脂多糖結(jié)合蛋白及其拮抗劑的研究進(jìn)展-- 生物化學(xué)

1、脂多糖結(jié)合蛋白及其拮抗劑的研究進(jìn)展- 生物化學(xué)    摘要 脂多糖（LPS）結(jié)合蛋白（LBP）是存在于正常人中和動(dòng)物血清中的一種糖蛋白，分子量為60kDa，其蛋白質(zhì)部分為456個(gè)氨基酸殘基組成的肽鏈，由肝細(xì)胞合成。LBP與LPS中的脂質(zhì)A具有高度親和性，可作為L(zhǎng)PS載體，催化LPS與CD14結(jié)合；LBP還可作為調(diào)理素，促進(jìn)單核細(xì)胞等吞筮調(diào)理后的LPS和革蘭陰性菌。殺菌/通透性增加蛋白（BPI）是LBP的生物拮抗劑，存在于人中性和嗜酸性粒細(xì)胞的細(xì)胞顆粒中，是一個(gè)55kDa的糖蛋白，其分子結(jié)構(gòu)和氨基酸序列與LBP相似（也是由456個(gè)氨基酸殘基細(xì)胞），能夠競(jìng)爭(zhēng)

2、性地與LPS結(jié)合，具有中和LPS和抗菌作用。關(guān)鍵詞：脂多糖結(jié)合蛋白 殺菌/通透性增加蛋白 脂多糖 結(jié)構(gòu)與功能脂多糖（LPS）結(jié)合蛋白（LBP）和殺菌/通透性增加蛋白（bacteridal/ permeabilityincreasing protein,BPI）是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)相似、生物學(xué)活性相反的LPS反應(yīng)蛋白，分別介導(dǎo)和抑制LPS致宿主細(xì)胞的免疫和病理反應(yīng)?，F(xiàn)將兩者的化學(xué)結(jié)構(gòu)、合成、分布、生物學(xué)活性和功能分述如下。LBPLBP是存在于正常人和動(dòng)物血清中的一種糖蛋白，因其對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素即LPS中的脂質(zhì)A具有高度親和性，易與LPS結(jié)合，故此命名1?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)LBP是一種分子量的為6kDa的糖蛋白，其蛋

3、白質(zhì)部分是由一條50kDa的單鏈多肽組成。人LBP的氨基酸序列已弄清，為一個(gè)由26個(gè)氨基酸殘基的疏水性多肽片段和一個(gè)由456個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)多肽鏈構(gòu)成，其蛋白質(zhì)多肽鏈上含有4個(gè)半胱氨酸和5個(gè)糖基結(jié)合部位（分別位于多肽鏈的275-277、325-327、330-332、361-363和369-371位）。兔LBP的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與人LBP相似，也為一個(gè)由26個(gè)氨基酸殘基的疏水性多肽片段和一個(gè)由456個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)多肽鏈構(gòu)成。其氨基酸序列與人LBP具有高度同源性，有69%的氨基酸序列相同，但僅含有2個(gè)半胱氨酸和3個(gè)糖基結(jié)合部位（分別位于275-277、325-377和361-363位

4、）2。合成與分布LBP由肝細(xì)胞合成和分泌。人肝細(xì)胞內(nèi)LBP基因位于20號(hào)常染色體的長(zhǎng)臂端q11，23和q12之間。人和兔LBP基因已被克降，其核苷酸序列也已清楚2。白細(xì)胞介素6（IL-6）是LBP合成的必要條件。IL-6能夠激活人肝細(xì)胞的LBP基因，促進(jìn)mRNA轉(zhuǎn)錄和LBP合成。在無IL-6的條件下，體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞合成LBP的量很少，39小時(shí)后LBP量逐漸減少；加入IL-6后，LBP量明顯增加，且不隨時(shí)間增加而減少。IL-1、腫瘤壞死因子（TNF）和地塞米松單獨(dú)不能促進(jìn)LBP合成，但三者均可增強(qiáng)IL-6對(duì)LBP合成的促進(jìn)作用，尤其是在IL-6和地塞米松同時(shí)存在的條件下，IL-6或TNF均可明

5、顯增強(qiáng)LBP的合成2，3。人肝細(xì)胞瘤Hep g2細(xì)胞能夠合成、分泌LBP3，且Hep G2細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期傳代，可用作研究LBP合成的影響因素的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。利用EB病毒作轉(zhuǎn)導(dǎo)，可將從人肝細(xì)胞中克降出的人LBP基因片段（cDNA），整合到人腎細(xì)胞（293-EBNA細(xì)胞株）的DNA中，產(chǎn)生重組人LBP2。LBP由肝細(xì)胞合成后分泌入血，存在于正常人和動(dòng)物的血清中。人血清中的正常濃度為510g/ml,急性反應(yīng)期可升高到200g/ml2?；钚耘c功能作為L(zhǎng)PS載體蛋白，介導(dǎo)LPS依賴性的細(xì)胞反應(yīng) lBP與LPS的脂質(zhì)A具有高度親和性，能識(shí)別并結(jié)合LPS，形成LPS/LBP復(fù)合物，一方面通過膜上LPS/LB

