人參皂苷Rg1對(duì)癡呆大鼠行為學(xué)及酪氨酸蛋白激酶A表達(dá)的影響

1、人參皂苷Rg1對(duì)癡呆大鼠行為學(xué)及酪氨酸蛋白激酶A表達(dá)的影響        【摘要】     目的 探討人參皂苷Rg1對(duì)癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其對(duì)酪氨酸蛋白激酶A(TrkA)陽(yáng)性細(xì)胞的保護(hù)作用。方法 采用切斷成年Wistar 大鼠左側(cè)穹窿海馬傘（FF）的方法，建立隔海馬膽堿能系統(tǒng)損害的癡呆模型。分為模型組、治療組和假手術(shù)對(duì)照組3組。治療組經(jīng)腹腔內(nèi)注射Rg1(5 mg·kg-1)，模型組和假手術(shù)對(duì)照組給予生理鹽水。利用Morris水迷宮測(cè)定其學(xué)習(xí)記憶

2、能力，利用免疫組化及圖像分析測(cè)定大鼠內(nèi)側(cè)隔核(MS) 和斜角帶垂直支(VDB) TrkA 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及OD值。結(jié)果 治療組大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)優(yōu)于模型組（P005），其MS和VDB的TrkA 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及OD值與模型組相比也有改善（P005）。結(jié)論 人參皂苷Rg1對(duì)中樞膽堿能系統(tǒng)有保護(hù)作用，能改善學(xué)習(xí)記憶能力。     【關(guān)鍵詞】  人參皂苷Rg1TrkA穹隆海馬傘    現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,人參皂苷具有抗衰老、增強(qiáng)記憶力等作用,張均田等1研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg1對(duì)多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶障礙均有明顯的改

3、善作用,但少見人參皂苷Rg1對(duì)穹隆海馬傘切斷造成癡呆模型大鼠腦內(nèi)神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體影響的報(bào)道，本研究用切斷左側(cè)穹隆海馬傘建立大鼠癡呆模型，經(jīng)人參皂苷Rg1治療一個(gè)月后觀察內(nèi)側(cè)隔核(MS) 和斜角帶垂直支(VDB)TrkA 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及OD值，探討人參皂苷Rg1對(duì)呆模型大鼠的保護(hù)作用。1  材料與方法11  試驗(yàn)動(dòng)物  用水迷宮篩選反應(yīng)迅速、活躍的40只健康雄性Wistar 大鼠，鼠齡34個(gè)月，體重250300 g，常規(guī)飼養(yǎng)。12  主要試劑及藥品  兔抗鼠TrkA多克隆抗體購(gòu)自博士德公司。人參皂苷單體Rg1 (含量 98%)購(gòu)自白求恩醫(yī)科大學(xué)有機(jī)

4、化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。13  主要儀器  腦立體定位儀(日本);Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)科院藥物所研制)，TJY400真彩色細(xì)胞圖像分析儀。14  方法141  動(dòng)物分組與模型建立  采用完全單純隨機(jī)分為3組（每組10只），即模型組、治療組和假手術(shù)對(duì)照組。    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用10%水合氯醛3 ml/kg經(jīng)腹腔麻醉后,固定在腦立體定位儀上,常規(guī)剪毛、消毒,正中切開頭皮，暴露出顱骨，參照Paxinos和Watson的大鼠腦立體定位圖譜2,于前囟后2225 mm，中線外10 mm 處,用電動(dòng)開顱器鉆開顱骨,切開硬腦膜,用自制雙刃刀

5、先置于上述部位的腦表面,接著降刀45 mm,外移10 mm，然后再降刀10 mm，外移15 mm，最后上下抽動(dòng)刀約20 次,以保證海馬傘外側(cè)緣完全切斷。清潔顱面,縫合頭皮,常規(guī)飼養(yǎng)3，4。假手術(shù)組除了不切斷海馬傘外,其余處理同上。142  給藥方法  Rg1治療組：左側(cè)穹隆海馬傘切斷后,同時(shí)給予腹腔內(nèi)注射Rg1(5 mg/kg),每天1次,連續(xù)注射30 d。模型組和假手術(shù)對(duì)照組每天腹腔內(nèi)注射生理鹽水1 ml,連續(xù)30 d。143  行為學(xué)測(cè)試  各組分別于模型制作前及術(shù)后30 d均進(jìn)行orris水迷宮行為學(xué)測(cè)試。測(cè)試時(shí)實(shí)驗(yàn)室的溫度保持在2425，orri

