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1、JNK在驚厥持續(xù)狀態(tài)幼年大鼠海馬中的表達及依達拉奉對其的影響 作者:陸海燕,鄧小龍,李光乾,李偉【摘要】 目的 :研究(JNK)在驚厥持續(xù)狀態(tài)(SC)幼年大鼠海馬中的表達及依達拉奉對其的影響。方法:雄性SD幼年大鼠120只分為正常對照組(NC組)、驚厥持續(xù)狀態(tài)組(SC組)、依達拉奉組(EDA組)三大組;各大組均隨機分為5組,分別于驚厥后4、12、
2、24、48和72 h處死。采用氯化鋰-匹魯卡品法制作驚厥持續(xù)狀態(tài)模型。EDA組在大鼠造模前三天予EDA腹腔注射,每天注射一次,連續(xù)3 d。TUNEL法檢測觀察大鼠海馬細胞凋亡情況;免疫組化法檢測海馬p-JNK蛋白表達動態(tài)變化;RT-PCR技術檢測海馬JNK1 mRNA表達的動態(tài)變化。結果:SC組在驚厥12 h后的各時間點海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞數均顯著高于NC組(P<0.01),而ED組TUNEL陽性細胞數均較SC組顯著下降(P <0.01或P <0.05)。幼年大鼠海馬CA1區(qū)p-JNK蛋白在SC組表達顯著增強,與NC組比較差異有顯著性(P <0.01),在ED
3、A組表達較SC組明顯下降(P <0.01)。SC組海馬JNK1 mRNA表達明顯高于NC組(P <0.01),而在EDA組JNK1 mRNA的表達較SC組顯著降低(P <0.01)。結論:SC可誘導JNK的表達,促進SC后海馬神經元凋亡;EDA預處理可以影響JNK的表達,減輕驚厥后海馬神經元凋亡程度。 【關鍵詞】 驚厥;腦損傷;幼年大鼠;JNK;依達拉奉Abstract: Objective: To observe the change of JNK in the hippocampus of status convulsive rat and the regul
4、ation effect of EDA on it. Methods: One hundred and twenty male Juvenile Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into normal control group (NC), status convulsivus group (SC), and edaravone group (EDA);and every group were randomly divided into five groups, which would be executed at 4 h,12 h,2
5、4 h,48 h and 72 h after convulsion discontinued. Status convulsivus (SC)was induced by injecting Lithium Chloride and Pilocarpine. Group EDA were injected EDA before convulsion,and repeatedly every day for 3 days. The expression of apoptosis cells were observed with TdT-mediated dUTP nick end labeli
6、ng (TUNEL),the changes of p-JNK protein in the hippocampus CA1 domains were detected with immunohistochemistry(IHC),the expression of JNK1 mRNA were detected with RT-PCR. Results: The TUNEL positive cells in hippocampus CA1 of SC group were more than that of NC group at 12 h after the SC(P <0.01)
7、. After the intervention of edaravone,TUNEL positive cells showed a significant drop (P <0.01 or P <0.05). The expression of p-JNK protein in the hippocampus CA1 domains increased markedly in SC group. The difference was statisticaly significance compared with NC group (P <0.01), and EDA gr
8、oup was much lower than SC group (P <0.01). The expression of JNK1 mRNA in the hippocampus in SC Group was much higher than NC Group (P <0.01),and EDA group was significantly lower than SC group(P <0.01). Conclusion: SC maybe increase the expression of JNK, JNK may be mediated to cell apopt
