抗氧化性測定方法

1、3. 2. 3 冬棗多酚含量的測定（1）福林-肖卡試劑（Folin-ciocalteu）的配制 稱取100克鎢酸鈉和25克鉬酸鈉，將兩者溶于700mL水中，倒入2L的圓底燒瓶中，再加入50mL85%的磷酸和100mL濃鹽酸，放入幾粒玻璃珠，給燒瓶連上回流冷凝器，用文火回流10h（可不連續(xù)）;回流后用50mL蒸餾水沖洗冷凝管上的附著物，然后取下，加150克硫酸鋰和幾滴溴水（邊加邊搖直至溶液變黃），加熱煮沸15min，（注：最后的顏色應是黃色，不帶絲毫的藍色綠色，發(fā)綠即不得使用）。冷卻后轉移到1L的容量瓶中，用水定容至刻度，過濾貯存于棕色瓶中備用（2）多酚標準曲線的繪制 取潔凈干燥試管7支，分別標

2、號0-6，分別加入預先配制的0.4mg/mL的沒食子酸0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.35mL，再分別加入雙蒸水，2，1.95，.1.9，1.85，1.8，1.75，1.7，1.65mL。將儲存?zhèn)溆玫母Ａ中たㄔ噭┫♂?倍，于7支試管中分別加入1mL，將7支試管振蕩搖勻，靜置3-4min，再于7支試管中分別加入10%的碳酸鈉各1mL，放入25恒溫水浴中2h。進行全波長掃描，在765 nm處有最大吸收波長，在此波長下測定不同濃度標準溶液的吸光值，繪制多酚濃度與吸光度的標準曲線。 （3）測定 將上述八種原液稀釋相應倍數(shù)之后，各取0.1mL于試管中，在各加入1.99mL雙蒸水，其

3、余操作同標準曲線繪制，于765nm波長處測定吸光值。2.3.2 多酚含量測定2.3.2.1 多酚標準曲線的制作5準確稱取沒食子酸標準品200mg，加少量70%乙醇將樣品溶化，用70%乙醇定容至100mL，搖勻，靜置。再用移液器吸取20mL，用70%乙醇定容至100mL，搖勻，配成濃度為400µg/mL的沒食子酸標準溶液，待用。準確吸取濃度為的沒食子酸標準溶液0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.35ml于試管中。分別加入蒸餾水2.0,1.95,1.9,1.85,1.8,1.75,1.65ml， 再各加入福林試劑1ml,充分振蕩后靜置3-4min:，分別加入10%碳酸鈉

4、1ml于25，搖勻置于恒溫水浴中反應2h,同時做試劑空白，于765nm下測定吸光度，以含量對吸光度進行直線回歸，計算回歸方程。2.3.2.2試樣多酚含量的測定將提取液離心，取上清液，按標準曲線繪制的測定方法，依次加入試劑，以試劑空白作參比，用1cm比色皿在765nm處測定吸光度，計算多酚含量。2.2.3.1 總還原能力測定(鐵氰化鉀還原法)1920 還原力法的原理為：K3Fe(CN)6+ 樣品 K4Fe(CN)6+ 樣品氧化物K4Fe(CN)6 + Fe3+ Fe4Fe(CN)63在波長7 0 0 n m 條件下測定吸光度A ，A 越大，則樣品的還原力越大。在2.5ml pH=6.6 磷酸緩沖

5、溶液中加分別入蘆丁標準溶液（0.6mg/ml）：0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3ml，雙蒸水1、0.95、 0.9、0.85、0.8、0.75、0.7ml，再加入1% 鐵氰化鉀1ml，混合物在50恒溫條件下，加熱20min。急速冷卻，加2.5ml 10% 三氯乙酸，3500轉/分離心分離10min。取上層清液2、5ml、雙蒸水2、5ml ，再加0、5ml 0.1%FeCl3，混合均勻，靜置10min 后在波長700nm 下測吸光度A 值,繪制標準曲線。樣品測定：分別取720mg/ml的提取液、維生素C、TBHQ、BHT溶液0.5ml代替蘆丁標準溶液，其他操作同標準溶液的

6、繪制，測定吸光度。結果如圖12、13所示。2.2.3.2清除DPPH自由基的能力測定20DPPH·在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其結構中含有3 個苯環(huán)，1 個氮原子上有1 個孤對電子，呈紫色，在517nm 有強吸收。有自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子被配對而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，而且這種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)是成化學劑量關系的,因此可用于檢測自由基的清除情況，從而評價實驗樣品的抗氧化能力。取0.04mg/ml的DPPH-乙醇溶液1.5ml，加入適量提取液用95%乙醇補足3ml。靜置30min，在517nm處測定吸光度。同時測定維生素C、合成

