負(fù)載人HUVECs抗原的DC疫苗誘導(dǎo)小鼠對(duì)宮頸癌U14的特異性免疫反應(yīng)

1、負(fù)載人HUVECs抗原的DC疫苗誘導(dǎo)小鼠對(duì)宮頸癌U14的特異性免疫反應(yīng)                     作者：趙軍, 翟景明, 路靜, 楊洪艷, 黃幼田, 李珊, 董子明, 張曦  【摘要】  目的: 探討負(fù)載人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）抗原的DC疫苗誘導(dǎo)小鼠對(duì)宮頸癌U14的特異性免疫反應(yīng)。方法: 原代培養(yǎng)和鑒定人HUVECs, 制備抗原, 負(fù)載樹

2、突狀細(xì)胞（DC）, 免疫小鼠, 免疫結(jié)束后1周小鼠皮下注射小鼠宮頸癌U14細(xì)胞, 觀察腫瘤生長(zhǎng)大小、 檢測(cè)免疫后小鼠脾細(xì)胞體外CTL效應(yīng)、 表面CD3+CD8+百分率和血清抗體滴度, 通過細(xì)胞免疫組化和Western blot血清特異性反應(yīng)分析。結(jié)果: 經(jīng)免疫組化鑒定成功培養(yǎng)出純度高的HUVECs, 抗原負(fù)載DC并注射BALB/c小鼠后, PBS組腫瘤生長(zhǎng)最快, DC組和HUVECDC組腫瘤也有生長(zhǎng), 但生長(zhǎng)較慢, 在2周后HUVECDC組腫瘤消失, 3周后DC組腫瘤消失。小鼠脾細(xì)胞體外CTL結(jié)果顯示HUVECDC組有明顯的特異性殺傷HUVEC的作用。CD3+CD8+百分比提示HUVECDC組

3、細(xì)胞毒性T細(xì)胞比例較其他兩組高。小鼠血清抗體滴度示有抗體產(chǎn)生, 免疫組化檢測(cè)示組與HUVEC有特異性抗原抗體反應(yīng), Western blot顯示在相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）130 000和220 000處有特異性條帶。結(jié)論: 負(fù)載人HUVECs抗原的DC疫苗和DC疫苗對(duì)小鼠宮頸癌U14有抑制作用, HUVECDC疫苗誘導(dǎo)了小鼠的細(xì)胞和體液免疫, 并誘導(dǎo)了針對(duì)HUVECs細(xì)胞中的某些抗原的應(yīng)答, 這些抗原可能是整合素和VEGFR2。 【關(guān)鍵詞】  人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞抗原; 樹突狀細(xì)胞; 小鼠宮頸癌; 特異性免疫反應(yīng)AbstractAIM: To explore the specific imm

4、unity of dendritic cell (DC) vaccine loading human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) antigen.against U14 cervical cancer of mice. METHODS:  Primary HUVECs were cultured,  identified and made into antigen. The BALB/c mice were immuned with DCs loading HUVEC antigen 4 times a week. One

5、 week after last vaccination,  U14 cervical cancer cells were injected subcutaneously into the mice. The tumor size,  CTL response of spleen lymphocytes in vitro,  the percentage of CD3+CD8+ surface markers of spleen lymphocytes,  and the titer of serum antibody were detected. Th

6、e specific immunity was examined by immunocytochemistry and Western blot. RESULTS:  HUVECs with high purity were successfully cultured and by identified by immunocytochemistry and RTPCR. After the vaccine was injected into mice,  the tumors of mice in PBS group grew faster than the those i

7、n other groups. The tumors of mice in HUVECDC groups grew slowly and disappeared after 2 weeks and The tumors of mice in DC group disappeared after 3 weeks. The CTL response of spleen lymphocytes in vitro showed that HUVECDCT cells could kill HUVEC cells. The percentage of CD3+CD8+ surface markers o

8、f spleen lymphocytes in HUVECDC group was higher than that in other groups. The titer of serum antibody was 1800. immunocytochemistry analysis indicated HUVECDC group had specific antigenantibody reaction to HUVECs through and Western blot analysis revealed there were specific bands at 130 KDa and 2

