人脂肪干細(xì)胞結(jié)合微載體在生物反應(yīng)器中向軟骨細(xì)胞分化

1、人脂肪干細(xì)胞結(jié)合微載體在生物反應(yīng)器中向軟骨細(xì)胞分化            作者：康紅軍，盧世璧，許文靜，張莉，孫明學(xué)，袁玫，趙斌，郭全義 【摘要】  目的探索在旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器內(nèi)，應(yīng)用微載體技術(shù)快速擴增并向軟骨分化人脂肪干細(xì)胞。方法將人脂肪干細(xì)胞結(jié)合Cytodex3微載體在旋轉(zhuǎn)的生物反應(yīng)器（RCSS）內(nèi)進(jìn)行動態(tài)培養(yǎng)，應(yīng)用倒置顯微鏡和掃描電鏡對微載體表面的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)觀察，并對收獲的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行Safranin?O、toluidine blue染色等組織化學(xué)染色及型膠原的

2、免疫化學(xué)染色分析。結(jié)果脂肪干細(xì)胞于24 h內(nèi)貼附于Cytodex3微載體表面，細(xì)胞形態(tài)為短梭形，隨時間的延長，貼附于微載體的細(xì)胞逐漸增多，到培養(yǎng)后期，細(xì)胞密度可達(dá)最初接種的19倍左右，在微載體上收獲的細(xì)胞進(jìn)行番紅花O、阿利新藍(lán)染色呈陽性，型膠原染色陽性，均強于對照組。結(jié)論利用微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可簡便快速地在體外擴增脂肪干細(xì)胞，并成功實現(xiàn)向軟骨細(xì)胞分化。 【關(guān)鍵詞】  脂肪干細(xì)胞； 生物反應(yīng)器； 微載體； 軟骨細(xì)胞自從2001年Zuk等人1從脂肪中提取出了具有多向分化潛能的干細(xì)胞后，脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cells,ADSCs)以其來源廣泛，取材方便，擴

3、增迅速等優(yōu)點迅速成為了組織工程的研究熱點。多項研究證實，ADSCs在體外可以向多種細(xì)胞系分化，包括骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)及內(nèi)皮、3。其生物學(xué)特性與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞非常相似，在組織工程領(lǐng)域頗具應(yīng)用前景。而軟骨是公認(rèn)的最適于應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建的組織，因此以ADSCs作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞，具有很高的實用價值。構(gòu)建組織工程軟骨通常要求短期內(nèi)獲得大量的種子細(xì)胞，并且在體外培養(yǎng)過程中能夠保持良好的表型。傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方式很難滿足這些要求，而立體三維動態(tài)培養(yǎng)不但可以加速細(xì)胞的增殖，而且利于軟骨方向分化及表型的維持。因此，本研究利用生物反應(yīng)器技術(shù)結(jié)合微載體對ADSCs進(jìn)行快速擴增同時向軟骨細(xì)胞方向誘

4、導(dǎo)，旨在觀察ADSCs在微載體上增殖分化情況，探討其未來臨床應(yīng)用的可行性。1  材料和方法1.1  材料    型膠原酶，地塞米松，2?擦姿岐?1?部夠笛?酸，ITS，Cytodex 3(Sigma)，胰酶，高糖DMEM(Gibco)，胎牛血清(元亨圣馬)，F(xiàn)GF?2、TGF?撥?1(Peprotech,UK),型膠原鼠抗人單克隆抗體(北京中山公司)，旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器(Synthecon)，Olympus倒置顯微鏡(Olympus)。1.2  方法1.2.1  ADSCs的分離培養(yǎng)  取膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中切除的髕下脂肪墊

5、，嚴(yán)格保持無菌，取材后30 min內(nèi)進(jìn)行干細(xì)胞分離。在超凈工作臺中，用顯微剪刀仔細(xì)剔除脂肪組織表面的筋膜和小血管，D?Hank's沖洗3遍以洗去紅細(xì)胞的污染。剪碎，加入5倍體積的0.075%的型膠原酶，37、攪拌30 min，離心2 000 r/min，5 min，傾去上層脂肪及上清，D?Hank's洗滌，100目篩網(wǎng)過濾。離心1 000 r/min 5min，沉淀用D?Hank's洗2遍，將細(xì)胞重懸于含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，48 h后換液。細(xì)胞長滿80%后，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。至第2代時，換培養(yǎng)液為軟骨誘導(dǎo)液(5 ng/ml FGF?2,10 n

6、g/ml TGF?撥攏保?50 g/ml Vc、10-7M Dexamethasone,1xITS)進(jìn)行軟骨方向誘導(dǎo)分化。1.2.2  Cytodex 3預(yù)處理  取干重微載體珠50 mg，放入10 ml的潔凈玻璃瓶中。向瓶中加入不含鈣和鎂離子的PBS 10 ml，室溫下至少孵育3 h以膨脹微載體珠，用巴氏吸管棄去上清液，PBS清洗微載體2次，棄去PBS，再加入新鮮不含鈣和鎂離子的PBS 10 ml，高壓滅菌20 min，吸除上清液，微載體用培養(yǎng)液清洗，置于4冰箱中備用。1.2.3  細(xì)胞培養(yǎng)方式  將Cytodex 3微載體50 mg及ADSCs(最終