7、抗氧化劑TBHQ 對DPPH 自由基的清除率，作為對比。清除率 = 1-(A1- A2)/A0×100其中：A1 為加提取液后DPPH 溶液的吸光度；A2 為提取液的吸光度；A0為未加提取液時DPPH 溶液的吸光度。結果如圖14所示。2.2.3.3 清除羥自由基作用的測定2021 通過Fenton反應產生·OH，水楊酸捕獲·OH產生有色物質，該物質在510nm有特征吸收，通過測定水楊酸捕獲·OH所得到的產物，確定·OH的清除率。在10ml試管中加入一定濃度的待測液，然后加入0.3ml6mmol/LFeSO4，1.5ml6mmol/L水楊酸用雙蒸

8、水補齊4.8ml搖勻，最后加入0.3ml 6mmol/LH2O2啟動反應，靜置10min后于510nm處測定吸光度?？紤]到提取液本身的吸光值，做試樣空白，測出扣除試樣空白的吸光度，同時測定空白對照液的吸光度。清除率（%）= (A0 A1+ A2)/ A0其中：A0為未加提取液時溶液的吸光度。A1 為加提取液后溶液的吸光度；A2 為提取液的吸光度。結果如圖15所示。2.2.3.4 超氧陰離子清除率的測定超氧陰離子自由基是生物體內和食品體系中起主要作用的自由基，因此，測定提取液對超氧陰離子的清除率具有重要意義。待測液清除超氧陰離子能力測定采用鄰苯三酚自氧化法具體操作參照文獻22，稍作修改。取3ml

9、 0.05mol/L Tris-HCL 緩沖溶液(pH = 8.2) ,置于25 水浴中預熱20min ,分別加入同體積不同濃度的待測液溶液和0.6ml 30mmol/L的鄰苯三酚溶液,混勻后于25 水浴中預熱5min ,加入0.5ml 1mol/LHCL 終止反應,于420nm 處測定吸光度A1 。A0 空白對照以同體積的雙蒸水代替樣品,吸光度記為A?？紤]到待測液本身可能在420nm 處有吸收,用同體積的雙蒸水代替鄰苯三酚溶液,得A2 。按下式計算抗氧化劑清除率。清除率=（A0-A1+A2）/A0×100 %式中: A0 為不加樣品的對照值,A1 為加樣品后的測定值,A2 為樣品在

10、體系中的吸光值。測定結果見圖16.2.2.3.5 提取物對亞硝基清除作用的測定23NO2-在酸性條件下與對氨基苯磺酸重氮反應后，再與N-1苯基乙二胺鹽酸鹽偶合生成紫紅色絡合物，在540nm 處有最大吸收，可用比色法測定NO2-的量。分別吸取同濃度的黃酮提取液、維生素C溶液、合成抗氧化劑TBHQ、BHT溶液于25ml容量瓶中，加入5mg/ml的亞硝酸鈉溶液0.5ml，各加入0.4%對氨基苯磺酸1ml，再加入0.2%鹽酸萘乙二胺顯色劑0.5ml，搖勻加水至刻度，靜置15分鐘，測定吸光度。結果如圖17、18所示。3. 2. 4 提取液抗氧化活性的測定（鐵氰化鉀還原法） （1）原理 在波長700nm條

11、件下測定吸光度A，A越大，則樣品的還原力越大。 （2）以沒食子酸為樣品繪制標準曲線 取十支潔凈試管，編號0至9，每支試管中加入2.5mLph=6.6的磷酸緩沖溶液，由0至9分別加入沒食子酸0，40，80，120，160，200，240，280，320，360mg，再分別加入10%鐵氰化鉀1mL。放置于50水浴中加熱20min,然后急速冷卻。再分別加入10%三氯乙酸2.5mL，4000轉/分離心10min。各取上清液2.5mL，再加2.5mL雙蒸水，于700nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。 （3）以蘆丁為樣品繪制標準曲線 取五支潔凈試管，編號0至4，每支試管中加入2.5mLph=6.6的磷酸

12、緩沖溶液，由0至4分別加入蘆丁0，120，160，180，240mg，其余操作同上，繪制標準曲線。 （4）測定 將上述八種原液稀釋相應倍數(shù)之后，各取0.5mL，操作同標準曲線，測定700nm吸光度。2.3.3總抗氧化性的測定方法2.3.3.1 抗氧化性標準曲線繪制(鐵氰化鉀還原法) 8 9以400ug/ml的沒食子酸標準溶液為標準繪制抗氧化性標準曲線。方法如下：在2.5ml pH=6.6 磷酸緩沖溶液中加入沒食子酸標準溶液0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.9ml，用雙餾水補齊到1ml,加入1ml 1% 鐵氰化鉀，混合物在50恒溫條件下，加熱20min。急速冷卻，加2.5ml 10% 三氯乙