慢性粒細(xì)胞白血病樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)特異性抗白血病T細(xì)胞的作用

1、    慢性粒細(xì)胞白血病樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)特異性抗白血病T細(xì)胞的作用        樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是有效的抗原呈遞細(xì)胞，我們從初診慢性粒細(xì)胞白血病慢性期(CML-CP)患者的外周血中培養(yǎng)出DC，探討其對(duì)特異性抗白血病T細(xì)胞(Anti-LB-T)的作用。病例和方法1病例初診CML-CP患者16例。均有t(9；22)染色體異常。其中男10例，女6例。年齡32（1845）歲。分別將與其中6例患者HLA相合的6名健康親屬作為正常對(duì)照。2單個(gè)核細(xì)胞(MNC)的分離制備取肝素抗凝的外周血或

2、骨髓23ml，按文獻(xiàn)1分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)或骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)，用RPMI 1640培養(yǎng)液離心洗滌3次。CML-CP患者的PBMNC用于外周血DC和T細(xì)胞的培養(yǎng)。而CML-CP患者及正常對(duì)照的BMMNC凍存后用作靶細(xì)胞，進(jìn)行殺傷試驗(yàn)。3CML-CP患者外周血中DC的培養(yǎng)取洗滌的PBMNC，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml,以25cm2的培養(yǎng)瓶，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中培養(yǎng)。RPMI 1640完全培養(yǎng)液中含有2mmol/L谷氨酰胺，體積分?jǐn)?shù)為10%的滅活胎牛血清(FCS), 青霉素100U/ml, 鏈霉素100U/ml, 羥乙基

3、哌嗪乙烷磺酸(HEPES) 20mmol/L, GM-CSF 1000U/ml(美國(guó)先靈葆雅公司產(chǎn)品)，TNF- 50U/ml， IL-4 1000U/ml(Genzyme公司產(chǎn)品)。每34天進(jìn)行換液，同時(shí)計(jì)數(shù)細(xì)胞并取少量細(xì)胞進(jìn)行離心涂片，作形態(tài)觀察和免疫表型分析，于第14天對(duì)培養(yǎng)的DC進(jìn)行R顯帶染色體分析。4CML-CP患者外周血T細(xì)胞的培養(yǎng)及在DC存在下進(jìn)行擴(kuò)增將分離的CML-CP患者的PBMNC用含有體積分?jǐn)?shù)為10% FCS和1000U/ml IFN-(美國(guó)先靈葆雅公司產(chǎn)品)的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1× 106/ml，放入體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中

4、培養(yǎng)24小時(shí)，離心并用RPMI 1640洗滌，用含有5g/ml刀豆素A(ConA，Sigma)和1000U/ml IL-2(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院產(chǎn)品)的培養(yǎng)基重新懸浮，繼續(xù)培養(yǎng)。收集不粘附的細(xì)胞，每34天用含有IL-2的RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行換液。培養(yǎng)7天后將以上細(xì)胞分成兩組：一組加入經(jīng)放射線(30Gy60Co)處理的DC，比例為31；另一組僅加入含有IL-2的RPMI 1640培養(yǎng)液。兩組細(xì)胞均在含有IL-2的RPMI 1640培養(yǎng)液中再培養(yǎng)7天，每3天換液1次，然后進(jìn)行免疫表型分析和細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)。5免疫表型分析采用本室建立的APAAP法2。一抗CD2、CD4、CD8和CD16購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)

5、院邦定公司；CD1a和CD13為PharMingen公司產(chǎn)品。6細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)采用LDH釋放法3。以K562細(xì)胞和液氮凍存復(fù)蘇的CML患者的自體白血病細(xì)胞作靶細(xì)胞。以不同的效靶比例進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)。7R顯帶染色體分析參照文獻(xiàn)4進(jìn)行。結(jié)果1CML-CP患者外周血DC培養(yǎng)過(guò)程中的形態(tài)及增殖情況觀察剛分離的CML-CP患者PBMNC呈球形呈散在分布，表面光滑；培養(yǎng)2天時(shí)細(xì)胞數(shù)減少，部分細(xì)胞死亡；存活細(xì)胞經(jīng)34天培養(yǎng)后，胞體增大，細(xì)胞表面有短的突起，并呈葡萄狀聚集，但不與瓶壁粘附；培養(yǎng)1周后大多數(shù)細(xì)胞成簇聚集，少量細(xì)胞呈分散狀態(tài)，未粘附細(xì)胞胞體較大并有長(zhǎng)的突起，另外也能見(jiàn)到少量粘附的巨噬細(xì)胞。培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)

6、胞增殖情況見(jiàn)1。DC所占比例逐漸增大，培養(yǎng)第2天DC不足1%，培養(yǎng)第1，2周分別增加到(24.1±6.0)%和(53.3±14.8)%。     1CML-CP患者DC細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞增殖情況2免疫表型及遺傳學(xué)分析結(jié)果培養(yǎng)14天DC R顯帶染色體分析具有t(9；22)染色體異常，70%80% DC表達(dá)CD1a，而剛分離的CML-CP患者的PBMNC CD1a+細(xì)胞小于1%。IL-2加DC共同培養(yǎng)T細(xì)胞，培養(yǎng)第 2周時(shí)CD8+細(xì)胞為(64.2±20.1)%，CD4+細(xì)胞為(32.1±15.4)%, CD16+細(xì)胞為(3

