第六章 微生物遺傳變異育種(4)

1、生物進化過程中微生物形成完善的代謝調(diào)節(jié)機制 不會有代謝產(chǎn)物的積累 解除或突破微生物的代謝調(diào)節(jié)控制 目的產(chǎn)物積累微生物育種的目的方法：突變、體內(nèi)重組 體外重組（基因工程）4 4、工業(yè)微生物育種、工業(yè)微生物育種 4.14.1從自然界中獲得新菌種從自然界中獲得新菌種 微生物資源分布微生物資源分布土壤、水、空氣、動植物及其腐敗殘骸都是微生土壤、水、空氣、動植物及其腐敗殘骸都是微生物的主要棲居和生長繁殖場所物的主要棲居和生長繁殖場所 分離微生物新種的步驟分離微生物新種的步驟 采樣、增殖、純化和性能測定等步驟。采樣、增殖、純化和性能測定等步驟。 典型的微生物典型的微生物采樣和篩選方法采樣和篩選方法 直接從

2、自然界分離得到的菌株為野生型菌株。直接從自然界分離得到的菌株為野生型菌株。往往低產(chǎn)甚至不產(chǎn)所需的產(chǎn)物，只有經(jīng)過進一往往低產(chǎn)甚至不產(chǎn)所需的產(chǎn)物，只有經(jīng)過進一步的人工改造才能真正用于工業(yè)生產(chǎn)步的人工改造才能真正用于工業(yè)生產(chǎn) 菌種選育菌種選育突變、體內(nèi)重組突變、體內(nèi)重組體外重組（基因工程）體外重組（基因工程）4.2 4.2 誘變育種誘變育種 化學(xué)誘變化學(xué)誘變物理誘變物理誘變紫外線紫外線 5-5-溴尿密啶溴尿密啶 4.2.1 4.2.1 紫外線誘變紫外線誘變 造成造成DNADNA鏈的斷裂，或使鏈的斷裂，或使DNADNA分子分子內(nèi)或分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)內(nèi)或分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng) 機理機理交聯(lián)是由二聚體引起

3、的，二聚體可以在交聯(lián)是由二聚體引起的，二聚體可以在同一條鏈相鄰的堿基之間產(chǎn)生，也可以同一條鏈相鄰的堿基之間產(chǎn)生，也可以是在二條鏈的堿基之間形成。是在二條鏈的堿基之間形成。 研究的比較清楚研究的比較清楚引起引起DNADNA復(fù)制錯誤復(fù)制錯誤 嘧啶比嘌呤對紫外線敏感得多嘧啶比嘌呤對紫外線敏感得多 胸腺嘧啶二聚體胸腺嘧啶二聚體 嘧啶的紫外線光化產(chǎn)物嘧啶的紫外線光化產(chǎn)物誘變過程中需要注意誘變過程中需要注意光復(fù)活作用光復(fù)活作用 微生物等生物的細胞內(nèi)存在光復(fù)活酶微生物等生物的細胞內(nèi)存在光復(fù)活酶 光復(fù)活酶識別胸腺嘧啶二聚光復(fù)活酶識別胸腺嘧啶二聚體，并與之結(jié)合形成復(fù)合物體，并與之結(jié)合形成復(fù)合物打開二聚體，將打開

4、二聚體，將DNADNA復(fù)原。復(fù)原。 可見光光能（可見光光能（300-500nm300-500nm）激活光復(fù)活酶）激活光復(fù)活酶此時的光復(fù)活此時的光復(fù)活酶沒有活性酶沒有活性PRE為光復(fù)活酶 暗修復(fù)暗修復(fù) 細胞內(nèi)還存在另一種修復(fù)體系，它不需要光激活細胞內(nèi)還存在另一種修復(fù)體系，它不需要光激活 可修復(fù)由紫外線、可修復(fù)由紫外線、射線和烷化劑等對射線和烷化劑等對DNADNA造成的損傷。造成的損傷。 暗修復(fù)體系有四種酶參與反應(yīng)。暗修復(fù)體系有四種酶參與反應(yīng)。 核酸內(nèi)切酶切開二聚核酸內(nèi)切酶切開二聚體的體的55末端末端, ,形成形成3-OH3-OH和和5-P5-P的單鏈的單鏈缺口缺口 核酸外切酶從核酸外切酶從5-P