6、P復(fù)合物受體膜結(jié)合CD14（mCD14）,直接刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等，使其分泌產(chǎn)生TNF、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子，增強(qiáng)細(xì)胞粘附功能，產(chǎn)生一系列病理（炎癥反應(yīng)等）、生理（殺滅細(xì)菌等）反應(yīng)2，4，5；另一方面通過可溶性CD14（sCD14），激活、損傷內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等不含mCD14的細(xì)胞，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)（炎癥反應(yīng)、DIC等）4，5。LBP與LPS結(jié)合形成LPS/LBP復(fù)合物，再與mCD14或sCD14結(jié)合，刺激單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等，引起一系列病理生理反應(yīng)。在此過程中，LBP作為載體蛋白，將LPS傳遞給CD146。最新研究表明，LBP實(shí)際上是一種有機(jī)催化劑，催化LP

7、S與CD14結(jié)合，即LBP的氨基末端區(qū)先與LPS微團(tuán)中的LPS結(jié)合，形成LPS單體-LBP復(fù)合物（類似于底物-酶復(fù)合物），再通過LBP的羧基末端區(qū)與CD14結(jié)合，形成LPS/LBP/CD14復(fù)合物，嗣后LBP從復(fù)合物中脫出、再進(jìn)入下個(gè)循環(huán)，而剩下LPS/CD14復(fù)合物。LBP通過此方式催化LPS與CD14結(jié)合7。作為調(diào)理素，發(fā)揮調(diào)理作用 LBP與LPS結(jié)合形成LPS/LBP復(fù)合物，再與紅細(xì)胞等顆粒物質(zhì)結(jié)合；或直接與紅細(xì)胞等顆粒物質(zhì)表面的LPS結(jié)合；也可以直接與革蘭陰性菌結(jié)合；將這些被包被的顆粒傳遞給單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，使吞噬細(xì)胞便于吞噬這些被包被的LPS和細(xì)菌6。調(diào)節(jié)LPS所致的炎癥反應(yīng) 識(shí)

8、別LPS的存在，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和抗炎反應(yīng)的首要環(huán)節(jié)。LBP因其與LPS脂質(zhì)A的高度親和性，可早期識(shí)別可溶性LPS及細(xì)菌表面的LPS，并與之結(jié)合，通過以下兩個(gè)環(huán)節(jié)，調(diào)節(jié)LPS所致的炎癥反應(yīng)：（1）介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。一方面通過mCD14，激活單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等，使其產(chǎn)生TNF、IL-1、IL-6等炎性介質(zhì)，其中TNF最為重要。TNF是致機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和休克的重要因子，LBP能明顯增強(qiáng)LPS對(duì)TNF的誘生作用，增加TNF mRNA轉(zhuǎn)錄的速度和程度，使TNF濃度從40U/ml迅速上升到10000U/ml。而LBP本身并不能誘導(dǎo)TNF mRNA的轉(zhuǎn)錄和TNF的產(chǎn)生；但缺少LBP的結(jié)合，LPS就不能

9、明顯地刺激TNF的產(chǎn)生4。另一方面，通過sCD14，激活、損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)炎性因子向血管外滲透，促進(jìn)單核細(xì)胞等與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附并進(jìn)入組織，加重炎癥反應(yīng)；進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)的LBP，還可刺激巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，增強(qiáng)其對(duì)LPS的反應(yīng)性5。（2）緩解炎癥反應(yīng)。LBP可通過調(diào)理作用，促進(jìn)單核細(xì)胞等吞噬被調(diào)理的LPS或細(xì)菌，及時(shí)清除進(jìn)入體內(nèi)的LPS和革蘭陰性菌6。LBP還可催化LPS與高密度脂蛋白（HDL）結(jié)合，而HDL則能夠結(jié)合LPS，并中和LPS的生物學(xué)活性8。LBP既可通過激活單核細(xì)胞、釋放炎性介質(zhì)、損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞等，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)；又可通過調(diào)理作用，清除LPS和細(xì)菌，并催化LPS與

10、HDL結(jié)合，中和LPS的生物學(xué)活性，減輕炎癥反應(yīng)，故可調(diào)節(jié)LPS所致的炎癥反應(yīng)。但LBP的生理功能是以傳遞LPS、介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)為主9，即LBP介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的活性較緩解炎癥反應(yīng)的活性強(qiáng)。 BPIBPI，是另一種LPS反應(yīng)蛋白，是LBP的生物拮抗劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與LBP相似，生物學(xué)功能卻正相反2?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)BPI也是一種分子量為55kDa的糖蛋白，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和氨基酸序列與LBP相似（與人和兔LBP分別有44%和40%的同源性），其多肽鏈也是由456個(gè)氨基酸殘基組成2，7，10，11。BPI多肽鏈包括兩個(gè)功能區(qū)，氨基末端區(qū)具有抗菌和抗內(nèi)毒素功能，大小約20kDa；羧基末端區(qū)則具有調(diào)理功能10，11。合