7、.2±1.6)%，CD2+細(xì)胞大于95%，而CD13+細(xì)胞不到1%，與單用IL-2刺激的T細(xì)胞相比，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。3IL-2加DC共同培養(yǎng)的T細(xì)胞對(duì)自體白血病細(xì)胞的殺傷活性(80.2±12.6)%比單用IL-2培養(yǎng)的T細(xì)胞的殺傷活性(16.3±8.1)%明顯增強(qiáng)(P<0.01)(效靶比為251)，3種效靶比下二者的比較詳見(jiàn)表1。表1CML-CP患者DC加IL-2及IL-2單獨(dú)誘導(dǎo)的T細(xì)胞對(duì)自體CML細(xì)胞的殺傷活性比較組別例數(shù)不同效靶比的殺傷活性(%)11101251IL-2+DC1614.1±8.238.5±10.1

8、80.2±12.6IL-2166.1±4.212.5±7.116.3±8.1P值<0.05<0.01<0.01     46例CML-CP患者DC刺激的T細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞及HLA相合的健康人BMMNC殺傷作用分別為(12.3±5.9)%和(10.2±6.2)%，與對(duì)自體白血病細(xì)胞的殺傷活性相比(81.6±12.1)%明顯減低(P<0.01)(表2)。 表2CML-CP患者DC刺激的T細(xì)胞對(duì)自體CML細(xì)胞、K562細(xì)胞及HLA相合的健康人的BMMNC殺傷活性比較

9、組別例數(shù)不同效靶比的殺傷活性(%)11101251自體CML620.5±8.839.2±10.281.6±12.1K56265.1±4.310.2±6.612.3±5.9健康人BMMNC65.2±4.18.8±6.210.2±6.2P值<0.05<0.01<0.01     注：P值為自體CML細(xì)胞組分別與K562細(xì)胞組及健康人BMMNC之間的比較；K562細(xì)胞組與健康人BMMNC相比，P值均>0.05 討論近年的臨床和實(shí)驗(yàn)研究均已證實(shí)CML

10、患者的骨髓中存在正常的造血祖細(xì)胞，使得用良性造血祖細(xì)胞重建造血成為可能5。這引起了人們對(duì)自體骨髓移植(ABMT)治療CML的極大關(guān)注。但用ABMT治療CML的關(guān)鍵是CML骨髓的體外凈化及良性克隆的篩選擴(kuò)增。應(yīng)用自體抗白血病T細(xì)胞進(jìn)行CML骨髓的體外凈化或于ABMT后進(jìn)行過(guò)繼性免疫治療是行之有效的措施，但特異性抗白血病T細(xì)胞產(chǎn)生的關(guān)鍵是白血病相關(guān)抗原及抗原呈遞細(xì)胞的存在。DC是重要的抗原呈遞細(xì)胞，它增強(qiáng)T輔助細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)的產(chǎn)生并增強(qiáng)其功能。在GM-CSF、TNF-及IL-4的存在下可以從人的造血祖細(xì)胞中培養(yǎng)出DC6。在本研究中，我們首先從CML-CP患者的外周血中

11、用含有GM-CSF、TNF-、IL-4的培養(yǎng)基培養(yǎng)出DC(CML-DC)。該DC高表達(dá)CD1a抗原，與正常人DC的表型一致，具有t(9；22)染色體異常。這與Choudhury等7報(bào)道的結(jié)果一致。我們還觀察到CML-DC與IL-2共同誘導(dǎo)的T細(xì)胞比單獨(dú)應(yīng)用IL-2誘導(dǎo)的T細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的對(duì)自體CML細(xì)胞的殺傷活性。這說(shuō)明CML-DC一方面由于其起源于白血病祖細(xì)胞而可能帶有白血病相關(guān)抗原，如bcr/abl融合基因的表達(dá)產(chǎn)物P210蛋白，T細(xì)胞能夠?qū)Υ水a(chǎn)生應(yīng)答；另一方面CML-DC同時(shí)也具有正常DC的形態(tài)和功能，能夠?qū)⒆陨頂y帶的抗原加工處理并呈遞給 T細(xì)胞，由此產(chǎn)生針對(duì)白血病細(xì)胞抗原的特異性細(xì)胞毒T

12、細(xì)胞。我們觀察到CML-DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞對(duì)HLA不相合的具有Ph染色體的人K562白血病細(xì)胞產(chǎn)生的殺傷活性非常低，這提示用此法誘導(dǎo)的 T細(xì)胞殺傷活性受MHC限制，而其對(duì)HLA相合的BMMNC的殺傷活性也非常低，體現(xiàn)出CML-DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞的選擇性和特異性抗白血病作用。在CML-CP患者外周血T細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，首先加入IFN-培養(yǎng)24小時(shí)，它能夠抑制CML白血病克隆的生長(zhǎng)，同時(shí)也能促進(jìn) T細(xì)胞的擴(kuò)增。再加入IL-2和DC培養(yǎng)12周，CD13+髓系細(xì)胞不到1%，而CD2+T細(xì)胞占95%以上。這說(shuō)明CML外周血T細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中存在對(duì)白血病細(xì)胞的凈化。作者單位：參考文獻(xiàn)1郭寶強(qiáng)，楊金平，李廣

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