5、5-P到到3-OH3-OH方向切除二方向切除二聚體，并擴大缺口聚體，并擴大缺口 DNADNA聚合酶以另一條聚合酶以另一條互補鏈為模板，從原互補鏈為模板，從原有鏈上暴露的有鏈上暴露的3-OH 3-OH 端起合成缺失片段端起合成缺失片段 連接酶將新合成鏈的連接酶將新合成鏈的3-OH3-OH與原鏈的與原鏈的5-P5-P相相連接連接 紫外誘變的特點紫外誘變的特點 方便、誘變效果很好的常用誘變劑方便、誘變效果很好的常用誘變劑 在紅光下操作或暗培養(yǎng)在紅光下操作或暗培養(yǎng) 參數(shù)：紫外燈功率、工作距離、照射時間參數(shù)：紫外燈功率、工作距離、照射時間4.2.2 5-4.2.2 5-溴尿嘧啶誘變溴尿嘧啶誘變堿基類似物

6、堿基類似物 機理：機理：與堿基的結(jié)構(gòu)類似，與堿基的結(jié)構(gòu)類似，在在DNADNA復(fù)制時，它們可復(fù)制時，它們可以被錯誤地摻入以被錯誤地摻入DNADNA，引起誘變效應(yīng)引起誘變效應(yīng) 酮式的酮式的5-BU5-BU結(jié)構(gòu)與胸腺結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶相似嘧啶相似 ，與，與A A配對配對 5-BU5-BU很容易進行酮式與很容易進行酮式與烯醇式結(jié)構(gòu)的互變異構(gòu)烯醇式結(jié)構(gòu)的互變異構(gòu) 烯醇式烯醇式5-BU5-BU不與不與A A而與而與G G配對配對 A A：T TG G：C C 參數(shù)：濃度、時間、緩沖液參數(shù)：濃度、時間、緩沖液誘變育種的基本過程如下：誘變育種的基本過程如下： 在誘變處理前，一般應(yīng)預(yù)先做誘變劑用量對菌體在誘變處理前

7、，一般應(yīng)預(yù)先做誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。 合適誘變劑量的選擇合適誘變劑量的選擇 出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇一是考慮出發(fā)菌株是否具有特定生產(chǎn)性狀的能力或一是考慮出發(fā)菌株是否具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力，即菌株是否具有產(chǎn)生特定代謝產(chǎn)物的催化酶潛力，即菌株是否具有產(chǎn)生特定代謝產(chǎn)物的催化酶系的基因。系的基因。 自然界直接分離到的野生型菌株自然界直接分離到的野生型菌株 經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗的菌株經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗的菌株 已經(jīng)歷多次育種處理的菌株已經(jīng)歷多次育種處理的菌株 菌株來源菌株來源其次是出發(fā)菌株最好已具備一些有利的性狀，如生其次是

8、出發(fā)菌株最好已具備一些有利的性狀，如生長速度快、營養(yǎng)要求低和產(chǎn)孢子早而多的菌株。長速度快、營養(yǎng)要求低和產(chǎn)孢子早而多的菌株。 制備菌懸液制備菌懸液 待處理的菌懸液應(yīng)考慮微生物的生理狀態(tài)、懸液的均待處理的菌懸液應(yīng)考慮微生物的生理狀態(tài)、懸液的均一性和環(huán)境條件。一性和環(huán)境條件。 一般要求菌體處于對數(shù)生長期，并采取一定的一般要求菌體處于對數(shù)生長期，并采取一定的措施促使細胞處于同步生長。措施促使細胞處于同步生長。 懸液的均一性可保證誘變劑與每個細胞機會均等懸液的均一性可保證誘變劑與每個細胞機會均等并充分地接觸，避免出現(xiàn)不純的菌落，給后續(xù)的并充分地接觸，避免出現(xiàn)不純的菌落，給后續(xù)的篩選工作造成困難。篩選工作