9、20 KDa. CONCLUSION:  HUVECDC vaccine and DC vaccine can inhibit the tumor growth of U14 cervical cancer of mice. The special cellular and humoral immunity are induced by HUVECDC vaccine. Furthermore,  some antigens in HUVECs maybe have special immune reaction with integrin and VEGFR2.Keywo

10、rdshuman umbilical vein endothelial cell antigen;  dendritic cell;  cervical cancer of mouse;  specific immunity response腫瘤血管的生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必要條件。在成年人, 血管生成處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài), 而在缺氧的情況下, 腫瘤細(xì)胞可以通過分泌內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子打破此狀態(tài)形成新血管, 腫瘤新生血管與靜止期的正常血管的區(qū)別就在于其表達(dá)血管生成相關(guān)抗原1, 雖然, 靶向自身血管生成的單克隆抗體(mAb)和人工合成分子在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中抑制了腫瘤的生長(zhǎng), 但由

11、于其半衰期短, 作用單一, 往往需要聯(lián)合和長(zhǎng)期, 而且特異性高的抗原分子仍有待分離。2000年, Wei等2運(yùn)用異種血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗進(jìn)行抗腫瘤血管治療取得了很好的療效, 但Yoneyama等3研究發(fā)現(xiàn)在治療過程中有的效果則不是很理想, 為了增強(qiáng)疫苗的效果, 我們假設(shè)用負(fù)載異種血管內(nèi)皮細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell,  HUVEC）抗原的樹突狀細(xì)胞（dendritic cell,  DC）免疫小鼠, 觀察其誘導(dǎo)小鼠對(duì)宮頸癌U14的特異性免疫反應(yīng), 并初步研究其機(jī)制。1  材料和方法1.1 

12、材料 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM培養(yǎng)基）購自ScienCell公司,  DMEM購自Gibco公司, 胎牛血清購自天津TBD公司, 胰蛋白酶購自Amresco公司, 兔抗人vWF抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品, 兔抗人CD144抗體為Cell Signaling公司產(chǎn)品, 即用型DAB免疫組化試劑盒、 濃縮型DAB試劑盒, 牛血清白蛋白、明膠, 考馬斯亮藍(lán)G250均購自Sigma公司, TRIzol購自Invitrogen公司, 小鼠GMCSF購自杭州隆基公司, 小鼠IL4 、 IL2購自Peprotech公司, CCK8 kit購自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)所, HRPIgG購

13、自武漢博士得公司, FITCCD3和PECD8單克隆抗體（mAb）購自Biolegend公司, BALB/c小鼠30只（68周齡, 體質(zhì)量1618 g, 購自鄭州大學(xué)動(dòng)物中心, 許可證號(hào): SCXK豫20050001）, 小鼠宮頸癌U14瘤株購自醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。1.2  方法1.2.1  原代人HUVECs分離培養(yǎng) 健康孕婦產(chǎn)后立即取新生兒臍帶置入生理鹽水中, 長(zhǎng)約1520 cm, 4 h之內(nèi)行HUVECs分離培養(yǎng)。用含青、鏈霉素生理鹽水沖洗臍靜脈至沖洗液呈無色清亮?xí)r, 向臍靜脈內(nèi)灌注2.5 g/L胰蛋白酶, 置細(xì)胞培養(yǎng)箱中1015 min后收集消化液, 1

14、 200 r/min, 離心8 min, 細(xì)胞重懸于ECM中, 接種于明膠包被的培養(yǎng)瓶中, 置37、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后棄培養(yǎng)液, PBS液輕洗1次, 除去紅細(xì)胞及未貼壁細(xì)胞, 加ECM繼續(xù)培養(yǎng), 23 d 換液1次, 23 d可長(zhǎng)成單層細(xì)胞。生長(zhǎng)匯合至80%后, 用2.5 g/L胰蛋白酶消化, 12傳代繼續(xù)培養(yǎng)23 d換液1次。1.2.2  免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)vWF、CD144鑒定原代人HUVECs  將人HUVECs細(xì)胞接種96孔板, 過夜培養(yǎng)。40 g/L多聚甲醛固定30 min。vWF組需加2.5g/L Tritonx100透膜。然后加H2O

