TFu對肝門部膽管癌細胞系FRH

1、TFu對肝門部膽管癌細胞系FRH          【摘要】目的：探討N3鄰甲苯甲?；蜞奏ぃ∟3toluylFlulorouractil TFu）對FRH0201細胞的生物學(xué)效應(yīng)及其作用機制，為膽管癌臨床化療提供參考。方法：光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡觀察FRH0201細胞在TFu作用后形態(tài)學(xué)變化；集落形成實驗檢測TFu對FRH0201細胞的增殖抑制作用；瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA Ladder觀察細胞的凋亡；流式細胞術(shù)檢測細胞周期及細胞凋亡并與5Fu進行比較；MTT試驗比較TFu與5Fu等常用化療藥物對FR

2、H0201細胞抑制率。結(jié)果：TFu能體外抑制FRH0201細胞的增殖，其作用在0.0164mmol/L范圍內(nèi)具有濃度依賴性及時間依賴性，同濃度比較抑制率高于5Fu；流式細胞儀檢測可見隨作用時間延長，TFu及5Fu組G1細胞期增多，S期細胞減少，細胞增殖被阻滯在G1期；細胞凋亡檢測可見，隨作用時間延長，TFu及5Fu組較對照組細胞凋亡率增加，同時相TFu組凋亡率高于5Fu組；化療敏感性比較，TFu抑制FRH0201細胞增殖作用不及阿霉素和順鉑，但明顯優(yōu)于5Fu及泰素，聯(lián)合用藥：阿霉素、順鉑和TFu聯(lián)合對FRH0201細胞抑制率最高，達79.02%，優(yōu)于阿霉素、順鉑、5Fu聯(lián)合。結(jié)論：TFu可明顯

3、抑制膽管癌細胞株FRH0201細胞的增殖，該抑制作用可能通過阻滯細胞周期并進一步誘導(dǎo)細胞凋亡機制發(fā)生，同摩爾濃度TFu較5Fu對FRH0201細胞抑制作用強，TFu可作為膽管癌聯(lián)合化療的新藥。    【關(guān)鍵詞】膽管腫瘤N3鄰甲苯甲?；蜞奏し遴奏ぜ毎蛲黾毎芷?#160;  The effect of TFu on the apoptosis and proliferation of FRH0201 cholangiocarcinoma cell line   【ABSTRACT】Objective:To investigate the

4、effect of TFu on FRH0201 cell and to test new drugs for the chemotherapy of cholangiocarcinoma.Methods:Morphological changes were observed by light microscopy and fluorescence microscopy.The effect of TFu on FRH0201 cell was examined by clone formation.Cell cycle and apoptosis were examined by flowc

5、ytometric analysis.DNA ladder was used to detect apoptosis.To compare the drug susceptibility of TFu with 5Fu and several other common drugs by MTT colorimetric assay.Results:TFu significantly inhibited the proliferation and clone formation of FRH0201 cell line within concentration of 0.0164mmol/L.T

6、he inhibition ratio was dependent on ascending concentration and time,and that is higher than 5Fu with the same concentration.The morphological character of apoptosis was observed.Flow cytometric analysis indicated that TFu induced a G1 phase arrest and apoptosis more than 5Fu.ADM,DDP and TFu were t

7、he sensitive drugs to FRH0201 cel line,and the combination of them can reach the highest inhibition ratio.Conclusion:These results suggests that TFu can more significantly inhibited the proliferation of FRH0201 cell line than 5Fu.The mechanism may be related to the cell cycle arrest in association w

8、ith apoptosis,which may provide a new approach for treating cholangiocarcinoma.   【KEY WORDS】BiliaryTFuFluorouracilApoptosisCell cycle   肝門部膽管癌是一種起病隱匿，根治困難，預(yù)后很差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，目前認為應(yīng)采取包括手術(shù)、放療、化療介入等的綜合治療措施1，其中化療占非常重要的地位。但膽管癌對常規(guī)化療藥物敏感性差，化療效果不理想，而且存在明顯的副作用，因此很多學(xué)者都在尋找新的化療藥來提高膽管癌療效。N3鄰甲苯甲?；?/p>