9、造成困難。 用玻璃珠振蕩打散細胞團，用玻璃珠振蕩打散細胞團，再用脫脂棉花或濾紙過濾，再用脫脂棉花或濾紙過濾，得到分散的菌體。得到分散的菌體。 產(chǎn)孢子或芽孢的微生物最產(chǎn)孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢好采用其孢子或芽孢 菌懸液的細胞濃度一般控制為：菌懸液的細胞濃度一般控制為：真菌孢子或酵母細胞真菌孢子或酵母細胞10106 6 10107 7個個/ml/ml，放線菌或，放線菌或細菌細菌10108 8個個/ml/ml。菌懸液一般用生理鹽水。菌懸液一般用生理鹽水（0.85%NaCl0.85%NaCl）稀釋。）稀釋。 誘變處理誘變處理 在誘變處理前，一般應(yīng)預(yù)先做誘變劑用量對菌體在誘變處理前，一般應(yīng)

10、預(yù)先做誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。 合適誘變劑量的選擇合適誘變劑量的選擇就一般微生物而言，突變率隨劑量的增大而增高，但就一般微生物而言，突變率隨劑量的增大而增高，但達到一定劑量后，再加大劑量反而會使突變率下降。達到一定劑量后，再加大劑量反而會使突變率下降。致死率在致死率在70%-80%70%-80% 誘變育種中還常常采取誘變劑復(fù)合處理，使它們產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。誘變育種中還常常采取誘變劑復(fù)合處理，使它們產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。 4.2.2 4.2.2 菌種篩選的策略菌種篩選的策略 篩選的手段必需配合不同篩選階段的要求篩選的手段必需配合不同篩選

11、階段的要求初篩：要力求快速、簡便初篩：要力求快速、簡便 復(fù)篩：應(yīng)該做到精確，測得的數(shù)據(jù)要能夠反映將來的生產(chǎn)水平復(fù)篩：應(yīng)該做到精確，測得的數(shù)據(jù)要能夠反映將來的生產(chǎn)水平 (1)(1)從菌體形態(tài)變異分析從菌體形態(tài)變異分析初篩初篩有些菌體的形態(tài)變異與產(chǎn)量的變異存在著一定的相關(guān)性，在篩有些菌體的形態(tài)變異與產(chǎn)量的變異存在著一定的相關(guān)性，在篩選工作中應(yīng)盡可能捕捉、利用這些直接的形態(tài)特征性變化。選工作中應(yīng)盡可能捕捉、利用這些直接的形態(tài)特征性變化。 平皿快速檢測法平皿快速檢測法平皿快速檢測法是利用菌體在特定平皿快速檢測法是利用菌體在特定固體培養(yǎng)基平板上的生理生化反應(yīng)，固體培養(yǎng)基平板上的生理生化反應(yīng)，將肉眼觀察不

12、到的產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化成將肉眼觀察不到的產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化成可見的可見的“形態(tài)形態(tài)”變化。變化。 紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等。長圈法和抑制圈法等。定性或半定量定性或半定量用用 ，大大提高篩選的效率，大大提高篩選的效率 初篩初篩微生物特異性平板檢測方法微生物特異性平板檢測方法 飽浸含某種指示飽浸含某種指示劑的固體培養(yǎng)基劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片變色圈的濾紙片變色圈 指示劑直接摻入或噴灑固指示劑直接摻入或噴灑固體培養(yǎng)基，菌落周圍形成體培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液噴上稀碘液 固體培養(yǎng)基中滲入溶解性固體培

13、養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營差、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)基背景。菌落利用此物養(yǎng)基背景。菌落利用此物質(zhì)形成透明圈。質(zhì)形成透明圈。利用一些有特別營養(yǎng)要利用一些有特別營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，求的微生物作為工具菌，如待篩選菌具有該營養(yǎng)如待篩選菌具有該營養(yǎng)物的前體轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)物物的前體轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)物 能力，工具菌就能圍繞能力，工具菌就能圍繞該菌生長該菌生長 待篩選的菌株能待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生長抑制工具菌生長的物質(zhì)的物質(zhì) 搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法 搖瓶培養(yǎng)法是將待測菌株的單菌落分別接種到三角搖瓶培養(yǎng)法是將待測菌株的單菌落分別接

