抗氧化性測(cè)定方法

1、3. 2. 3 冬棗多酚含量的測(cè)定（1）福林-肖卡試劑（Folin-ciocalteu）的配制 稱取100克鎢酸鈉和25克鉬酸鈉，將兩者溶于700mL水中，倒入2L的圓底燒瓶中，再加入50mL85%的磷酸和100mL濃鹽酸，放入幾粒玻璃珠，給燒瓶連上回流冷凝器，用文火回流10h（可不連續(xù)）;回流后用50mL蒸餾水沖洗冷凝管上的附著物，然后取下，加150克硫酸鋰和幾滴溴水（邊加邊搖直至溶液變黃），加熱煮沸15min，（注：最后的顏色應(yīng)是黃色，不帶絲毫的藍(lán)色綠色，發(fā)綠即不得使用）。冷卻后轉(zhuǎn)移到1L的容量瓶中，用水定容至刻度，過濾貯存于棕色瓶中備用（2）多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取潔凈干燥試管7支，分別標(biāo)

2、號(hào)0-6，分別加入預(yù)先配制的0.4mg/mL的沒食子酸0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.35mL，再分別加入雙蒸水，2，1.95，.1.9，1.85，1.8，1.75，1.7，1.65mL。將儲(chǔ)存?zhèn)溆玫母Ａ中たㄔ噭┫♂?倍，于7支試管中分別加入1mL，將7支試管振蕩搖勻，靜置3-4min，再于7支試管中分別加入10%的碳酸鈉各1mL，放入25恒溫水浴中2h。進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在765 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)下測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值，繪制多酚濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （3）測(cè)定 將上述八種原液稀釋相應(yīng)倍數(shù)之后，各取0.1mL于試管中，在各加入1.99mL雙蒸水，其

3、余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，于765nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。2.3.2 多酚含量測(cè)定2.3.2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作5準(zhǔn)確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品200mg，加少量70%乙醇將樣品溶化，用70%乙醇定容至100mL，搖勻，靜置。再用移液器吸取20mL，用70%乙醇定容至100mL，搖勻，配成濃度為400µg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，待用。準(zhǔn)確吸取濃度為的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.35ml于試管中。分別加入蒸餾水2.0,1.95,1.9,1.85,1.8,1.75,1.65ml， 再各加入福林試劑1ml,充分振蕩后靜置3-4min:，分別加入10%碳酸鈉

4、1ml于25，搖勻置于恒溫水浴中反應(yīng)2h,同時(shí)做試劑空白，于765nm下測(cè)定吸光度，以含量對(duì)吸光度進(jìn)行直線回歸，計(jì)算回歸方程。2.3.2.2試樣多酚含量的測(cè)定將提取液離心，取上清液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的測(cè)定方法，依次加入試劑，以試劑空白作參比，用1cm比色皿在765nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算多酚含量。2.2.3.1 總還原能力測(cè)定(鐵氰化鉀還原法)1920 還原力法的原理為：K3Fe(CN)6+ 樣品 K4Fe(CN)6+ 樣品氧化物K4Fe(CN)6 + Fe3+ Fe4Fe(CN)63在波長(zhǎng)7 0 0 n m 條件下測(cè)定吸光度A ，A 越大，則樣品的還原力越大。在2.5ml pH=6.6 磷酸緩沖

5、溶液中加分別入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.6mg/ml）：0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3ml，雙蒸水1、0.95、 0.9、0.85、0.8、0.75、0.7ml，再加入1% 鐵氰化鉀1ml，混合物在50恒溫條件下，加熱20min。急速冷卻，加2.5ml 10% 三氯乙酸，3500轉(zhuǎn)/分離心分離10min。取上層清液2、5ml、雙蒸水2、5ml ，再加0、5ml 0.1%FeCl3，混合均勻，靜置10min 后在波長(zhǎng)700nm 下測(cè)吸光度A 值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定：分別取720mg/ml的提取液、維生素C、TBHQ、BHT溶液0.5ml代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他操作同標(biāo)準(zhǔn)溶液的

6、繪制，測(cè)定吸光度。結(jié)果如圖12、13所示。2.2.3.2清除DPPH自由基的能力測(cè)定20DPPH·在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其結(jié)構(gòu)中含有3 個(gè)苯環(huán)，1 個(gè)氮原子上有1 個(gè)孤對(duì)電子，呈紫色，在517nm 有強(qiáng)吸收。有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH·的單電子被配對(duì)而使其顏色變淺，在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度變小，而且這種顏色變淺的程度與配對(duì)電子數(shù)是成化學(xué)劑量關(guān)系的,因此可用于檢測(cè)自由基的清除情況，從而評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)樣品的抗氧化能力。取0.04mg/ml的DPPH-乙醇溶液1.5ml，加入適量提取液用95%乙醇補(bǔ)足3ml。靜置30min，在517nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)測(cè)定維生素C、合成

