椒目油對(duì)哮喘豚鼠白細(xì)胞介素4,5及氣道反應(yīng)性的影響

1、椒目油對(duì)哮喘豚鼠白細(xì)胞介素4,5及氣道反應(yīng)性的影響            作者： 趙睿，戚好文，謝柏梅，李志超 【關(guān)鍵詞】  椒目油；哮喘；白細(xì)胞介素    【Abstract】 AIM: To explore the effects of Jiaomu Oil on interleukin4,5 in serum and airway hyperresponsiveness (AHR) of asthmatic model in guinea

2、pig and to provide theoretical basis for treatment of asthma using Jiaomu Oil . METHODS: This experiment included 4 groups: normal control group, asthmatic model group, dexamethasone treatment group and Jiaomu Oil treatment group, involving 10 guinea pigs in each group. Asthmatic models in guinea pi

3、gs were constructed by immunization of intraperitoneal injection with saline ovalbumin (OVA) and challenge of inspiration with nebulized OVA. A threeway cannula was inserted into the lumen of the trachea for mechanical ventilation and the intratracheal pressure (IP) was measured simultaneously for r

4、eflecting airway responsiveness. The levels of IL4,5 in serum of guinea pigs were determined using enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS: The levels of IL4,5 of asthmatic model group(38.2±3.4) and (344.4±21.8) ng/L were significantly higher than those of normal control group(19

5、.8±1.2) and (77.8±26.0) ng/L(P<0.01). The levels of IL4,5 of Jiaomu Oil(22.8±3.5) and (89.2±38.7) ng/Land dexamethasone groups(22.0±1.8) and (234.6±35.1) ng/Lwere both significantly lower than those of asthmatic model group(P<0.01). The level of IL4 of Jiaomu Oil

6、group didnt have any significant difference from that of dexamethasone group(P>0.05),  While  the level of IL5 of Jiaomu Oil group was significantly lower than that of dexamethasone group(P<0.01). The airway responsiveness of asthmatic model group (0.013±0.014) g/L was significa

7、ntly higher than that of normal control group (0.168±0.186) g/L, P<0.01. Compared with that of asthmatic model group, the airway responsiveness of Jiaomu Oil (0.160±0.180)  g/L and dexamethasone group (0.144±0.154) g/L both decreased significantly (P<0.01), but they didnt&#

8、160; have any statistical significance from   that of normal control group (P>0.05). The airway responsiveness of Jiaomu Oil group didnt have any statistical significance from  that of dexamethasone group (P>0.05). CONCLUSION: Jiaomu Oil could efficiently decrease the AHR of ast

9、hmatic guinea pig. The mechanism may be that Jiaomu Oil could prevent the production of IL4,5 in asthmatic guinea pig.    【Keywords】  Jiaomu Oil; asthma; interleukin4; interleukin5; airway hyperreactivity    【摘要】目的：  探討椒目油對(duì)哮喘豚鼠模型白細(xì)胞介素4,5(IL4,5)水平及氣道高反應(yīng)性(AHR)的影

10、響，為椒目油治療哮喘提供理論依據(jù). 方法：  實(shí)驗(yàn)分為4組： 正常對(duì)照組、哮喘模型組、地塞米松治療組和椒目油治療組，每組各10只豚鼠. 用卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏和霧化吸入激發(fā)建立哮喘豚鼠模型，三通管做氣管插管進(jìn)行機(jī)械通氣，測(cè)定氣道內(nèi)壓力(IP)以反映氣道反應(yīng)性，ELISA法檢測(cè)豚鼠血清中IL4,5含量. 結(jié)果：  哮喘模型組豚鼠血清IL4,5含量分別為(38.2±3.4)和(344.4±21.8) ng/L顯著高于正常對(duì)照組分別為(19.8±1.2)和(77.8±26.0) ng/L(P<0.01)；椒目油組IL4,5含

11、量分別為(22.8±3.5)和(89.2±38.7) ng/L和地塞米松組IL4,5含量分別為(22.0±1.8)和(234.6±35.1) ng/L均明顯低于哮喘模型組(P<0.01)；椒目油組豚鼠IL4含量與地塞米松組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但I(xiàn)L5含量顯著低于地塞米松組(P<0.01). 哮喘豚鼠模型組氣道反應(yīng)性(0.013±0.014 g/L)與正常對(duì)照組(0.168±0.186 g/L)比較顯著升高(P<0.01)；椒目油治療組與地塞米松治療組氣道反應(yīng)性分別為(0.160±0.18

12、0)和(0.144±0.154) g/L與哮喘模型組比較均顯著降低(P<0.01)，與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；椒目油組氣道反應(yīng)性與地塞米松組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05). 結(jié)論：  椒目油能有效降低哮喘豚鼠AHR，其機(jī)制可能是抑制哮喘豚鼠體內(nèi)IL4,5的生成.     【關(guān)鍵詞】 椒目油；哮喘；白細(xì)胞介素4；白細(xì)胞介素5；氣道高反應(yīng)性     支氣管哮喘是一種變態(tài)反應(yīng)性疾病，IL4,5在其發(fā)病機(jī)制中占重要地位1. 目前臨床上治療哮喘多以對(duì)癥為主. 中藥椒目治療哮喘