14、種到三角瓶培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，然后，再對培養(yǎng)液進行分瓶培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，然后，再對培養(yǎng)液進行分析測定。析測定。 特殊變異菌的篩選方法特殊變異菌的篩選方法 營養(yǎng)缺陷型突變株營養(yǎng)缺陷型突變株 抗阻遏和抗反饋突變型抗阻遏和抗反饋突變型 抗生素抗性突變株抗生素抗性突變株條件抗性突變條件抗性突變營養(yǎng)缺陷型突變株營養(yǎng)缺陷型突變株 濃縮、進一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。濃縮、進一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。篩選步驟：篩選步驟： 濃縮營養(yǎng)缺陷型菌株濃縮營養(yǎng)缺陷型菌株 常用的濃縮方法有抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法等。常用的濃縮方法有抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法等。目的：淘汰大量野生

15、型，使?fàn)I養(yǎng)缺陷型占的比例增加目的：淘汰大量野生型，使?fàn)I養(yǎng)缺陷型占的比例增加 進一步檢出所需缺陷型 逐個檢出法 影印培養(yǎng)法 一般從菌落大小也可一般從菌落大小也可以判斷，新長出的菌以判斷，新長出的菌落較小，即是營養(yǎng)缺落較小，即是營養(yǎng)缺陷型陷型 夾層培養(yǎng)法夾層培養(yǎng)法 營養(yǎng)缺陷型的鑒定營養(yǎng)缺陷型的鑒定 獲得的營養(yǎng)缺陷型菌株還應(yīng)進一步確認其生長的所需物。獲得的營養(yǎng)缺陷型菌株還應(yīng)進一步確認其生長的所需物。 生長譜法生長譜法 組合補充培養(yǎng)基法組合補充培養(yǎng)基法營養(yǎng)缺陷型的應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型的應(yīng)用 利用營養(yǎng)缺陷型突變株來生產(chǎn)氨基酸和核苷酸是典型的例子 天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶(AK)(AK)被賴氨酸及蘇氨酸協(xié)同反饋

16、所抑制被賴氨酸及蘇氨酸協(xié)同反饋所抑制 通過誘變處理，獲得高絲氨酸缺陷型突變菌株，通過誘變處理，獲得高絲氨酸缺陷型突變菌株，該突變型不能產(chǎn)生蘇氨酸。該突變型不能產(chǎn)生蘇氨酸。在限量高絲氨酸的培養(yǎng)基中缺陷型菌株能夠正常生長，在限量高絲氨酸的培養(yǎng)基中缺陷型菌株能夠正常生長，并且因為消除了反饋抑制并且因為消除了反饋抑制 突變型能過量生產(chǎn)突變型能過量生產(chǎn)L-L-賴氨酸賴氨酸 抗阻遏和抗反饋突變型抗阻遏和抗反饋突變型 抗阻遏和抗反饋突變型都是由于代謝失調(diào)所造成的，抗阻遏和抗反饋突變型都是由于代謝失調(diào)所造成的，在細胞中已經(jīng)有大量最終代謝產(chǎn)物時仍然繼續(xù)不斷地在細胞中已經(jīng)有大量最終代謝產(chǎn)物時仍然繼續(xù)不斷地合成這一

17、產(chǎn)物。合成這一產(chǎn)物。 選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株 結(jié)構(gòu)類似物是指一些和結(jié)構(gòu)類似物是指一些和細菌體內(nèi)氨基酸、嘌呤、細菌體內(nèi)氨基酸、嘌呤、維生素等代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)維生素等代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相類似的物質(zhì)相類似的物質(zhì) 主要用于末端產(chǎn)物的積累主要用于末端產(chǎn)物的積累抗性突變菌株的篩選抗性突變菌株的篩選 抗生素抗性突變株抗生素抗性突變株 在抗生素產(chǎn)生菌選育中，通過篩選抗生素抗在抗生素產(chǎn)生菌選育中，通過篩選抗生素抗性突變可提高抗生素產(chǎn)量。性突變可提高抗生素產(chǎn)量。 抗生素抗性突變株除能提高抗生素的產(chǎn)量外，抗生素抗性突變株除能提高抗生素的產(chǎn)量外，還能提高其它代謝產(chǎn)物的量。還能提高其它代謝產(chǎn)物的量。 條