9、尿嘧啶（N3otoluylFlulorouracil,TFu)是在5Fu基礎(chǔ)上研制的一種5Fu衍生物類抗癌藥，初步研究表明，TFu可明顯抑制小鼠S180實體瘤及小鼠肝癌實體腫瘤增殖，尚未對膽管癌進行研究，本實驗旨在通過觀察TFu對FRH0201肝門部膽管癌細胞生物學(xué)效應(yīng)，并與5Fu等多種化療藥物比較，探討其作用機制，為膽管癌化療提供參考。    1  材料和方法   1.1  材料   1.2  方法   1.3  統(tǒng)計學(xué)方法  流式細胞術(shù)結(jié)果采用列聯(lián)表資

10、料的2檢驗，MTT實驗結(jié)果采用t檢驗及方差分析。   2  結(jié)  果   2.1  形態(tài)學(xué)變化  當(dāng)TFu濃度高于4mmol/L時細胞培養(yǎng)24h后逐漸變圓，不再貼壁，逐漸死亡，臺盼蘭染色無活細胞。40.016mmol/L組細胞隨著藥物濃度降低細胞生長密度逐漸升高，細胞逐漸伸展，死亡細胞逐漸減少。            Giemsa染色：對照組細胞貼壁伸展良好，細胞透光好，核仁清晰；藥物作用組細胞皺縮，胞膜出芽形成凋亡

11、小體，核固縮、濃染，核染色質(zhì)邊集，核仁不清。   吖啶橙熒光染色見藥物作用后細胞變小變圓，部分細胞核染色黃綠色，核碎裂、無核仁，碎裂的核由膜包裹著突起于細胞表面呈黃綠色，并見凋亡小體。見圖1。 圖1  吖啶橙染色示TFu作用后FRH0201細胞形態(tài)學(xué)變化   上：對照組（未加藥）細胞伸展良好，胞漿均質(zhì)，核仁清晰   下：實驗組（TFu）組細胞變小變圓，細胞皺縮，細胞核濃染成黃綠色，核仁不清   2.2  集落形成實驗  FRH0201細胞生長旺盛，培養(yǎng)至12d肉眼可見克隆團，對照組克隆

12、形成率為(35.33±4.16)%，0.004mmol/L組克隆形成率為（16.67±2.31）%，0.016mmol/L組克隆形成率為（4.67±4.16）%，大于此濃度組無克隆形成。   2.3  DNA Ladder測定結(jié)果  不同濃度TFu作用后，隨濃度升高，出現(xiàn)的DNA Ladder條帶越明顯，各濃度組均出現(xiàn)典型的凋亡ladder條帶。見圖2。   2.4  流式細胞術(shù)結(jié)果  細胞周期檢測可見，隨著作用時間延長，用藥組相對于對照組G1期細胞增加，S期細胞減少，細胞生長被阻滯在

13、G1期，同時相TFu組G1細胞比例高于5Fu組。細胞凋亡檢測可見，隨作用時間延長各組細胞早期凋亡率升高，TFu、5Fu組與對照組以及TFu組與5Fu組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01,P0.05）。各時相比較，TFu與5Fu組24h與48h凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），24h與72h，48h與72h凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。見表1，2。 圖2  電泳法檢測FRH0201細胞DNA Ladder M:Marker;C1C5:4、1、0.25、0.063、0.016mmol/L TFu作用72h 對照：未加藥細胞 表1  各組細胞不同時相細胞周期比例分析 表2&

14、#160; 各組細胞不同時相凋亡率比較   2.5  MTT實驗結(jié)果  在0.0164mmol/L范圍內(nèi)，各濃度組TFu及5Fu對FRH0201細胞增殖均有抑制作用，并且具有濃度、劑量依賴性（P均0.01），作用時間相同時，隨藥物濃度升高，抑制率升高，兩組在72h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），TFu組抑制率高于5Fu組；相同濃度下兩者比較，隨作用時間延長，TFu組與5Fu組抑制率均升高，濃度為4mmol/L時，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，當(dāng)濃度分別為1、0.25、0.063、0.016mmol/L時，兩者抑制率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），TFu組抑制