15、2(300 mg/L H2O2甲醇=150), 室溫30 min, BSA封閉30 min。吸去BSA, 加兔抗人vWF和CD144抗體, 蓋底即可。4過夜。第2天, 吸去一抗, 加生物素化抗羊抗兔IgG二抗, 室溫20 min,  加SABC室溫20 min, 加DAB 30 min, 顯微鏡觀察染色程度。蘇木精染色12 min, 用相差倒置顯微鏡拍照, 再用Biosens Digital Imaging System灰度掃描儀掃描以檢測(cè)vWF和CD144抗原水平。1.2.3  原代人HUVECs抗原的制備 收集培養(yǎng)的人HUVECs, 調(diào)整密度1×10

16、10/L, PBS重懸, 液氮冷凍5 min后立即放入37水浴中5 min, 反復(fù)4次。4, 10 000 g, 離心30 min, 收集上清。按Bradford蛋白定量法, 收集的上清取50 L與考馬斯亮藍(lán)950 L混勻, 靜置3 min, 用UNICOUV2102PCS系統(tǒng)分別檢測(cè)抗原的吸光度（A）, 然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行濃度。1.2.4  小鼠骨髓DCs的培養(yǎng)和鑒定 參照方法4, 略有改動(dòng)。拉頸處死BALB/c小鼠, 無菌剝離股骨和脛骨。用注射器將骨髓沖出, 離心收集骨髓細(xì)胞, 加入預(yù)溫的TrisNH4CL裂解紅細(xì)胞, 然后用含100 mg/L FCS的RPMI164

17、0完全培養(yǎng)液（含rmGMCSF（10  g/L）和rmIL4（5 g/L）調(diào)整細(xì)胞密度為3×109/L, 以1 mL/孔加入接種于24孔培養(yǎng)板。置37、  50 mg/L CO2的孵箱中培養(yǎng)48 h后棄去懸浮細(xì)胞, 隔日半量換液, 每日用相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)變化。收集培養(yǎng)至第7天的DC, 調(diào)細(xì)胞密度為2×108/L, 分別加入1  L  FITC標(biāo)記的CD86和PE標(biāo)記的CD11a抗小鼠mAb。設(shè)立空白對(duì)照, 4避光反應(yīng)30 min。洗滌后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1.2.5  負(fù)載人HUVECs抗原的DCs疫苗免疫小鼠&

18、#160;DCs培養(yǎng)第3天, 加入人HUVECs抗原100 mg/L, 繼續(xù)培養(yǎng)至第6天, 加入脂多糖, 隔日半量換液, 第8天, 用胰酶消化法收集DCs, PBS洗2次, 重懸調(diào)密度5×109/L, 此為HUVECDC疫苗, 直接BALB/c小鼠皮下注射。BALB/c小鼠分為3組: PBS組, DC組, HUVECDC組。每組10只。共免疫4次, 每周1次, 最后1次免疫后7 d, 皮下注射小鼠宮頸癌U14細(xì)胞1.5×106/只, 同時(shí), 乙醚麻醉各組小鼠摘眼球取全血, 室溫放置1 h, 4過夜, 收集上清, 4保存作為免疫小鼠血清。觸及腫瘤后每3 d測(cè)量腫瘤大小, 稱量

19、小鼠重量, 游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小, 腫瘤體積V (mm3) = 0. 5ab2, a為長(zhǎng)徑(mm), b為短徑(mm) 。待1只小鼠死亡后全部處死小鼠取出腫瘤, 稱重, 測(cè)其體積, 觀察疫苗對(duì)小鼠U14細(xì)胞皮下腫瘤的抑制作用。1.2.6  誘導(dǎo)小鼠對(duì)UI4細(xì)胞的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答 （1）免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞分離:  拉頸處死各組小鼠后無菌取脾臟, 研磨成單細(xì)胞, 經(jīng)孔徑200 m尼龍篩過濾, 用Dhanks液2.5 mL重懸, 沿管壁輕輕加至4 mL小鼠淋巴細(xì)胞分離液上, 1 700 r/min, 離心15 min, 取白膜層, 用TrisNH4Cl裂解紅細(xì)胞, 經(jīng)