11、成與分布BPI主要存在于中性粒細(xì)胞中的嗜苯胺藍(lán)顆粒中，含量約為710ng/5×106個(gè)細(xì)胞2，12。BPI還存在于嗜酸性粒細(xì)胞的未成熟或成熟的特殊顆粒和吞噬體中，較中性粒細(xì)胞中BPI含量少，約179ng/5×106個(gè)細(xì)胞12。LPS和TNF能夠刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生長(zhǎng)釋放BPI，而LI-1、IL-8和血小板激活因子等誘生BPI的活性則較弱13。目前，已能利用分子生物學(xué)技術(shù)，制備出重組人BPI（rBPI）和重組人BPI氨基末端21kDa片段（rBPI21）11?；钚耘c功能作為L(zhǎng)BP的拮抗劑，抑制LPS依賴性的細(xì)胞反應(yīng) bPI也與LPS的脂質(zhì)A具有高度親和性。但作為L(zhǎng)PS反應(yīng)蛋白，

12、LBP和BPI的生物學(xué)功能正相反，前者為激活劑，后者為拮抗劑。BPI可與細(xì)菌表面或游離型LPS結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制LBP與LPS結(jié)合，減少LPS/LBP復(fù)合物形成，抑制LPS對(duì)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的激活作用，抑制細(xì)胞粘附作用和炎性介質(zhì)的釋放，有效地拮抗由LBP介導(dǎo)的LPS性炎癥反應(yīng)，減少內(nèi)毒素血癥和敗血癥休克的死亡率。BPI抗內(nèi)毒素功能區(qū)全部分布在氨基末端區(qū)10，11。BPI與LPS的親和力較LBP與LPS的親和力強(qiáng)，較低濃度的BPI即能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制較高濃度的LBP與LPS的結(jié)合；LPS-BPI復(fù)合物對(duì)單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞無刺激作用4。作為調(diào)理素，發(fā)揮調(diào)理作用 BPI除能競(jìng)爭(zhēng)性地與LPS結(jié)合，減少由

13、LBP、CD14介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，還可以直接與細(xì)菌結(jié)合，尤其是與易逃避吞噬細(xì)胞吞噬作用的有莢膜細(xì)菌結(jié)合，起調(diào)理素的作用，使中性粒細(xì)胞易于吞噬這些被調(diào)理后的細(xì)菌。BPI調(diào)理作用的機(jī)理與LBP傳遞LPS給細(xì)胞表面mCD14的方式相似，即BPI通過其氨基末端區(qū)與LPS結(jié)合，再通過其羧基末端區(qū)與吞噬細(xì)胞表面結(jié)合，形成橋狀連接，便于吞噬細(xì)胞吞噬、殺滅這些細(xì)菌7，11。BPI調(diào)理作用功能區(qū)分布在羧基末端區(qū)11。BPI可在細(xì)胞內(nèi)殺傷被中性粒細(xì)胞吞噬的革蘭陰性菌；分泌至細(xì)胞外的BPI也能殺傷對(duì)吞噬有抵抗作用的、有莢膜的細(xì)菌7。BPI還可與活菌結(jié)合，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)10。BPI抗菌功能區(qū)也在氨基末端區(qū)10，11。消炎

14、、抗菌染作用 BPI以及rBPI21,能夠與游離型和細(xì)菌表面的LPS結(jié)合，抑制LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)10；抑帛TNF-、IL-6等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生14；通過調(diào)理作用，刺激吞噬細(xì)胞吞噬、殺滅細(xì)菌11；殺傷被中性粒細(xì)胞吞噬的革蘭陰性細(xì)菌，殺傷對(duì)吞噬有抵抗作用的、有莢膜的細(xì)菌7；還可直接與活菌結(jié)合，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)10，具有消炎、抗菌作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和、期臨床實(shí)驗(yàn)證明，BPI、rBPI和rBPI21能夠殺滅腦膜炎球菌等多種革蘭陰性細(xì)菌，結(jié)合并清除內(nèi)毒素，具有較顯著的抗菌、抗內(nèi)毒素臨床療效15。而且，BPI，尤其是rBPI21無毒、無熱原，是一種很好的生物治療劑10，11。參考文獻(xiàn)1 Tobias PS et

15、al.J Exp Med,1986;164(3):777-7932 Beamer LJ et al.Protein Sci,1998;7(4):906-9143 Grube BJ et al.J Biol Chem,1994:269(11):8477-84824 Abrahamson SL et al.J Biol Chem,1997;272(4):2149-21555 Tapping RI et al.J Biol Chem,1997;272(37):23157-231646 Wright D et al,Science,1990;249(4975):1431-14337 Iovine NM et al.Proc Natl Acad Sci USA,1997:94(20):10973-109788 Schletter J et al.Arch Microbiol,1995;164(6):383-3899 Ulevitch RJ et al.Annu Rev Immunol,1995;13:437-45710 Elsbach P.J Leukoc Biol,1998;64(1):14-1811 Elsbach P et al.Curr Opi