15、作用高于5Fu組。TFu、5Fu的IC50值分別為0.137、0.188mmol/L。見表3。   2.6  化療敏感性比較  TFu能有效抑制FRH0201細胞的增殖，抑制率為55.08%，抑制作用優(yōu)于5Fu（43.86%）及泰素（30.91%），不及阿霉素（79.00%）和順鉑（69.27%）。見圖3。聯(lián)合用藥：TFu與阿霉素聯(lián)合后抑制率由50.29%提高到65.87%，接近阿霉素與順鉑聯(lián)合（66.52%），高于阿霉素與5Fu聯(lián)合（58.14%）；阿霉素、順鉑與TFu聯(lián)合后抑制率可由原來的66.52%提高到79.02%，高于和5Fu聯(lián)合（68.51%

16、）。見圖4。 表3  不同時間不同濃度TFu及5Fu對FRH0201細胞抑制率圖4  TFu不同聯(lián)合方案對FRH0201細胞抑制率比較   3  討  論   TFu是在5Fu基礎(chǔ)上研制的新型抗癌藥，研究表明TFu能體外、體內(nèi)抑制小鼠S180實體瘤及小鼠肝癌實體腫瘤增殖。本實驗發(fā)現(xiàn)TFu在0.0164mmol/L范圍內(nèi)能有效抑制膽管癌細胞增殖，作用72h后細胞數(shù)明顯減少并出現(xiàn)細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，細胞克隆形成明顯受到抑制，其抑制作用具有時間、劑量依賴性。當(dāng)作用時間一定時，隨著藥物濃度的增加，TFu對膽管癌細胞的生長抑

17、制率逐漸升高，當(dāng)藥物濃度一定時，隨作用時間延長，抑制率也明顯升高，不同濃度不同作用時間TFu與5Fu組之間的抑制率差異有顯著性。隨著TFu濃度的提高，其對膽管癌細胞生長的抑制作用和促進凋亡作用變得更為明顯，而且發(fā)生作用的時間更短。   本實驗通過流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)TFu作用24h后即出現(xiàn)G1期細胞比例增加，S期細胞比例減少，細胞生長被阻滯在G1期，隨作用時間延長該阻滯作用變明顯，且優(yōu)于5Fu。細胞凋亡檢測，作用24h后，TFu、5Fu組與對照組間凋亡率差異尚不明顯，48h后開始變明顯，至72h凋亡率明顯升高。細胞凋亡遲于細胞周期阻滯出現(xiàn)，推測這種細胞周期的阻滯抑制了細胞生長，從

18、而最終引起細胞凋亡。TFu促FRH0201細胞凋亡作用在一定范圍內(nèi)隨藥物濃度升高而增大，DNA Ladder檢測可見，隨TFu濃度升高Ladder條帶越明顯。研究發(fā)現(xiàn)，有一種細胞凋亡特異性的發(fā)生在細胞周期的不同時相，即細胞先被阻滯在細胞周期某一時相，然后發(fā)生細胞凋亡6，很多藥物通過這種機制誘導(dǎo)細胞凋亡7。我們的實驗結(jié)果，可以從側(cè)面進一步驗證了他們的發(fā)現(xiàn)，同時這一發(fā)現(xiàn)也說明了TFu在作用于膽管癌細胞時的可能的作用機制，其具體的作用機制尚有待于進一步的研究。   目前臨床上針對膽管化療的藥物較敏感的有阿霉素、順鉑、5Fu聯(lián)合應(yīng)用，本實驗發(fā)現(xiàn)阿霉素、順鉑與TFu聯(lián)合后可提高的聯(lián)合用藥抑制率，優(yōu)于與5Fu聯(lián)合，這可為臨床制定膽管癌化療方案提供參考。   TFu與5Fu相比可更有效抑制FRH0201細胞的增殖并能促進細胞的凋亡，其發(fā)揮作用的機制可能是通過阻滯細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡途徑發(fā)生實現(xiàn)的；TFu有望作為臨床膽管癌聯(lián)合化療的新的參考用藥。但該實驗只是對膽管癌一種細胞株的體外實驗研究，缺乏多種細胞株比較及體內(nèi)實驗證據(jù)，其實際臨床應(yīng)用價值有待于進一步研究。    參  考  文  獻   1Mc Masters KM,Tuttle TM,leach SD,e