20、尼龍毛柱洗脫后用含100 mg/L小牛血清RPMI1640重懸。(2)荷瘤后CD3和CD8表達(dá): 各組脾淋巴細(xì)胞用100 L 100 mg/L小牛血清RPMI1640重懸, 加FITC標(biāo)記的CD3mAb 1L和PE標(biāo)記的CD8mAb 2.5L, 4避光反應(yīng)30 min, 100 mg/L小牛血清的PBS洗2次, 1 mL重懸上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。(3)ELISA檢測(cè)抗體滴度:  取96孔可拆式酶標(biāo)板, 將HUVEC總蛋白用包被緩沖液稀釋(3 mg/L), 加入板孔中(100 L/孔), 4包被過夜。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔, 棄包被液, 加封閉液, 37封閉2 h。棄封閉液, 用洗滌液洗6次, 每

21、次2 min。加入稀釋液稀釋的150, 1100, 1200, 1400, 1800,  11 600, 13 200和16 400抗血清（免疫小鼠血清）, 并設(shè)陰性對(duì)照組（只加PBS）, 40 L/孔, 37孵育1  h。棄去抗血清, 用洗滌液洗6次, 每次2 min。加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗, 稀釋液稀釋（110 000）, 50 L/孔, 37孵育30 min。棄去二抗, 用洗滌液洗6次, 每次2 min。加入底物顯色液(TMB: A+B混勻), 100 L/孔, 37, 顯色1020 min。加入終止液, 50 L/孔, 終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀讀數(shù), 測(cè)定每孔A

22、450值?？瞻讓?duì)照調(diào)零, P/N2.1, 判為陽性(P: 陽性抗原孔A值, N: 陰性抗原孔A值)。1.2.7  誘導(dǎo)小鼠對(duì)UI4腫瘤血管的特異性免疫應(yīng)答 （1）脾淋巴細(xì)胞CTL實(shí)驗(yàn): 各組脾淋巴細(xì)胞用100 L 100 mg/L小牛血清RPMI1640重懸, HUVECs常規(guī)培養(yǎng), 胰酶消化后作為靶細(xì)胞。以脾淋巴細(xì)胞: 靶細(xì)胞=501和251將細(xì)胞種于96孔板, DC和PBS組作對(duì)照, 37, 50 mg/L CO2共培養(yǎng)24 h, 在最后4 h, 加入CCK810L/孔, 用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450值。(2)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè):  將HUVEC細(xì)胞接種于96孔板上,

23、培養(yǎng)過夜, 40 g/L多聚甲醛固定30 min。然后加H2O2(300 mL/L的H2O2甲醇=1/50), 室溫30 min, BSA封閉30 min。吸去BSA, 加入免疫小鼠血清（110）為一抗。4過夜。第2天, 吸去一抗, 加羊抗小鼠HRPIgG二抗, 室溫20 min, 加DAB 30 min, 顯微鏡觀察染色程度。用相差倒置顯微鏡拍照, 再用Biosens Digital Imaging System灰度掃描儀掃描分析。(3)Western blot檢測(cè)VEGFR2和整合素: 提取HUVEC細(xì)胞總蛋白, 按考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)總蛋白含量, -80儲(chǔ)存?zhèn)溆?。SDS聚丙烯酰胺凝

24、膠電泳: 制備100 g/L分離膠和50 g/L的濃縮膠, 取待測(cè)的樣品各50 g及蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)上樣電泳。采用半干式電轉(zhuǎn)移法。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫封閉（50 g/L BSA）3 h后分別加入免疫小鼠血清作為一抗(125), 4過夜。TBST洗膜3次 , 加入羊抗小鼠HRPIgG二抗, 室溫孵育1 h。TBST 洗膜后, ECL顯色, 暗室壓片成像。GelDoc紫外凝膠成像分析系統(tǒng)計(jì)算各條帶的灰度值(Quantity One 1D Analysis Software)。1.2.8  安全性觀察 實(shí)驗(yàn)過程中, 每周稱小鼠體重, 觀察小鼠皮毛色澤, 食欲、 糞便及活