6、s水迷宮中加入奶粉1 kg,用熱水沖開,再用水加至高過安全平臺(tái)1 cm,水溫保持在22左右。奶粉水溶液中不能明顯見到安全平臺(tái)。水池四周存在豐富的空間參考線索（門、窗、燈、試驗(yàn)者等），應(yīng)保持不變以供大鼠定位平臺(tái)。水池上方通過一攝像機(jī)與監(jiān)視電視和計(jì)算機(jī)連接,利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)動(dòng)物的活動(dòng)進(jìn)行全程跟蹤,自動(dòng)錄入大鼠游泳軌跡進(jìn)行分析。測(cè)試程序?yàn)槎ㄎ缓叫袑?shí)驗(yàn)：歷時(shí)4天，每天上下午各2次，將動(dòng)物頭朝壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄其在3 min內(nèi)尋找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期。如果大鼠在3 min未找到平臺(tái)，潛伏期記為最高分180 s。術(shù)后30 d各組大鼠重新進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn)，大鼠每次在3 min內(nèi)尋找到并爬

7、上平臺(tái)的時(shí)間為大鼠的再現(xiàn)記憶成績(jī)，每天2次，連續(xù)4 d，計(jì)算平均成績(jī)。143  標(biāo)本制作及觀察  所有大鼠在建立模型后30 d麻醉大鼠，暴露心臟,先以生理鹽水200 ml經(jīng)升主動(dòng)脈沖洗,再灌注4多聚甲醛200 ml固定,取腦備用。腦組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋,每只鼠在靶區(qū)附近連續(xù)切片，片厚為45 m，備免疫組化之用。(每只大鼠取含典型內(nèi)側(cè)隔核(MS) 和斜角帶垂直支(VDB) 切片5 張，切片的斷面水平在各鼠均相似。)145  免疫組化分析  切片經(jīng)脫蠟、阻斷、封閉后加入TrkA 抗體(1200，博士德公司),4 過夜,或37 孵育1 h，001

8、 mol/L 的PBS 漂洗3次,每次10 min，LK 入生物素化兔二抗(博士德公司)孵育20 min，001 mol/L PBS 溶液漂洗3 次，每次10 min，加入鏈霉素抗生物素過氧化物酶孵育30 min，001 mol/L PBS 溶液漂洗3 次,每次10 min，蒸餾水快洗3 次。DAB法顯色,鏡下控制時(shí)間,蒸餾水終止反應(yīng),干燥、脫水、透明、封片,光鏡觀察。陰性對(duì)照用001 mol/L PBS 代替一抗,其余步驟相同。15  數(shù)據(jù)獲取與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  參考Paxinos和Watson編寫的大鼠腦圖譜2,光學(xué)顯微鏡下觀察左側(cè)內(nèi)側(cè)隔核(MS) 和斜角帶垂直支(VDB)

9、TrkA 陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，每張切片隨機(jī)各取5個(gè)視野記錄,計(jì)算平均單個(gè)視野中TrkA陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。然后輸入圖像分析儀，對(duì)所選陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值進(jìn)行測(cè)量，求出每組陽(yáng)性細(xì)胞胞體的平均灰度值，然后做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。    數(shù)據(jù)用SPSS110 軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。同組大鼠逃避潛伏期在干預(yù)前、后的比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，干預(yù)前、后各組大鼠間逃避潛伏期的比較用單因素方差分析加Tukey 兩兩比較。各組大鼠MS 和VDB 的TrkA 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及OD值的比較用單因素方差分析加Tukey 兩兩比較。2  結(jié)果21  人參皂苷Rg1對(duì)FF損傷大鼠學(xué)習(xí)

10、記憶的影響  以大鼠逃避潛伏期代表學(xué)習(xí)記憶能力，逃避潛伏期越短，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)。模型組大鼠與假手術(shù)對(duì)照組相比潛伏期延長(zhǎng)（P005）；治療組較模型組潛伏期減少（P005），但沒有達(dá)到假手術(shù)對(duì)照組的水平（P005）。這表明人參皂苷Rg1能夠改善癡呆模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力（見表1）。表1  治療前、后各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試成績(jī)（略）與模型組比較：1）P005；與假手術(shù)對(duì)照組比較：2）P005；與假手術(shù)對(duì)照組比較：3）P005，下表同22  人參皂苷Rg1對(duì)FF損傷后MS和VDB的TrkA陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目及OD值的影響  假手術(shù)組大鼠MS和VDB區(qū)有