18、件抗性突變條件抗性突變 因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為 野生型野生型 菌株的特性和突變型菌株的特性和突變型菌株特性的突變稱為條件抗性突變或稱為條件致死突變。菌株特性的突變稱為條件抗性突變或稱為條件致死突變。 溫度敏感突變常用于溫度敏感突變常用于提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量 致死致死營養(yǎng)缺陷營養(yǎng)缺陷抗性突變菌株的篩選方法抗性突變菌株的篩選方法 一次性篩選法一次性篩選法 一次性篩選法就是指在對出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選法就是指在對出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選出少量抗性變異株。一次性篩選出少量抗性變異株。 噬菌體抗性菌株噬菌體抗性菌株 耐高溫菌株耐高溫菌株 階梯性篩選

19、法階梯性篩選法 梯度平板法梯度平板法 紙片擴散法紙片擴散法 用打孔器將較厚的濾紙（如新華六號）打成小圓片，并使用打孔器將較厚的濾紙（如新華六號）打成小圓片，并使紙片吸收一定濃度的藥物，經(jīng)干燥或不經(jīng)干燥，放入涂布紙片吸收一定濃度的藥物，經(jīng)干燥或不經(jīng)干燥，放入涂布了菌懸液的平板上，一般了菌懸液的平板上，一般9 9厘米的培養(yǎng)皿中等距放置三片厘米的培養(yǎng)皿中等距放置三片為宜。經(jīng)培養(yǎng)后觀察圍繞紙片的抑菌圈，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)的為宜。經(jīng)培養(yǎng)后觀察圍繞紙片的抑菌圈，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)的可能就是抗性菌?？赡芫褪强剐跃?。組成酶變異株的篩選組成酶變異株的篩選誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物

20、的種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物的誘導(dǎo)物的種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物的影響。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）影響。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）會引起酶合成的減少，誘導(dǎo)物有時又會引起酶合成的減少，誘導(dǎo)物有時又比較昂貴。比較昂貴。生產(chǎn)成本提高生產(chǎn)成本提高 控制酶合成的調(diào)節(jié)基因發(fā)生了變異 誘導(dǎo)酶轉(zhuǎn)變成組成型酶 具體的篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導(dǎo)抑制物法 恒化器法：恒化器常被用于微生物的“馴化”，添加不能起誘導(dǎo)作用的低濃度底物，緩慢生長 循環(huán)培養(yǎng)法：利用不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境進行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。 誘導(dǎo)抑制劑法：加入誘導(dǎo)抑制劑如-硝基苯基-巖藻糖苷阻止

21、某些誘導(dǎo)酶的合成 4.3 4.3 體內(nèi)基因重組育種體內(nèi)基因重組育種接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和原生質(zhì)體融合等遺傳學(xué)方法和技術(shù)接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和原生質(zhì)體融合等遺傳學(xué)方法和技術(shù)使微生物細胞內(nèi)發(fā)生基因重組使微生物細胞內(nèi)發(fā)生基因重組4.3.1.4.3.1.原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合 將遺傳性狀不同的兩種菌將遺傳性狀不同的兩種菌( (包括種間、種內(nèi)及屬包括種間、種內(nèi)及屬間間) )融合為一個新細胞的技術(shù)。融合為一個新細胞的技術(shù)。 選擇親株選擇親株、原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體的融合、原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體的融合、原生質(zhì)體再生和融合子選擇等步驟原生質(zhì)體再生和融合子選擇等步驟 步驟步驟微生物原生質(zhì)體融合的一般原理和過程微生

22、物原生質(zhì)體融合的一般原理和過程 選擇親株選擇親株 選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株 為了能明確檢測到融合子，參與融合的親株為了能明確檢測到融合子，參與融合的親株一般都需要帶有可以識別的遺傳標(biāo)記，如營養(yǎng)一般都需要帶有可以識別的遺傳標(biāo)記，如營養(yǎng)缺陷型或抗藥性等缺陷型或抗藥性等 原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體制備 去除細胞壁是制備原生質(zhì)體的關(guān)鍵去除細胞壁是制備原生質(zhì)體的關(guān)鍵 革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖組成革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖組成 溶菌酶溶菌酶 微球菌、枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、黃色八疊球菌微球菌、枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、黃色八疊球菌 革蘭氏陰性菌