13、歷史悠久，療效顯著，但對(duì)其止哮平喘的作用機(jī)制還不清楚. 我們旨在通過(guò)探究椒目油對(duì)哮喘豚鼠血清IL4,5含量及氣道高反應(yīng)性(Hyperresponsiveness, AHR)的影響，揭示椒目治療哮喘的作用機(jī)制，為椒目油運(yùn)用于臨床提供理論依據(jù).    1材料和方法    1.1材料健康雄性豚鼠40只，體質(zhì)量(250±50) g（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；椒目油(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，批號(hào)： 20050221)；卵白蛋白(OVA, Sigma公司)；磷酸組胺(上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司)；戊巴比妥鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限

14、公司，批號(hào)： F20041117)；豚鼠IL4,5 ELISA試劑盒美國(guó)Repidbio(RB)公司；401AI超聲霧化器(上海魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)；動(dòng)物呼吸機(jī)DH140B(浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠)；PTM9醫(yī)用微機(jī)實(shí)控儀(二道生理儀)，RM6280多道智能生理信號(hào)記錄系統(tǒng)(第四軍醫(yī)大學(xué)病理生理學(xué)教研室).    1.2方法    1.2.1豚鼠支氣管哮喘模型的建立參照文獻(xiàn)1. 每日激發(fā)豚鼠1次，共7 d. 每次激發(fā)直到豚鼠出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促、腹肌緊張等哮喘癥狀時(shí)為止.    1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及處

15、理用隨機(jī)數(shù)字表法將豚鼠分為4組： 正常對(duì)照組、哮喘模型組、地塞米松治療組和椒目油治療組，每組各10只. 正常對(duì)照組用等量生理鹽水致敏和霧化激發(fā). 哮喘模型組用OVA致敏激發(fā). 地塞米松治療組致敏激發(fā)方法同哮喘模型組，但激發(fā)后立即給予5 g/L地塞米松溶液霧化吸入5 min. 椒目油組致敏方法同哮喘模型組，激發(fā)后立即給予椒目油和熟精油的混合物(按11混合)，以3 mL/kg灌胃.    1.2.3氣道反應(yīng)性的測(cè)定參照文獻(xiàn)2，以氣道內(nèi)壓力(IP)上升至基線值的20%時(shí)所對(duì)應(yīng)的磷酸組胺濃度(PC20)做為體現(xiàn)氣道反應(yīng)性高低的指標(biāo).    1

16、.2.4測(cè)定IL4,5含量氣道反應(yīng)性測(cè)定完畢后，從豚鼠心臟直接抽血5 mL，靜置30 min后以2000 r/min離心. 收集上層血清，運(yùn)用ELISA法測(cè)定血清IL4,5的含量，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū).    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：  所有數(shù)據(jù)均以x±s表示. 將原始數(shù)據(jù)輸入SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包，氣道反應(yīng)性的組間比較運(yùn)用KruskalWallis H法和Nemenyi法檢驗(yàn)；IL4,5含量的組間比較運(yùn)用SNKq（StudentNewmanKeulsq）法檢驗(yàn). 顯著性水平均為0.05.百事通     2結(jié)果

17、60;   2.1模型動(dòng)物大體表現(xiàn)哮喘組豚鼠在誘喘過(guò)程中出現(xiàn)哮喘發(fā)作癥狀，不同程度地表現(xiàn)為咳嗽、呼吸急促、腹肌緊張、四肢癱軟、行動(dòng)遲緩或俯臥不動(dòng). 椒目油組和地塞米松組豚鼠激發(fā)后癥狀的表現(xiàn)程度較同期哮喘組明顯減弱.    2.2病理學(xué)表現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，哮喘模型組豚鼠肺外觀體積增大，表面略腫脹，有不規(guī)則暗紅色充血區(qū)及多處小米粒大小的紅色出血點(diǎn)，支氣管和肺泡腔內(nèi)黏液分泌明顯增多. 哮喘組肺組織切片(圖1B)與正常對(duì)照組(圖1A)對(duì)比顯示：支氣管壁及支氣管周?chē)M織有多處紅細(xì)胞聚集區(qū)，且有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，包括淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞(EOS)、單核細(xì)胞

18、等；氣道黏膜上皮增厚，氣道變窄，嚴(yán)重者可見(jiàn)脫落. 上述病理表現(xiàn)證明哮喘模型建立成功. 椒目油組豚鼠肺大體表現(xiàn)：體積無(wú)明顯變化，表面充血區(qū)及出血點(diǎn)有明顯吸收的痕跡，面積明顯小于哮喘組，出血點(diǎn)數(shù)量也明顯減少；切片表現(xiàn)為小氣道及肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，支氣管和肺泡腔內(nèi)分泌物顯著減少，肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，無(wú)氣道狹窄及氣道上皮細(xì)胞脫落等現(xiàn)象(圖1C). 地塞米松組病理表現(xiàn)(圖1D)與椒目油組相似，但炎性細(xì)胞的減少較椒目油組弱.    2.3各組間豚鼠血清IL4,5含量及AHR水平的比較哮喘組豚鼠IL4,5含量與正常對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.01，表1)；椒目油和地

