在低氮脅迫下水稻劍葉基因轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的變化

1、在低氮脅迫下水稻劍葉基因轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的變化 摘要:對(duì)低氮脅迫的轉(zhuǎn)錄因子基因反應(yīng)的研究,為提高氮肥在水稻 的吸收和利用效率提供分子基礎(chǔ)。 安捷倫水稻基因組芯片被用來研究 了在低氮脅迫下兩個(gè)水稻品種(SN 196和 Toyonishhiki 轉(zhuǎn)錄因 子基因表達(dá)的變化與葉綠素含量含量的變化。 結(jié)果表明, 在低氮脅迫 下超綠水稻品種 SN196劍葉共有 53個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因(35個(gè)下調(diào), 18上調(diào)至基因轉(zhuǎn)錄水平上,在 Toyonishiki 品種劍葉中 27轉(zhuǎn)錄因 子基因(21個(gè)下調(diào), 6個(gè)上調(diào)至基因轉(zhuǎn)錄水平 。在這些氮反應(yīng)基因 中, SN196品種中 48個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因和在 Toyonishiki 中

2、 22個(gè)轉(zhuǎn)錄 因子基因變化顯著。低氮脅迫下 SN196和 Toyonishiki 之間,有重 疊的轉(zhuǎn)錄因子基因響應(yīng)。 , 1上調(diào)和 4個(gè)下調(diào)至轉(zhuǎn)錄水平。在兩個(gè)水稻 品種之間低氮反應(yīng)染色體的基因分布是不同的。水稻是中國種植面積最大,產(chǎn)量最高利用氮肥最多的糧食作物 之一。 2002年,水稻在中國種植面積達(dá)到 2.85×107hm2,占世界 水稻種植總面積在的 20%,但在中國水稻種植區(qū)使用氮肥的量比世 界平均水平多 30%。大量氮肥的應(yīng)用降低肥料的利用率,造成了能 源的極大浪費(fèi), 增加了食品成本, 嚴(yán)重影響了農(nóng)民生產(chǎn)糧食的積極性, 更重要的是, 造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。 因此, 如何提高水稻

3、的氮素吸收 效率, 減少氮肥的施用量, 同時(shí)仍保持高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)是近年來研究的熱點(diǎn) (美, 1997; Inthapanya等, 2000; Koutroubas和 Ntanos , 2003年問題。植物轉(zhuǎn)錄因子在植物生命活動(dòng)起著重要作用。由于首次在玉米中發(fā)現(xiàn), 之后就有數(shù)以百計(jì)的植物轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn), 并在水稻至少有 2 300轉(zhuǎn)錄因子,在水稻生長和發(fā)展中起著重要作用。以往的研究結(jié) 果表明, 通過一系列的應(yīng)激相關(guān)基因 (Jaglo -的 Ottosen 等, 1998 ;春日等, 1999 ;筱崎等人, 2000 ;陳等人, 2002的調(diào)整,植物轉(zhuǎn) 錄因子影響了植物脅迫耐受性。 到目前為止, 已知的

4、轉(zhuǎn)錄因子與一系 列抗逆基因,對(duì)抗低溫,干旱,鹽和疾病(Maleck 等密切相關(guān), 2000 ;參數(shù)在線等, 2001 ; Singhet人, 2002年 ; Aharoni等, 2004 ;陳等人, 2004; 金, 2006 ;廉等人, 2006 ; Zhao等, 2011 。利 用全球基因組表達(dá)芯片分析,廉等人(2006表明,在低氮脅迫, 在水稻根系發(fā)生變化 11轉(zhuǎn)錄因子中有 5個(gè)上調(diào)基因和 6個(gè)下調(diào)基因, 這就說明轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平也與低氮脅迫密切相關(guān)。 然而, 這些結(jié)果 只限于在低氮脅迫下苗期水稻。 據(jù)悉, 水稻葉片葉綠素含量與氮供應(yīng) 密切相關(guān)(武羅, 1996; Li等人, 2003

5、。因此,氮限制條件下, 葉綠素含量的差異反映氮素吸收效率和葉綠素合成的差異。 本研究利 用水稻基因芯片技術(shù)研究水稻在抽穗期劍葉中轉(zhuǎn)錄因子的氮脅迫響 應(yīng)差異和葉綠素含量, 以便更好地了解作物對(duì)低氮脅迫的反應(yīng)及其機(jī) 制,并為提高水稻氮肥吸收和利用效率提供參考。材料與方法超綠水稻 SN196,是沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所超級(jí)稻育種實(shí)踐中發(fā) 現(xiàn)的一葉色突變體。 經(jīng)過幾年的不斷自我繁殖, 性狀穩(wěn)定表現(xiàn)特點(diǎn)為 深綠色色,生長過程中葉片中具有高葉綠素含量。 Toyonishhiki 是 一個(gè)普遍的日水稻品種,其葉綠素含量顯著低于 SN196。這兩種材料的相關(guān)特性已經(jīng)被研究過了(Sui 等, 2010 。材料的培