23、不能直接溶壁，只有當(dāng)乙二胺四乙酸革蘭氏陰性菌不能直接溶壁，只有當(dāng)乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）存在時，某些革蘭氏陰性菌的細胞壁才能夠被）存在時，某些革蘭氏陰性菌的細胞壁才能夠被溶菌酶溶解。溶菌酶溶解。 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 溶菌酶不能溶解溶菌酶不能溶解 表皮葡萄球菌能產(chǎn)生一種內(nèi)肽酶表皮葡萄球菌能產(chǎn)生一種內(nèi)肽酶葡萄球菌素，溶解葡萄球菌素，溶解放線菌的細胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌也可采用溶菌酶放線菌的細胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌也可采用溶菌酶真菌細胞壁主要由纖維素、幾丁質(zhì)和葡聚糖等組成真菌細胞壁主要由纖維素、幾丁質(zhì)和葡聚糖等組成青霉菌多用纖維素酶和青霉菌多用纖維素酶和 -1,3-1,3-

24、糖苷酶等溶壁糖苷酶等溶壁曲霉用曲霉用 -1,3-1,3-糖苷酶和糖苷酶和 -1,4-1,4-糖苷酶等糖苷酶等酵母菌細胞壁中的葡聚糖和幾丁質(zhì)酵母菌細胞壁中的葡聚糖和幾丁質(zhì) 蝸牛酶蝸牛酶 培養(yǎng)基中添加甘氨酸，可以使菌體較容易被酶解培養(yǎng)基中添加甘氨酸，可以使菌體較容易被酶解 在菌體生長階段添加蔗糖也能提高細胞壁對溶菌酶的敏感性在菌體生長階段添加蔗糖也能提高細胞壁對溶菌酶的敏感性在菌體生長對數(shù)期加入適量青霉素，就能使細胞對溶菌酶更敏感在菌體生長對數(shù)期加入適量青霉素，就能使細胞對溶菌酶更敏感菌齡：對數(shù)生長中期細胞的細胞壁中肽聚糖含量很低，對溶菌酶敏感。菌齡：對數(shù)生長中期細胞的細胞壁中肽聚糖含量很低，對溶

25、菌酶敏感。 原生質(zhì)體制備的其他因素：原生質(zhì)體制備的其他因素：一般是將原生質(zhì)體放在高滲的環(huán)境中以維持它的穩(wěn)定性一般是將原生質(zhì)體放在高滲的環(huán)境中以維持它的穩(wěn)定性原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）能有效地促進原生質(zhì)體融合）能有效地促進原生質(zhì)體融合一般一般PEGPEG的使用濃度范圍在的使用濃度范圍在25-40% 25-40% 采用電融合儀：在高頻電場下，用直流電穿孔來進行融合采用電融合儀：在高頻電場下，用直流電穿孔來進行融合原生質(zhì)體再生原生質(zhì)體再生 使原生質(zhì)體重新長出細胞壁使原生質(zhì)體重新長出細胞壁 ，恢復(fù)完整的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，恢復(fù)完整的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不同微生物的原生質(zhì)體的最適再生

26、條件不同，最重要的一個不同微生物的原生質(zhì)體的最適再生條件不同，最重要的一個共同點是都需要高滲透壓共同點是都需要高滲透壓 再生率再生率 細菌為細菌為3-10% 3-10% 真菌在真菌在20-80% 20-80% 融合重組子的篩選融合重組子的篩選通過兩親株遺傳標(biāo)記的互補而得以識別通過兩親株遺傳標(biāo)記的互補而得以識別 兩親株的遺傳標(biāo)記分別為營養(yǎng)缺陷型兩親株的遺傳標(biāo)記分別為營養(yǎng)缺陷型A+B-A+B-和和A-B+A-B+，融合重組，融合重組子應(yīng)是子應(yīng)是A+B+A+B+或或A-B-A-B-重組子的檢出方法有兩種：重組子的檢出方法有兩種： 直接法直接法 將融合液涂布在不補充親株生長需要的生長因子的將融合液涂布

27、在不補充親株生長需要的生長因子的高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子 間接法間接法 把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落和重組子都再生成菌落 ，然后用影印法將它們復(fù)制到，然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。 融合重組的頻率融合重組的頻率 = = 融合重組子融合重組子 兩親株原生質(zhì)體再生菌落的總數(shù)兩親株原生質(zhì)體再生菌落的總數(shù) 4.3.2 4.3.2 雜交育種雜交育種 進行體內(nèi)基因重組育種的其它方法包括接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等進行體內(nèi)基因重組育種的其它方法包括接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多重要的具生產(chǎn)價值的微生物的雜交、有