涵體內(nèi)高抗。雖然有包涵體內(nèi)免受蛋白酶，有些蛋白水解也可以發(fā)生直接在聚集蛋白（Carrio等人，1999）。 HSA也似乎是易感轉(zhuǎn)基因葉綠體中的某些蛋白水解降解。然而，凈余額合成與降解之間是非常有利的，特別是在幾個(gè)小時(shí)連續(xù)照明。正確折疊的HSA可以從包涵體變性完成后痊愈增溶和體外重折疊。從包涵體正確再折疊的HSA是一個(gè)已在數(shù)項(xiàng)研究用大腸桿菌先前已經(jīng)證明常規(guī)程序（拉塔等人（1987）和釀酒酵母（劉天妮等人，1996;。夸克等人，1989年）。在這些情況下，人的

21、和重組的HSA重折疊進(jìn)行比較，這是示這兩種蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上等價(jià)的，這表明HSA可以是從包涵體回收并正確折疊。繼這些準(zhǔn)則協(xié)議，HSA從轉(zhuǎn)基因葉綠體中提取。圖6a顯示染色銀SDS-PAGE凝膠，其中HSA包涵體可以從可溶級(jí)分中分離（泳道3），其中大部分的細(xì)胞蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)。列入溶解后機(jī)構(gòu)和后續(xù)的復(fù)性，HSA可以完全轉(zhuǎn)化為單體形式（圖6a，第5泳道，圖6B，泳道5）。我們的HSA的估計(jì)收益率的結(jié)束協(xié)議是約20的初始量在葉子，雖然報(bào)告協(xié)議具有在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模被執(zhí)行，并且可以用于工業(yè)進(jìn)一步優(yōu)化制作。據(jù)估計(jì)的HSA在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，以符合成本效益與表達(dá)低至0.1毫克人血清白蛋白/克鮮重的水平（法倫等人，2002

22、）。該回收率溶解包涵體并復(fù)性的HSA后的約0.25毫克HSA /克鮮重（不含可溶性的HSA在轉(zhuǎn)基因葉綠體），這超過了成本制藥工業(yè)的有效估計(jì)。之一的這項(xiàng)研究的主要目標(biāo)是開發(fā)一種更有效的表達(dá)系統(tǒng)人血清白蛋白，一個(gè)重要的人類的治療性蛋白是高度敏感的降解。 HSA的SD的平移控制在成熟的植物表達(dá)序列導(dǎo)致HSA積累的非常低的水平，可能是由于過度的蛋白降解和翻譯不佳率。然而，當(dāng)根據(jù)所表達(dá)的psbA啟動(dòng)子和5UTR的控制下，最多在HSA積累500倍增加是在成熟植物觀察到的相比，測(cè)試的其它調(diào)節(jié)序列。 HSA是觀察到形成大包涵體，結(jié)果即使在的尺寸的顯著增加轉(zhuǎn)基因葉綠體和推測(cè)蛋白水解提供保護(hù)，HSA降解。包涵體從

23、其它細(xì)胞蛋白促進(jìn)的HSA純化。HSA的分子具有的化學(xué)和結(jié)構(gòu)功能，而不是酶活性，文瀾等。第5頁植物生物工程學(xué)家作者的手稿;可在PMC 2012 10月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿因此，復(fù)雜的研究是必要的，以充分展示的功能分子（參見劉天妮等人，1996;大谷等人，1998; Petersen等人，2000; Tarelli等人，1998年; Watanabe等人，2001，b）中。使用體外這樣的功能性研究重折疊的HSA是在進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)步驟葉綠體表達(dá)載體pLDAsdHSA是通過將人血清白蛋白的1.8kb的EcoR構(gòu)造/還不I片段進(jìn)在PLD載體的多克隆位點(diǎn)（丹尼爾