25、動(dòng)變化。小鼠處死后觀察肝、肺、腎等臟器變化。1.2.9  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包, 所有資料均為計(jì)數(shù)資料, vWF、 CD144、CD31免疫組化和抗原濃度數(shù)據(jù)分析用x±s表示, 分別采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析, 以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2  結(jié)果 2.1  原代人HUVECs的形態(tài)學(xué)觀察 多呈小三角形、短梭形, 23 d匯合成單層, 細(xì)胞邊界清楚, 胞質(zhì)豐富, 胞核呈圓形或橢圓形, 偶見雙核, 密集處呈鋪路石狀鑲嵌排列, 稀疏處為短梭形。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)飽滿, 伸展呈長(zhǎng)梭形, 漩渦狀排列生

26、長(zhǎng)（圖1）, 細(xì)胞貼壁牢固; 細(xì)胞傳至第5代出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)。2.2  人HUVECs標(biāo)志vWF、CD144的表達(dá) DAB染色以胞質(zhì)著棕黃色顆粒為主的為vWF陽性細(xì)胞（圖2A）; DAB染色以胞膜著棕黃色顆粒為主的為CD144（圖2B）。1         2.3  小鼠骨髓源DCs的形態(tài)  培養(yǎng)前48 h盡量少看細(xì)胞, 第3天, 可見部分細(xì)胞較種板時(shí)變大, 部分細(xì)胞貼壁, 呈長(zhǎng)梭形（圖3A）, 第5天, 幾乎80%細(xì)胞貼壁, 有的細(xì)胞可見34個(gè)突起, 第7天, 部分細(xì)胞變圓,

27、 但仍可見較多細(xì)胞貼壁, 可見集落形成, 此為成熟的DCs（圖3B）。2.4  小鼠骨髓源DCs表型的鑒定 FCM檢測(cè)表明, 培養(yǎng)成熟的小鼠骨髓源DCs表達(dá)CD86和CD11a, 陽性率分別為65.77%、 37.51%。2.5  免疫小鼠后腫瘤生長(zhǎng)情況 HUVECDC疫苗免疫小鼠4次后7 d皮下接種小鼠宮頸癌U14細(xì)胞1.5×106/只, 分別在第5天可以在PBS組、DC組觸及腫瘤, 腫瘤綠豆大小, 而HUVECDC疫苗組可觸及小米粒大小腫塊, 第8天, PBS組肉眼可看到腫瘤, 而DC組和腫瘤HUVECDC疫苗組無明顯變化, 2周后, PB

28、S組腫瘤體積3.375±0.335 cm3, 而HUVECDC疫苗組腫塊消失, DC組腫瘤也逐漸縮小腫瘤體積0.06075±0.268 cm3, 于3周后消失。PBS組瘤體逐漸增大, 多在50 d左右破潰, 小鼠體重變化不大, 但極度消瘦, 生存期約(57.33±2.06) d。2.6  小鼠對(duì)UI4細(xì)胞的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答2.6.1  免疫小鼠荷瘤后脾CD3和CD8T淋巴細(xì)胞亞群變化  接種腫瘤后第1只小鼠死亡后, 各組取1只小鼠處死后取脾臟, 分離脾臟淋巴細(xì)胞, 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分率, 結(jié)果接種腫瘤后H

29、UVECDC疫苗組和DC疫苗組CD3+和CD8+較PBS組明顯升高, 以HUVECDC疫苗組最高(P<0.05), CD3+CD8+雙陽性細(xì)胞百分率分別是PBS組(30.03±0.91)%, DC組(33.27±5.50)%, HUVECDC組(36.77±0.37)%。2.6.2  ELISA檢測(cè)抗體滴度 HUVECDC組免疫小鼠血清經(jīng)過間接ELISA法測(cè)定滴度約1800, 為陽性, DC組和PBS組為陰性。2.7  誘導(dǎo)小鼠對(duì)UI4腫瘤血管的特異性免疫應(yīng)答2.7.1  脾淋巴細(xì)胞CTL實(shí)驗(yàn) 將各組脾淋巴細(xì)