11、基礎(chǔ)水平的TrkA 表達(dá)。模型組與假手術(shù)組比較，MS和VDB區(qū)TrkA 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)值明顯減少,OD值明顯增高(P005) 。治療組MS和VDB區(qū)TrkA 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)值明顯高于模型組（P005），但是沒有達(dá)到假手術(shù)對(duì)照組的水平（P005），（見表2）。表2  藥物對(duì)大鼠MS和VDB的TrkA陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)(個(gè)/視野)及OD值的影響（略）3  討論    基底前腦廣泛向大腦皮質(zhì)、海馬和其他一些結(jié)構(gòu)投射，形成前腦膽堿能系統(tǒng)。Alzheimer病基底前腦膽堿能神經(jīng)元發(fā)生嚴(yán)重潰變，導(dǎo)致皮質(zhì)和海馬的膽堿能纖維支配減少及膽堿乙?；富钚越档停⒊霈F(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力

12、障礙。單側(cè)切斷穹隆海馬傘造成隔海馬膽堿能通路損害是模擬AD前腦膽堿能系統(tǒng)受損的一個(gè)經(jīng)典模型4。本實(shí)驗(yàn)大鼠行為學(xué)證實(shí)造模成功。前腦膽堿能神經(jīng)元是NGF 敏感神經(jīng)元,它們含有大量NGF 受體，多數(shù)人的研究結(jié)果都提示AD 病人基底前腦膽堿能神經(jīng)元功能喪失與NGF 受體減少密切有關(guān)5，6。Boissiere等7用免疫組化方法檢測(cè)人基底前腦，發(fā)現(xiàn)基底前腦中有99的膽堿能神經(jīng)元同時(shí)表達(dá)TrkA。目前的研究提示，在正常鼠的腦中TrkA 和ChAT 有相似的時(shí)空模式，認(rèn)為TrkA 和ChAT 表達(dá)下降是老年動(dòng)物和老年癡呆患者基底前腦膽堿能神經(jīng)元變性的易感性增加的原因之一8。在基底前腦表達(dá)TrkA mRNA 的

13、膽堿能纖維廣泛地投射到海馬和新皮質(zhì)9。本研究發(fā)現(xiàn)左側(cè)穹隆海馬傘切斷后，MS和VDB的TrkA陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)明顯減少，證明TrkA陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)減少可以作為老年性癡呆模型檢測(cè)指標(biāo)。    人參皂苷Rg1是人參的標(biāo)志性成分，具有人參的許多生物活性，研究表明，人參皂苷Rg1能通過促進(jìn)腦內(nèi)蛋白質(zhì)合成起到促智、抗衰老的作用。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)神經(jīng)元的大多數(shù)效應(yīng)是由Trk 受體介導(dǎo)的,包括神經(jīng)元的存活、分化、軸突生長(zhǎng)、突觸可塑性等。其中N GF 與TrkA 結(jié)合,可激活酪氨酸激酶信號(hào)傳遞系統(tǒng),從而啟動(dòng)細(xì)胞活性,產(chǎn)生生物效應(yīng)10。已證明NGF 能有效防止模擬AD 病變的動(dòng)物基底前腦膽堿

14、能神經(jīng)元變性和死亡。但是NGF 分子量大，口服或注射難以達(dá)到大腦，造成治療上的困難。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用人參皂苷Rg1 腹腔內(nèi)注射治療單側(cè)切斷穹隆海馬傘造成隔海馬膽堿能通路損害的AD大鼠模型。結(jié)果顯示人參皂苷Rg1能明顯保護(hù)基底前腦TrkA陽(yáng)性神經(jīng)元。應(yīng)用小分子化合物人參皂苷Rg1在體內(nèi)促進(jìn)TrkA神經(jīng)元增加，克服以往研究中NGF不能通過血腦屏障的缺點(diǎn)，提示人參皂苷Rg1在體內(nèi)可能通過兩個(gè)途徑改善癡呆模型：1、促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元TrkA表達(dá)，增加NGF 與TrkA 結(jié)合機(jī)會(huì)，從而激活酪氨酸激酶信號(hào)傳遞系統(tǒng),從而啟動(dòng)細(xì)胞活性,產(chǎn)生生物效應(yīng)。2、促進(jìn)腦內(nèi)N GF表達(dá)代替外源性N GF的作用達(dá)到治療AD的作用。

15、后一推測(cè)有待今后研究中更直接的證據(jù)進(jìn)一步證明。我們認(rèn)為人參皂苷Rg1 是治療以認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)記憶下降為主要表現(xiàn)的AD 候選藥物。    【參考文獻(xiàn)】  1 張均田人參研究的回顧和展望J藥學(xué),1995；30(5):32152 Paxinos G，Watson CThe rat brain in stereotaxic coordinatedMAustralia：Academic Press Australia,1988：233 He YS，Yao ZBNGF promotes collateral sprouting fiber in the s

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