6、養(yǎng)該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)基地在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),中國水稻研究所。水稻種 植在 30厘米的開口直徑的塑料盆內(nèi),在 20厘米的直徑,且為 26厘米 的高度。每盆含 13.5千克土壤且充分混合,過篩,干燥。土壤為砂質(zhì) 壤土為 29.8毫克 /克有機(jī)質(zhì)含量, 總氮含量 1.11-1 .28毫克 /克?？?p 含量為 2.80毫克 /克, 總 K 含量為 34.0mg /克, 水解氮含量 30.0微克 /克,和速效磷含量 5.90微克 /克。尿素 CO(NH 2 2,氮含量: 46.7 %被用作氮肥。低氮脅迫處理被定為 N0 (0克 /千克 。正 常氮肥處理設(shè)置為 N1(0.15克 /千克作為對(duì)照。過磷酸鈣 Ca(H

7、 2 PO 4 2 ·H 2 O ,磷含量:18%作為磷的肥料和 KCl 作為鉀 的肥料。 為了避免在同一時(shí)間過度使用氮肥, 損害稻秧, 氮肥施在三 次:底肥(50 % ,分蘗肥(30 %和穗肥(20 % 。 磷, 鉀肥分別為基肥施一次。 幼苗生長在絕緣和干燥的土壤養(yǎng)分 (苗 特有的土壤,根據(jù)生長方式和水稻幼苗的營養(yǎng)特點(diǎn)準(zhǔn)備 。稻苗在 4葉期移栽到準(zhǔn)備好的塑料盆中。每盆有 3個(gè)孔,每個(gè)孔有 1幼苗,每 個(gè)樣品重復(fù) 3次。植物覆蓋避雨,以防雨水和氮肥的損失。其他管理 人員均同于一般的生產(chǎn)領(lǐng)域。劍葉收集在抽穗期,液氮速凍 ,并儲(chǔ) 存于 -80 ,以備使用。相對(duì)葉綠素含量,葉片含氮量的測(cè)量

8、使用葉綠素含量計(jì)(CCM-200, OPTI-科學(xué),美國對(duì)在抽穗期 劍葉中主莖的相對(duì)葉綠素含量進(jìn)行了測(cè)量。在每個(gè)盆中收集三片葉子,分別測(cè)定每片葉子的上部,中部和下部。每個(gè)處理重復(fù) 3次。將 抽穗期的劍葉分別放在在 105ºC 烘箱中固定 30分鐘,在 80干燥至 恒重,然后研磨。半克樣品(精確至 0.0002g 克置于消化管和浸在 1毫升水中。硫酸鉀(7克和硫酸銅·5H2O (0.8 G 加入在消化 管與催化劑 12毫升的濃硫酸,并充分混合。樣品被消化的消化烘箱 中于 420維持 60-90分鐘,直到溶液變得透明的藍(lán)綠色的顏色。冷 卻 10-20分 鐘 后 , 葉 片 含

9、氮 量 是 用 一 個(gè) 自 由 和 開 放 源 碼 的 Kjeltec2300分析儀組(福斯 AB ,瑞典測(cè)定。提取和純化的總 RNA按照 Trizol 試劑(Invitrogen 公司,美國的說明提取 RNA 和使用 RNeasy mini試劑盒(Qiagen 公司,荷蘭進(jìn)行 RNA 的純 化。純化的 RNA 樣品 A260and A280值是使用 UV 分光光度計(jì)(日 立公司,日本進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)測(cè)得的濃度,每個(gè) RNA 樣品稀釋到 相同濃度下, 和 1 g RNA是由 0.8%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到。 RNA 樣品從 3生物重復(fù)進(jìn)行等體積混合,并用于微陣列分析。水稻基因芯片為 '

10、0' 的平均表達(dá)值和背景的調(diào)整, 以增加信噪比。 多余數(shù)據(jù), 進(jìn)行刪 除,以提高加工效率和使結(jié)果更容易理解。這兩個(gè)品種的 N1處理作 為對(duì)照,通過 N0處理并對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行了比較, 表達(dá)水平超過 2倍的變 化被認(rèn)為是基因表達(dá)改變的閾值。實(shí)時(shí)定量 PCR 分析將每一 RNA 樣本三個(gè)重復(fù)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA , 然后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 分析, 將反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 作為模板, 使用來自 Qiagen 公司在 ABI7500熒光定量 PCR 儀中的 SYBR Green RT-PCR 檢測(cè)試劑盒中 水稻肌動(dòng)蛋白 作為 內(nèi)部參考。 在超級(jí)綠色水稻 SN196微陣列分析中有四個(gè)基因的 差異表達(dá)