7、濃度1×105/ml)加入到10 ml體積的RCSS培養(yǎng)容器中，并補加軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基至充滿容器。把接種細(xì)胞的容器連接于旋轉(zhuǎn)底座。整個裝置放于5%CO2孵箱，于37常規(guī)條件下培養(yǎng)。開始以5 r/min的速度旋轉(zhuǎn)5 min，以充分混合細(xì)胞，然后停止旋轉(zhuǎn)5 min。再旋轉(zhuǎn)容器5 min，再停止容器旋轉(zhuǎn)5 min。多次重復(fù)循環(huán)，最后持續(xù)旋轉(zhuǎn)容器并逐步調(diào)整轉(zhuǎn)速至1012 r/min。視培養(yǎng)基顏色及pH值決定是否換液及換液量。ADSCs靜止培養(yǎng)是以1×105/ml接種于6孔板中，每孔2 ml，接種5孔，培養(yǎng)過程中每23 d更換培養(yǎng)液，保持細(xì)胞供養(yǎng)充足。1.2.4  細(xì)胞形態(tài)學(xué)

8、觀察和計數(shù)  人ADSCs分別培養(yǎng)1、3、5、7 d，取樣本于倒置顯微鏡下觀察微載體表面ADSCs生長形態(tài)及增值變化情況，消化、分離微載體表面的軟骨細(xì)胞并用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，描記細(xì)胞培養(yǎng)生長曲線。并取第3 d細(xì)胞微載體樣本，進(jìn)行掃描電鏡觀察，觀察細(xì)胞生長形態(tài)及基質(zhì)分泌情況。對照組靜態(tài)單層培養(yǎng)的ADSCs細(xì)胞，分別于1、3、5、7 d觀察細(xì)胞生長形態(tài)及增值變化情況，并收集一孔細(xì)胞計數(shù)，描記細(xì)胞生長曲線。1.2.5細(xì)胞化學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)分析分別將微載體上生長的ADSCs和單層培養(yǎng)的ADSCs進(jìn)行消化收集，爬片，應(yīng)用Safranin?O染色，toluidine blue染色觀察細(xì)胞外基質(zhì)中

9、GAG合成和分泌情況。應(yīng)用型膠原單克隆抗體與細(xì)胞爬片共同孵育，以DAB為底物應(yīng)用免疫過氧化物酶法顯色，陽性染色為棕色反應(yīng)，觀察型膠原分泌合成情況。2  結(jié)果2.1  ADSCs在Cytodex 3微載體表面貼附生長情況    細(xì)胞接種3 h后，細(xì)胞開始貼附于微載體表面，24 h后，絕大部分細(xì)胞已經(jīng)貼附在微載體表面，培養(yǎng)基中僅可見少量死亡細(xì)胞。細(xì)胞由球形、半球形逐漸伸展為短梭形，偶見偽足伸出，形態(tài)不規(guī)則(圖1a)。第3 d，微載體表面細(xì)胞明顯增多，在不同焦距平面上均可見細(xì)胞貼附生長，細(xì)胞周圍可見基質(zhì)分泌沉淀，微載體間偶見細(xì)胞連接。細(xì)胞形態(tài)呈短梭形

10、扁平狀。培養(yǎng)基中少見死亡細(xì)胞，電鏡掃描，細(xì)胞在微載體表面貼附良好(圖1b)。第5 d，微載體大部分空間已被細(xì)胞所覆蓋，細(xì)胞層疊生長，大量基質(zhì)分泌，單個細(xì)胞形態(tài)不易區(qū)分，微載體之間可見寬大的細(xì)胞連接體，微載體呈團狀生長(圖1c)。第7 d，微載體已被完全覆蓋，表面細(xì)胞互相重疊呈團塊狀，這使得微載體表面變得粗糙、凹凸不平。微載體間廣泛存在細(xì)胞連接，培養(yǎng)基中幾乎無脫落細(xì)胞(圖1d)。2.2  ADSCs在靜態(tài)培養(yǎng)中生長情況    細(xì)胞接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基2 h后，開始貼壁，24 h后全部貼壁。細(xì)胞形態(tài)為短梭形或多角形，與未誘導(dǎo)ADSCs相比較細(xì)胞個體略大。完全貼壁

11、后即開始快速增殖，3 d達(dá)到50%融合，5 d達(dá)到80%融合。隨細(xì)胞密度增加，增值速度減慢，7 d基本完全融合。 2.3  2種不同培養(yǎng)方式下ADCSs的生長曲線    在第1、3、5、7d，分別從RCCS容器及普通培養(yǎng)瓶中收集ADSCs并計數(shù)，做生長曲線如圖2。臺盼藍(lán)染色排除試驗顯示，從微載體上回收ADSCs存活率90%以上。血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，可見ADSCs于RCSS接種后的第3 d起生長加速，至第7 d細(xì)胞密度達(dá)到最高值，約為最初接種的19倍。靜態(tài)單層培養(yǎng)第7 d收獲細(xì)胞總數(shù)約為最初的6倍余。2.4  細(xì)胞化學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)檢查分析