19、塞米松組IL4含量較哮喘組均顯著降低(P<0.01)，但與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩治療組IL5含量較哮喘組均顯著降低(P<0.01)，椒目油組降低更為明顯，已接近正常對(duì)照組，然而地塞米松組的IL5下降幅度較小，其水平雖低于哮喘組，但仍高于正常對(duì)照組(P<0.01)；椒目油與地塞米松兩組之間IL4含量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但兩組IL5含量比表1各組豚鼠IL4,5及AHR水平    3討論    AHR是哮喘的重要特征，也是臨床診斷哮喘的主要依據(jù). 氣道炎癥、氣道平滑肌細(xì)胞反

20、應(yīng)性及氣道重建是哮喘發(fā)病機(jī)制的三個(gè)主要因素，其中氣道炎癥為首發(fā)因素. 與哮喘關(guān)系密切的IL4,5是多種炎癥細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子，在AHR的發(fā)生和發(fā)展中占有重要地位. 豚鼠肺組織病理切片的結(jié)果表明椒目油能夠減輕哮喘發(fā)展過(guò)程中引起的組織充血水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)甚至出血壞死等病理改變. 椒目油的上述作用可能與其減少I(mǎi)L4,5合成及釋放有關(guān).    IL4是一種多功能細(xì)胞因子，主要由活化T細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌，是Th2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子. 它可通過(guò)對(duì)B細(xì)胞受體的去抑制作用而活化B細(xì)胞，從而介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答反應(yīng)3. IgE是介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)的重要介質(zhì)，IL4對(duì)IgG向IgE轉(zhuǎn)

21、型有促進(jìn)作用4；IL4與受體結(jié)合可引發(fā)受體異源二聚化并激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(STAT6)，誘導(dǎo)MHC類(lèi)抗原及免疫球蛋白受體基因等表達(dá)5，從而產(chǎn)生更多的IgE. IL4還促進(jìn)EOS浸潤(rùn)和血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM1)、 P選擇素等多種黏附分子的表達(dá)6. 因此IL4在哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用. IL5是一種作用于EOS的血源性生長(zhǎng)因子，主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，哮喘時(shí)IL5mRNA可增加300倍. IL5可活化EOS，同時(shí)也是EOS的趨化劑，上調(diào)其黏附分子(如CD11b)的表達(dá)，促進(jìn)EOS同內(nèi)皮細(xì)胞黏附，此作用可能與慢性變態(tài)反應(yīng)性疾病中組織損傷有關(guān)7.  

22、0; 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：椒目油能顯著降低哮喘豚鼠血清中IL4,5的含量，其降低IL4含量的效果與地塞米松相仿，但降低IL5含量的效果強(qiáng)于地塞米松；同時(shí)椒目油能夠顯著降低哮喘豚鼠AHR，其藥效與地塞米松降低豚鼠AHR的效果相仿. 而在我們另外的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)椒目油還有抑制單核細(xì)胞及EOS的作用(資料本文未顯示)，說(shuō)明椒目油具有抑制炎癥細(xì)胞和前炎性細(xì)胞因子釋放的抗炎作用，進(jìn)而降低AHR，達(dá)到治療哮喘的目的.    中國(guó)特有的中西醫(yī)結(jié)合療法針對(duì)哮喘“急則治標(biāo)(西醫(yī)解痙，中醫(yī)降氣)，緩則治本(補(bǔ)腎固本)”的方法，使哮喘患者獲得較長(zhǎng)時(shí)間的緩解期8. 中藥椒目為蕓香科植物花

23、椒干燥成熟的種子，該藥味苦、辛、性寒，具有行水消腫之功效. 有許多關(guān)于椒目治療哮喘的報(bào)道9-10，但大多數(shù)是從臨床效果來(lái)說(shuō)明，而缺乏藥理學(xué)基礎(chǔ). 我們從抑制炎性因子和降低AHR出發(fā)研究椒目油治療哮喘的機(jī)制，從而為椒目治療哮喘提供藥理學(xué)基礎(chǔ). 另外椒目油富含Ca, Mg, Fe, Zn, Sr和Mn等人體必須的礦物質(zhì)，同時(shí)還具有適用范圍廣、起效時(shí)間短、維持時(shí)間長(zhǎng)、副作用少、來(lái)源廣泛及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此做為一種新型哮喘治療藥物，椒目油具備良好的開(kāi)發(fā)前景.    【參考文獻(xiàn)】    1 劉春濤. 氣道炎癥性疾病M. 北京： 人民衛(wèi)生出版社

24、，2004:506-507.    2 王長(zhǎng)征，郭先健，王順朝. 豚鼠哮喘模型的氣道反應(yīng)性測(cè)定J. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994,16(4):277-278.    3 Rudge EU, Cutler AJ, Pritchard NR, et al. Interleukin4 reduces expression of inhibitory receptor chain is constituted by two independent binding clustersJ. J Nol Biol, 2002,315(3):399.    4  Sudowe S, Arps V, Vogel T, et al. The role of interleukin4 in the regulation of sequential i