24、等人，1998;丹尼爾等人，2001年b;德科薩等人，2001;鼓達(dá)等人，2000;哥打等人，1999）。這個(gè)片段含有成熟HSA編碼序列之前的Shine-達(dá)爾加諾（GGAGG），它具有的ATG作為起始密碼子。這些序列進(jìn)行了介紹，通過使用引物：5-GGAGGCAACCATGGATGCACACAAGAGTGAAGG-3。對(duì)于pLDApsbAHSA載體中，204 bp的序列包括啟動(dòng)子和5UTR psbA啟動(dòng)，通過擴(kuò)增使用煙草DNA為模板PCR。下列引物：5-CCGTCGACGTAGAGAAGTCCGTATT-3和5-GCCCATGGTAAAATCTTGGTTTATTTA-3。融合與HSA的基因在做的

25、Nco位點(diǎn)放置在psbA基因5UTR的3端，然后插入到PLD矢量作為一個(gè)生態(tài)RI /沒有我的片段。在繼續(xù)轟擊，載體通過測(cè)試Western印跡分析在大腸桿菌中。轟擊和再生無菌煙草（栽培品種佩蒂特哈瓦那）葉使用Bio-Rad公司轟擊的PDS-1000 /赫如先前所述生物射彈裝置（丹尼爾，1997）。轟擊葉片進(jìn)行兩輪選擇的含有500微克/毫升的壯觀霉素的RMOP培養(yǎng)基上再生轉(zhuǎn)化體（丹尼爾，1997）。再生后，將植物扎根于500微克/毫升大觀霉素（丹尼爾。等，2001年b），并轉(zhuǎn)移到在生長(zhǎng)室的盆。光照周期為16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗。PCR和Southern blot分析PCR方法分析整合不同盒在轉(zhuǎn)化的

26、植物為描述（丹尼爾等人，2001年b角;德科薩等人，2001;哥打等人，1999）。對(duì)于Southern印跡分析，總DNA從轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的植物的葉中提取（Qiagen公司的DNeasy試劑盒）?？侱NA（5微克）溶液用Bam HI消化，電泳上0.7瓊脂糖凝膠，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上（DURALON紫外線Stratagene）中。模板用于探測(cè)側(cè)翼序列是0.81 KB的Bgl/巴姆HI片段和HSA 0.75 KBNCO我片段。該探針使用寡聚標(biāo)記過程用32 P標(biāo)記-的dCTP（蓄勢(shì)待發(fā)，Amersham公司）。探針雜交到繼所述膜QUICK-HYB協(xié)議（DURALON紫外線，Stratagene公司）。N

27、orthern blot分析總RNA從轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的植物的葉中提?。≧Neasy試劑植物試劑盒，Qiagen公司）。核糖核酸2.5微克進(jìn)行電泳上1.2瓊脂糖/甲醛凝膠然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上（Stratagene）中。的0.21 KB的Xba/ PST I片段3的psbA基因用作探針，并使用寡聚標(biāo)記用32 P標(biāo)記-的dCTP過程（Amersham）上。HSA定量對(duì)ELISA人血白蛋白定量試劑盒（BETHYL Laboratories公司）進(jìn)行。轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化葉（100毫克）的下一個(gè)16小時(shí)生長(zhǎng)的盆栽植物文瀾等。第6頁植物生物工程學(xué)家作者的手稿;可在PMC 2012 10月26日。NIH-PA作者手稿N

28、IH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿光周期磨碎在液氮中，再懸浮于700微升50毫NaOH和分析根據(jù)制造商的協(xié)議。轉(zhuǎn)基因葉的萃取物稀釋，以適應(yīng)在所提供的人血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)的線性范圍。吸光度在450nm讀數(shù)。該DC蛋白質(zhì)測(cè)定法（Bio-Rad公司）來測(cè)定總?cè)芙獾牡鞍踪|(zhì)。SDS-PAGE和免疫印跡分析轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的葉（100毫克）研磨在液氮中再懸浮于200微升的蛋白質(zhì)提取緩沖液（200mM的Tris-鹽酸pH為8.0，100毫氯化鈉，400mM的蔗糖，14毫ME，0.05吐溫20，0.1SDS中，10毫摩爾EDTA，2毫PMSF）。葉的萃取物在煮沸樣品緩沖液（Bio-Rad公司）并電泳在10聚丙烯