11、中隨機(jī)選取,使用設(shè)計(jì)的引物表達(dá) 3.0軟件(表 1 ,以驗(yàn) 證基因芯片分析結(jié)果的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析。從每個(gè)樣 品中每個(gè)基因重復(fù)四次并用相對(duì)定量法進(jìn)行定量計(jì)算。 計(jì)算公式為靶 基因的相對(duì)定量是相對(duì)。 EXP = 2 - Ct 法,其中 Ct 法 = Ctunknown 樣品 - Ctcalibrator , Ctunknown 樣品 = Ctinternal 參 照 基 因 - Cttarget 基 因 , Ctcalibrator = Ctreference 基因的參考樣本 - Cttarget基因的參考樣本 .結(jié)果:表 1中。引物為肌動(dòng)蛋白的實(shí)時(shí)定量 PCR 和四個(gè)隨機(jī)選擇的

12、基因的差異 表達(dá)在超級(jí)稻綠 SN196微陣列分析。1. 在低氮脅迫水稻劍葉葉綠素和氮含量表二表明,在低氮脅迫下這兩個(gè)品種中相對(duì)葉綠素含量和氮含量較 對(duì)照水平下都明顯降低, SN196和 Toyonishiki 中相對(duì)葉綠素含量 分別降低 22%和 41%達(dá)到顯著水平,而相對(duì)氮含量分別降低 21%和 41%也達(dá)到顯著水平。通過這兩個(gè)品種之間比較,超綠 SN196劍葉中葉綠素和氮含量明顯高于 Toyonishiki 。2. 低氮脅迫下水稻劍葉相對(duì)轉(zhuǎn)錄因子基因與對(duì)照組相比,在低氮脅迫下 SN196劍葉中有 53個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的 表達(dá)發(fā)生了變化, 其中, 35個(gè)基因下調(diào) ,3.6倍的變化, 18個(gè)基因上調(diào)

13、, 2.8倍的變化。 Toyonishiki 劍葉中有 27個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)發(fā)生了變 化。其中 21個(gè)基因下調(diào)在 2.0-5.4倍之間平均 2.7。 6個(gè)基因上調(diào)在 2。 3到 13.6倍之間,平均 4.2倍的升高。3. 低氮脅迫下在水稻不同葉綠素含量的品種特異性反應(yīng)和重疊的轉(zhuǎn) 錄因子基因在低氮脅迫下, 水稻不同葉綠素含量的最低氮肥脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因 子曾在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生特異性改變。在 SN196劍葉中的 53個(gè)低氮肥脅 迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子中 48個(gè)發(fā)生特異性改變,達(dá)到 90.6%.在這 48個(gè)中, 17個(gè)上調(diào), 31個(gè)下調(diào)到轉(zhuǎn)錄水平。 Toyonishiki 劍葉中的 22個(gè)低氮肥 脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)

14、生特異性改變,達(dá)到 78.6%.在這 22個(gè)中,有 17個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制其中 5個(gè)是在低氮脅迫下。在低氮脅迫 下在 SN196和 Toyonishiki 有含有 5個(gè)相同的低氮脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子, 其中 4個(gè)表達(dá) 下調(diào) 1個(gè)上調(diào)。4. 低氮脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子和其他一些轉(zhuǎn)錄因子的分類表 4和 5中表明, 低氮脅迫下含有高葉綠素的 SN196轉(zhuǎn)錄過程中 有 53個(gè)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生變化。他們屬于 14轉(zhuǎn)錄因子家族。 MYB 家族含 有最多的上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子,其中 Os07g0443500達(dá)到最高上調(diào)水平。 WRKY 家族含有最多下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子,其中 AK106282達(dá)到最高下調(diào)水平。有一些家族同時(shí)含有上調(diào)和下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子

15、。例如 bHLH 家族 中當(dāng)其他基因下調(diào)的時(shí)候 AK073183上調(diào)。 WRKY 家族中當(dāng)其他基 因下調(diào)的時(shí)候 AK109770上調(diào)。 MYB 同時(shí)含有上調(diào)和下調(diào)基因。在 Toyonishiki 中有 8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)發(fā)生變化。 MYB 中的 Os07g0443500達(dá)到最高上調(diào)水平 bHLH 和 MYB 家族同時(shí)含 有上調(diào)和下調(diào)基因。5. 低氮脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子中染色體分布在 SN196中低氮脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子主要分布在 1,2,3,4,5,6和第 8條染色體上,第 3條染色體上含有最多的低氮脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基 因。第 4條染色體上含有 9個(gè)。在第 2和 7和 11條染色體上僅含有