30、胞加入CCK8 10L/孔, 用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450值, 重復(fù)3次, 取平均值。結(jié)果顯示脾淋巴細(xì)胞: 靶細(xì)胞(HUVECs)=501和251的兩組細(xì)胞的HUVECDC疫苗組明顯有殺傷HUVEC效應(yīng)（P<0.05, 圖4）, 而PBS組和DC組則無殺傷HUVEC效應(yīng)（P>0.05）。2.7.2  免疫小鼠血清檢測(cè) 進(jìn)行細(xì)胞組化和Western blot檢測(cè)后發(fā)現(xiàn), HUVECDC組免疫血清與HUVEC細(xì)胞呈陽性反應(yīng), 在Mr 220 000和130 000處可見陽性條帶, 而DC組和PBS組則呈陰性反應(yīng), 且沒有條帶（圖5）。2.8  安全性觀察 

31、;實(shí)驗(yàn)過程中, 各組小鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）, 實(shí)驗(yàn)后期, PBS組小鼠出現(xiàn)皮毛干燥、雜亂、活動(dòng)減少, 食欲、 糞便無明顯變化。HUVECDC組和DC組小鼠皮毛、食欲、糞便及活動(dòng)無明顯異常。斷尾取血后, 愈合好, 無明顯的出血傾向。處死后觀察肝、肺、腎、脾等臟器無明顯變化。因此, 本疫苗具有良好的安全性。3 討論    腫瘤血管生成是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過程。現(xiàn)在認(rèn)為腫瘤血管形成是促血管生成因子和血管生成抑制因子的平衡被打破的結(jié)果。腫瘤血管生成是多因子參與的過程, 在腫瘤的不同階段發(fā)揮主導(dǎo)作用的調(diào)控因素不同1, 因此, 單純阻斷血管生成的某個(gè)環(huán)節(jié)所致

32、的抑瘤作用必定有限。而運(yùn)用整個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞做抗原, 則可避免單一抗血管的方法的缺陷, 起到更好的治療效果4-6。打破腫瘤血管生成的免疫耐受是抗腫瘤血管的主要治療方法之一, 但治療過程中仍然有的病例效果不理想, 改變抗原負(fù)載形式可能提高腫瘤治療效果。    機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受的主要原因是腫瘤細(xì)胞抗原性弱、不表達(dá)MHC類分子、共刺激分子和淋巴細(xì)胞黏附所需的分子, 因此T細(xì)胞無法識(shí)別和激活7。DC則在主動(dòng)攝取腫瘤抗原后, 提供和增強(qiáng)T細(xì)胞激活的第一、二信號(hào), 使T細(xì)胞有效的活化, 其中通過MHCI類分子途徑主要是激活CD8+T細(xì)胞形成CTL, 而MHC類分子途徑

33、主要是激活CD4+ T形成Th1細(xì)胞8, 因此利用DC可成功的打破機(jī)體免疫耐受, 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn), 單純DC免疫組在接受腫瘤細(xì)胞注射后, 激活CD8+T細(xì)胞, 同樣也抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。    小鼠宮頸癌U14是可移植的未分化鱗狀細(xì)胞癌, 是實(shí)體瘤, 可以腹腔和皮下接種傳代, 惡性程度高, 目前已廣泛用于抗腫瘤藥物篩選、 腫瘤免疫等領(lǐng)域的研究。    實(shí)驗(yàn)結(jié)果從宏觀上看, HUVECDC組和DC腫瘤生長(zhǎng)較慢, 而且逐漸消失, 可以稱為“tumor free”3, 從脾CD3CD8T淋巴細(xì)胞亞群變化、 體外脾細(xì)胞CTL、 免疫血清組化和Western blot檢測(cè)結(jié)果和Wei等2的結(jié)果相一致, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中, 小鼠無明顯出血傾向, 疫苗對(duì)小鼠皮毛、 食欲、 糞便及活動(dòng)無明