29、酰胺凝膠。分離的蛋白用考馬斯亮藍(lán)G-250或轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜免疫印跡。第一抗體（兔抗HSA，北歐免疫學(xué)），使用以1：10 000稀釋，和二次抗體（堿性磷酸酶結(jié)合的抗兔鼠，適馬或羊抗兔HRP共軛，南方生物技術(shù)）在1：15 000堿性磷酸酶顏色發(fā)展的試劑，BCIP / NBT，在AP顯色緩沖液（Bio-Rad公司），或電致化學(xué)發(fā)光試劑盒（Amersham）被用來進(jìn)行檢測(cè)。包涵體溶解可溶性蛋白除去用在0.2M NaCl的，的25mM Tris - 鹽酸pH值的第一提取7.4，2mM的PMSF和0.1的Triton X-100。離心60分鐘，在20 000個(gè)克后，將沉淀溶解16小時(shí)，在4在6M的谷鹽

30、酸，0.1MME和0.25mM的Tris-鹽酸pH為7.4。離心60分鐘，在20 000個(gè)克后，將上清液再慢慢稀釋100倍于100mM氯化鈉，的50mM的Tris-HCl pH 8.5的和1mM EDTA，在4下24小時(shí)。餾分進(jìn)行電泳在SDS-PAGE 10凝膠，銀染色，Bio-Rad公司試劑和協(xié)議。透射電子顯微鏡和免疫膠體金標(biāo)記與未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物幼苗和成熟葉進(jìn)行分析。固定和免疫標(biāo)記的電子顯微鏡所描述的執(zhí)行Vrekleij和Leunissen（1989）。切片第一阻塞，培養(yǎng)1小時(shí)與山羊抗人白蛋白多克隆抗體（北歐免疫學(xué);稀釋范圍為1：1000至1：10 000），然后溫育2小時(shí)用兔antig-

31、燕麥IgG二抗共軛至10nM金稀釋1：40在封閉溶液。切片檢查中于60千伏蔡司EM 10透射電子顯微鏡。致謝這項(xiàng)研究是由美國國立衛(wèi)生研究院從RO1 GM 63879和Chlorgen公司以高清和“Direccin補(bǔ)助部分支持一般德INDUSTRIA，總統(tǒng)府納瓦拉“（西班牙）和AMC整合的轉(zhuǎn)基因盒到葉綠體基因組和同質(zhì)性的研究。 （一個(gè)）地區(qū)同源重組的強(qiáng)調(diào)了本土葉綠體基因組。HSA是通過插入aadA基因的Prrn啟動(dòng)子上游驅(qū)動(dòng)所有盒如在所描述的壯觀霉素與另外的啟動(dòng)子和控制元件的電阻文本。拖曳內(nèi)箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向。數(shù)字向右指示當(dāng)用Bam HI消化總DNA被探測(cè)與所預(yù)測(cè)雜交片段探頭P1。 （二）0.81

32、千對(duì)堿基片段（P1）的側(cè)翼盒和0.75千堿基的片段含有HSA編碼區(qū)（P2）分別用作探針的Southern印跡分析。 （光盤）Southern blot分析。 1：未轉(zhuǎn)換的DNA; DNA的植物轉(zhuǎn)化的：2,3：文瀾等。第10頁植物生物工程學(xué)家作者的手稿;可在PMC 2012 10月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿pLDAsdHSA; 4,5：pLDApsbAHSA。植物對(duì)于第一（T 0）和第二（T 1）代進(jìn)行了分析。 2,4：T 0的一代。 3,5：T已1代。探測(cè)印跡用P1（c）和P2的（四）。 AADA：氨基糖苷類3腺苷酸轉(zhuǎn)移; KB：千堿基;病人：?jiǎn)?dòng)子; Prrn啟動(dòng)：16SrRNA基因啟動(dòng)子; SD：閃耀 - 達(dá)爾加諾。轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)錄模式。與執(zhí)行的Northern印跡分析總RNA提取盆栽植物的葉子。 3的psbA基因的用作探測(cè)。 1：未轉(zhuǎn)化的植物; 2：轉(zhuǎn)化pLDAsdHSA; 3：轉(zhuǎn)化pLDApsbAHSA后照明或4：在黑暗中。溴化乙錠染色的rRNA是用于評(píng)估負(fù)載。鑒定轉(zhuǎn)錄物顯示在右邊。的方