16、一個(gè) 轉(zhuǎn)錄因子。在第 9,10,12條染色體上沒有發(fā)現(xiàn)改變的轉(zhuǎn)錄因子。 在 Toyonishiki 中低氮脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子主要分布在 1,2, 3條 染色體上,主要的轉(zhuǎn)錄因子分布在第 3條染色體上, (9個(gè)屬于 4個(gè) 轉(zhuǎn)錄因子家族。其次就是第 1條染色體上(6個(gè) ,他們屬于 2個(gè)轉(zhuǎn)錄 因子家族。在第 8和第 10條染色體上沒有轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的變化。 在這兩個(gè)品種有四個(gè)相同的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量降低, 3個(gè)在第 3條 染色體上,一個(gè)在第 11條染色體上。在這兩個(gè)品種中有一個(gè)相同的 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量升高。在第 7條染色體上。6. 實(shí)時(shí)定量 PCR 分析為了驗(yàn)證微陣列數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,在 SN196中表達(dá)變化的基

17、因中 隨機(jī)選擇 4個(gè),設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 分析, PCR 反應(yīng)后,對(duì) 熔解曲線進(jìn)行分析。溶解曲線呈單峰,表明每一個(gè) PCR 產(chǎn)物要有優(yōu)異的特異性來保證后續(xù)結(jié)果的可靠性。表明,通過實(shí)時(shí)定量 PCR 分 析基因 1和基因 2的表達(dá)變化倍數(shù)略高于微陣列分析。在基因 3和基因 4中實(shí)時(shí)定量 PCR 分析的表達(dá)變化倍數(shù)略低于微陣列分析。從這四 個(gè)表達(dá)變化的基因, 實(shí)時(shí)熒光定量分析的結(jié)果基本上是與該微陣列分 析結(jié)果基本一致,表明該微陣列分析是可靠的。討論轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆中起著重要的作用。在不同的脅迫條件下, 許多轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平例如 AP2/EREBP, bZIP/HD-ZIP和 MYB 既

18、能誘導(dǎo)又能抑制。 特異性轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平的改變可以大大的影 響植物適應(yīng)環(huán)境脅迫的能力。 連等人應(yīng)用全球基因表達(dá)微陣列分析在 低氮脅迫下苗期的基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn) 5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子上調(diào), 6個(gè)下調(diào)。 本研究表明長期低氮脅迫可以誘導(dǎo)或抑制轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá), 大多數(shù)表 達(dá)變化的轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上具有品種特異性表達(dá), 且具有不同的 葉綠色含量。 在 SN196和 Toyonishiki 分別有 90.6%和 78.6%的氮脅 迫轉(zhuǎn)錄因子。 在這兩個(gè)品種間不同葉綠素含量的品種特異性反應(yīng)表明 低氮脅迫在轉(zhuǎn)錄水平上的差異。 正因?yàn)橛泻芏噢D(zhuǎn)錄因子且調(diào)控的多樣 性, 就不難理解在低氮脅迫下這兩個(gè)品種相同的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)

19、的差異 性。 表達(dá)差異可能是由于增強(qiáng)植物某些物質(zhì)生物活性生理生化活動(dòng)的 再組織與調(diào)節(jié),抑制表達(dá)的其他物質(zhì)主要是來適應(yīng)低氮脅迫降低損 失。 在低氮脅迫下這兩個(gè)品種重疊轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)表明這兩個(gè)品種有 些共享的反應(yīng)機(jī)制。根據(jù)已完成的水稻基因組序列數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析表明,水稻含有 184個(gè) bHLH 基因,組成了水稻最大轉(zhuǎn)錄因子家族。水稻的 bHLH 基因家族具有廣泛的生物學(xué)功能, 例如生長和發(fā)育的調(diào)控, 營 養(yǎng)吸收和信號(hào)傳導(dǎo)。水稻的 bHLH 基因家族成員參與植物生長發(fā)育 過程的各個(gè)階段,然而,只有少數(shù)植物 bHLH 結(jié)構(gòu)基因已被克隆, 并明確了其詳細(xì)的生物學(xué)功能。李等人對(duì)水稻 bHLH 基因家族成員 的表達(dá)模式進(jìn)行了詳細(xì)的研究,表明大量的 bHLH 基因組成性表達(dá), 具有組織,空間特異性。連等人還發(fā)現(xiàn)一些 bHLH 基因家族的表達(dá) 在低氮脅脅迫下苗期的根組織中表達(dá)變化。 在本研究中, 也表明一些 bHLH 基因也參與環(huán)境脅迫反應(yīng)的分子調(diào)控。在低氮脅迫下一些 bHLH 基因表達(dá)上調(diào)一些表達(dá)抑制, 表明不同的基因響應(yīng)環(huán)境脅迫用 不同的方法。表達(dá)變化的 bHLH 基因家族成員在這兩個(gè)品種之間不 同。有 4個(gè)響應(yīng) bHLH 基因在 SN196, 2個(gè)在 Toyonishiki ,表明抵 抗低氮脅迫的不同