12、0;   2組不同培養(yǎng)方式的ADSCs爬片染色顯示，微載體培養(yǎng)的細(xì)胞Safranin?O染色，toluidine blue染色呈強陽性，強于靜態(tài)培養(yǎng)組，表明細(xì)胞外基質(zhì)中含有大量GAG；型膠原染色亦呈強陽性。結(jié)果表明微載體上培養(yǎng)的ADSCs經(jīng)過動態(tài)誘導(dǎo)培養(yǎng)，有軟骨特征性基質(zhì)成分表達(dá)(圖35)。    3  討論    脂肪來源干細(xì)胞容易獲得，并且來源廣泛，與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞一樣均屬于來自中胚層的成體干細(xì)胞。De Ugarte等5發(fā)現(xiàn)來源于骨髓和脂肪組織的干細(xì)胞在細(xì)胞獲得率、細(xì)胞老化、基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞的黏附特性等

13、方面沒有明顯的差別。因此，ADSCs作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞，具有不可多得的優(yōu)勢和前景。    作為臨床應(yīng)用，構(gòu)建組織工程軟骨往往需要大量的種子細(xì)胞，有研究表明當(dāng)細(xì)胞數(shù)量少于1×107/ml時就不能形成軟骨或生成很少6。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式不僅擴增速度慢，而且不容易維持干細(xì)胞誘導(dǎo)后的表現(xiàn)；在三維培養(yǎng)條件下則有利于ADSCs向軟骨方向分化，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成7；而動態(tài)三維立體培養(yǎng)則進(jìn)一步提高了組織工程軟骨的生物化學(xué)功能和生物力學(xué)功能。    微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是一種微載體與生物反應(yīng)器結(jié)合的技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。在動

14、態(tài)培養(yǎng)過程中，外部流體力學(xué)刺激能夠明顯增加細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成，利用生物反應(yīng)器和微載體進(jìn)行細(xì)胞擴增，細(xì)胞濃度最高可達(dá)到1×8/ml8,9。這在常規(guī)培養(yǎng)條件下是很難達(dá)到的。這首先是由于微載體有較大的表面積(Cytodex 3 110 g提供約4600 cm的表面積)2,5，相同容積的生物反應(yīng)器和普通培養(yǎng)瓶相比，前者可比后者多培養(yǎng)數(shù)10倍甚至100倍的細(xì)胞，可以滿足較大體積組織構(gòu)建對種子細(xì)胞數(shù)量的需求；其次因為整個培養(yǎng)容器由電機驅(qū)動沿水平軸旋轉(zhuǎn)，培養(yǎng)基以及細(xì)胞顆粒隨容器一起旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞微載體顆粒在水平軸內(nèi)建立均質(zhì)的液體懸浮軌道，使細(xì)胞所受到的重力、浮力及剪切力達(dá)到平衡，這就構(gòu)成了

15、一種微重力培養(yǎng)環(huán)境，利于細(xì)胞聚集，并在微載體表面各個方向上均衡擴增生長；最后一點在這種動態(tài)環(huán)境中，細(xì)胞與營養(yǎng)物質(zhì)易于均質(zhì)分布，顯著改善微環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的交換，保持培養(yǎng)環(huán)境的均一性和穩(wěn)定性，有效促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。    組織構(gòu)建的另一個難題是怎樣保持其誘導(dǎo)表型，不發(fā)生去分化。生物反應(yīng)器和微載體介導(dǎo)的動態(tài)三維培養(yǎng)，不但為細(xì)胞增殖提供了良好的環(huán)境，而且周期性的力學(xué)刺激作為一種必要的物理信號在細(xì)胞的分化過程中起到了重要的作用。在動態(tài)環(huán)境中細(xì)胞活性增強，加之誘導(dǎo)因子的作用，使得大量蛋白合成分泌，形成特異的細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)了細(xì)胞的分化和成熟?？傊?，這種動態(tài)培養(yǎng)微環(huán)

16、境提供了細(xì)胞聚集、快速三維生長和分化的條件，為工程化組織構(gòu)建提供了更為有效的手段10。本實驗的結(jié)果也證實了這一點，實驗中ADSCs在微載體上能夠迅速貼附、伸展并快速增殖。第7 d細(xì)胞已將微載體表面完全覆蓋，并凸出微載體表面生長，微載體間相互連接，呈團狀生長。微載體培養(yǎng)在1周的時間內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增長了近20倍，而靜態(tài)培養(yǎng)則僅為6倍，組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)均顯示微載體培養(yǎng)的細(xì)胞有較好的表型及細(xì)胞外基質(zhì)。本研究為以ADCSs作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨提供了實驗依據(jù)，為進(jìn)行更加深入的研究奠定了基礎(chǔ)。       【參考文獻(xiàn)】 

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