9、osis. EDA can effect the expression of JNK, and lessen the pothology of hippocampus.Key words: convulsion;brain injury;juvenile rat;JNK;edaravone驚厥是小兒時期較常見的急癥。當驚厥反復發(fā)作而未能很好控制時,可導致進行性腦損傷,并可造成認知損害1。多種因素導致神經元壞死和細胞凋亡是驚厥性腦損傷的基本原因。JNK(C-Jun N端激酶)是凋亡途徑中重要的信號分子,已有部分學者對其參與神經元凋亡的情況做了研究。然而在驚厥持續(xù)狀態(tài)(status convuls
10、ive,SC)后的表達情況目前尚未見相關報道。依達拉奉(edaravone,EDA)對低氧缺血性腦病的神經元保護作用已得到證實2,但其對于SC后JNK的表達及神經元凋亡的影響情況,國內外尚未見報道。本實驗通過建立氯化鋰-匹魯卡品SC大鼠模型,觀察幼年大鼠海馬p-JNK蛋白及JNK1 mRNA表達的變化,及依達拉奉對SC后海馬JNK表達及神經元凋亡情況的影響,初步探討JNK與驚厥性腦損傷的關系及依達拉奉在SC幼鼠中可能的神經元保護機制。1 材料和方法1.1 實驗動物和試劑 清潔級健康幼年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(購自中國科學院上海分院試驗動物中心)120只,體重5070 g。
11、氯化鋰、匹羅卡品購自美國Fluka公司,細胞凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏公司。鼠抗p-JNK單克隆抗體購自美國Stancru公司。M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司,依達拉奉由南京先聲東元制藥有限公司資助。1.2 實驗分組和SC動物模型的建立 隨機將SD大鼠分為正常對照組(NC組)、驚厥持續(xù)狀態(tài)組(SC組)、依達拉奉組(EDA組)三大組,每組40只大鼠;各大組再隨機分為5小組,分別于驚厥后4、12、24、48和72 h處死。若因模型不成功、死亡造成各亞組樣本量不足8只的,按隨機原則補足。采用氯化鋰-匹魯卡品法制作SC模型。SC模型制作參照胡越等3方法。驚厥按
12、Racine分級標準分為V級,驚厥發(fā)作達到IV-V級,持續(xù)時間至少30 min,驚厥解除后狀態(tài)良好的大鼠為合格SC大鼠模型。NC組:不作任何處理。EDA組:造模前3 d予EDA 3 mg/kg腹腔注射,每天注射一次,連續(xù)3 d,其余用藥同SC組。1.3 動物標本的制備 大鼠分別于驚厥后各時間點處死。經10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉后,斷頭剝離顱骨,完整取出腦組織置于冰盤上,分離右側海馬腦組織,放入去RNA酶的EP管中,迅速置于液氮中保存。左側大腦在垂直視交叉處離斷,并冠狀位向后切取約5 mm,放入預冷的4%多聚甲醛固定12 h,入70%乙醇,送病理科進行石蠟包埋;石蠟包埋后制片,
13、切片厚度為5m。1.4 實驗方法1.5 統(tǒng)計學處理方法 多組比較采用單因素方差分析,均數的兩兩比較采用LSD-t檢驗,兩變量的相關采用直線相關分析法分析。2 結果2.1 各組大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞表達結果(見圖1) TUNEL結果顯示,TUNEL陽性細胞主要在神經元及神經膠質細胞,胞核中出現棕黃色顆粒,形成典型的“指環(huán)狀”或“半月狀”的細胞凋亡特征。SC組海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞于驚厥后4 h已有少量表達,48 h達高峰,之后有下降趨勢;其24、48、72 h三個時間點均明顯高于NC組(P <0.01)。EDA組24、48和72 h時間點TUNEL陽性細胞表達水平較SC
14、組均明顯降低(P <0.01);但仍高于NC組(P <0.01)(見表2)。2.2 大鼠海馬p-JNK蛋白免疫組化結果(見圖2) 免疫組化結果顯示,NC組p-JNK蛋白在神經元和神經膠質細胞的胞核少量表達。SC后4 h海馬CA1區(qū)p-JNK蛋白表達即開始增加,48 h達高峰,72 h下降。而EDA組驚厥后各時間點海馬p-JNK蛋白表達水平較SC組降低,以24和48 h時間點為著(P <0.01)(見表3)。2.3 各組大鼠海馬JNK1 mRNA的表達(見圖3) RT-PCR方法檢測到NC組大鼠海馬JNK1 mRNA少量表達。SC組JNK1 mRNA的表達于驚厥后4 h開始增加,48 h達高峰,72 h下降。而EDA組驚厥后24和48 h時間點海馬JNK1 mRNA表達水平較SC組均明顯降低(P <0.01)(見表4)。2.4 相關性分析 大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞與CA1區(qū)p-JNK蛋白表達呈正相關(=0.567,n=80,P<0.01)。海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞與JNK1 mRNA表達正
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