乙型肝炎病毒檢測試劑盒(原位雜交)

1、乙型肝炎病毒檢測試劑盒（原位雜交）（操作之前請詳細閱讀此說明書）¨ 檢測原理和意義原位雜交技術的原理是采用熒光、生物素、地高辛等標記的探針，依據(jù)堿基互補配對原理，與組織切片、細胞涂片等標本中的靶序列特異雜交，經(jīng)信號放大及顯色后，鏡下觀察結果。此方法具有很高的靈敏性和特異性。HBV（乙肝病毒）是引起乙型肝炎的病原體，?？蓪е赂斡不?、肝癌等，危及患者生命。HBV原位雜交檢測產(chǎn)品通過HBV探針與病原核酸的特異結合，檢測組織中HBV感染的存在。尤其是當組織學上病變輕微不易診斷時，HBV原位檢測常可幫助確診。¨ 試劑盒提供的材料和試劑成 份保存方法提 供 量20人份50人份1HBV

2、雜交液-20500ul625ulx22蛋白酶K(10X)-20100ul250ul3過氧化物酶阻斷劑41mll4蛋白阻斷劑41mll5一抗41mll6二抗41mll7HRP聚合物41mll8DAB底物41mll9DAB 420ul50ul1018X18mm蓋玻片4或室溫20片50片11濕盒增效液4或室溫30ml30ml（注意：HBV雜交液和蛋白酶K請 -20保存。）¨ 用戶自備材料和試劑1. 原位雜交加熱器（泰普編號：M10061）8. 二甲苯2. 37恒溫培養(yǎng)箱9. 酒精3. 光學顯微鏡10. PBS(pH=7.6)4. 移液器11.蘇木素5. 計時器12. 氨水6. 玻片染色缸和

3、染色架13. 鹽酸酒精7. 濕盒2個¨ 實驗前需配試劑30濕盒增效液取濕盒增效液及蒸餾水，按3:7配制成30%濕盒增效液備用。¨ 實驗時需配試劑A、1X蛋白酶K工作液取適量10X蛋白酶K ，用蒸餾水稀釋10倍（1份10X蛋白酶K加9份蒸餾水），并將此1X蛋白酶K 工作液存放于室溫備用。（現(xiàn)配現(xiàn)用）B、DAB顯色液依據(jù)需要配制DAB顯色液，以可覆蓋整個組織的量為宜。取DAB與DAB底物，按照1：50的比例混勻，避光保存?zhèn)溆谩?現(xiàn)配現(xiàn)用)¨ 操作步驟1切片處理：將4um厚度的組織粘附在APES處理的載玻片上，切片于60-70烘烤60分鐘以上。（建議每次實驗同時附加陽性

4、、陰性對照片）2脫蠟及水化：溶液次數(shù)×時間（分）二甲苯3 × 10100%酒精1 × 395酒精1 x 380%酒精1 × 3蒸餾水1 x 3（注意：使用過的二甲苯，應相應延長脫蠟時間，以保證脫蠟完全）3酶消化處理：甩干切片，將組織周圍液體用濾紙吸干，每張切片滴加適量蛋白酶K工作液(約50 ul，根據(jù)組織大小增、減量)，37孵育30分鐘。4封閉內(nèi)源性過氧化物酶：蒸餾水沖洗，小心擦干組織周圍液體，滴加適量過氧化物酶阻斷劑(約50 ul，根據(jù)組織大小增、減量)，室溫水濕盒中孵育10分鐘。PBS液洗滌2×1分鐘后，蒸餾水洗滌1×1分鐘，小心

5、擦干組織周圍液體。5雜交：5.1 每張切片滴加適量雜交液(約25 ul，根據(jù)組織大小增、減量)，并加蓋玻片（本試劑盒配備，可根據(jù)加入雜交液量進行剪裁）；5.2 放置于95原位雜交加熱器上變性5分鐘；5.3 放入含30%濕盒增效液的濕盒中，37下孵育4-16 小時。建議過夜（16小時）以保證低拷貝樣本的雜交效果；5.4 48（PBS 預溫）浸泡切片，小心移去蓋玻片，PBS繼續(xù)浸泡5分鐘；5.5 48 PBS洗滌3x 5分鐘 (輕微振蕩容器)；（注意：蓋玻片規(guī)格應與雜交液量匹配，切片在整個試驗過程中要保持濕潤狀態(tài)，防止干片）6蛋白封閉：小心擦去組織周圍液體，滴加適量蛋白阻斷劑(約50 ul，根據(jù)組

6、織大小增、減量)，室溫水濕盒中孵育5分鐘；PBS洗滌1x1分鐘。7信號放大與顯色：7.1 小心擦去組織周圍液體，滴加適量一抗(約50 ul，根據(jù)組織大小增、減量)，37，水濕盒中孵育30分鐘；37PBS浸泡3x2分鐘（輕微振蕩容器）；7.2 小心擦去組織周圍液體，滴加適量二抗(約50 ul，根據(jù)組織大小增、減量)，室溫，水濕盒中孵育20分鐘；室溫PBS浸泡3x2分鐘 (輕微振蕩容器)；7.3 小心擦去組織周圍液體，滴加適量HRP聚合物(約50 ul，根據(jù)組織大小增、減量)，室溫，水濕盒中孵育30分鐘；室溫PBS浸泡3x2分鐘 (輕微振蕩容器)。7.4 小心擦去組織周圍液體，滴加適量DAB顯色液

7、(約50 ul，根據(jù)組織大小增、減量)，室溫，水濕盒中孵育約10分鐘。（不同樣本的顯色時間可能有所差別，建議鏡下觀察顯色過程）；室溫PBS浸泡3x2分鐘 (輕微振蕩容器)。7.5 自來水沖洗，蘇木精復染（可用鹽酸酒精分化及氨水返藍）。梯度酒精脫水，中性樹膠封片。¨ 陽性結果判斷標準：肝細胞細胞核、胞漿或胞膜棕褐色著色。¨ 其他事項：本試劑保質(zhì)期為12個月?？蛻粼谑盏疆a(chǎn)品時請及時檢查，如發(fā)現(xiàn)有外包裝破損、試劑盒成分不全等產(chǎn)品問題，或者在使用過程中有任何疑問，請及時與泰普客戶服務中心聯(lián)系，我們將及時為您解決。¨ 公司信息：公司名稱：福建泰普生物科學有限公司總部：福建省

8、福州市金山金洲北路7號金山科技企業(yè)孵化器7號樓4層 郵編：350002 電話：800-804-8333，0591-2805 3600 傳真：0591-2805 3700研發(fā)中心：北京市昌平區(qū)北清路中關村生命科學園創(chuàng)新大廈A座207室 郵編：102206 電話：010-8072 0071 傳真：010-8072 0072¨操作步驟簡表操 作參 數(shù)1二甲苯3X102100%酒精1X3395酒精1X3480酒精1X35蒸餾水1X36蛋白酶K消化37，307蒸餾水18過氧化物酶阻斷劑室溫，109PBS洗滌2x110蒸餾水111加雜交液適量12變性95，51330濕盒增效液的濕盒中孵育37，4-16h14PBS（用前48預溫）脫片浸泡1-5+515PBS（用前48預溫）浸泡3X516