7、抗氧化劑TBHQ 對(duì)DPPH 自由基的清除率，作為對(duì)比。清除率 = 1-(A1- A2)/A0×100其中：A1 為加提取液后DPPH 溶液的吸光度；A2 為提取液的吸光度；A0為未加提取液時(shí)DPPH 溶液的吸光度。結(jié)果如圖14所示。2.2.3.3 清除羥自由基作用的測(cè)定2021 通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，水楊酸捕獲·OH產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm有特征吸收，通過測(cè)定水楊酸捕獲·OH所得到的產(chǎn)物，確定·OH的清除率。在10ml試管中加入一定濃度的待測(cè)液，然后加入0.3ml6mmol/LFeSO4，1.5ml6mmol/L水楊酸用雙蒸

8、水補(bǔ)齊4.8ml搖勻，最后加入0.3ml 6mmol/LH2O2啟動(dòng)反應(yīng)，靜置10min后于510nm處測(cè)定吸光度。考慮到提取液本身的吸光值，做試樣空白，測(cè)出扣除試樣空白的吸光度，同時(shí)測(cè)定空白對(duì)照液的吸光度。清除率（%）= (A0 A1+ A2)/ A0其中：A0為未加提取液時(shí)溶液的吸光度。A1 為加提取液后溶液的吸光度；A2 為提取液的吸光度。結(jié)果如圖15所示。2.2.3.4 超氧陰離子清除率的測(cè)定超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)和食品體系中起主要作用的自由基，因此，測(cè)定提取液對(duì)超氧陰離子的清除率具有重要意義。待測(cè)液清除超氧陰離子能力測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法具體操作參照文獻(xiàn)22，稍作修改。取3ml

9、 0.05mol/L Tris-HCL 緩沖溶液(pH = 8.2) ,置于25 水浴中預(yù)熱20min ,分別加入同體積不同濃度的待測(cè)液溶液和0.6ml 30mmol/L的鄰苯三酚溶液,混勻后于25 水浴中預(yù)熱5min ,加入0.5ml 1mol/LHCL 終止反應(yīng),于420nm 處測(cè)定吸光度A1 。A0 空白對(duì)照以同體積的雙蒸水代替樣品,吸光度記為A?？紤]到待測(cè)液本身可能在420nm 處有吸收,用同體積的雙蒸水代替鄰苯三酚溶液,得A2 。按下式計(jì)算抗氧化劑清除率。清除率=（A0-A1+A2）/A0×100 %式中: A0 為不加樣品的對(duì)照值,A1 為加樣品后的測(cè)定值,A2 為樣品在

10、體系中的吸光值。測(cè)定結(jié)果見圖16.2.2.3.5 提取物對(duì)亞硝基清除作用的測(cè)定23NO2-在酸性條件下與對(duì)氨基苯磺酸重氮反應(yīng)后，再與N-1苯基乙二胺鹽酸鹽偶合生成紫紅色絡(luò)合物，在540nm 處有最大吸收，可用比色法測(cè)定NO2-的量。分別吸取同濃度的黃酮提取液、維生素C溶液、合成抗氧化劑TBHQ、BHT溶液于25ml容量瓶中，加入5mg/ml的亞硝酸鈉溶液0.5ml，各加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸1ml，再加入0.2%鹽酸萘乙二胺顯色劑0.5ml，搖勻加水至刻度，靜置15分鐘，測(cè)定吸光度。結(jié)果如圖17、18所示。3. 2. 4 提取液抗氧化活性的測(cè)定（鐵氰化鉀還原法） （1）原理 在波長(zhǎng)700nm條

11、件下測(cè)定吸光度A，A越大，則樣品的還原力越大。 （2）以沒食子酸為樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取十支潔凈試管，編號(hào)0至9，每支試管中加入2.5mLph=6.6的磷酸緩沖溶液，由0至9分別加入沒食子酸0，40，80，120，160，200，240，280，320，360mg，再分別加入10%鐵氰化鉀1mL。放置于50水浴中加熱20min,然后急速冷卻。再分別加入10%三氯乙酸2.5mL，4000轉(zhuǎn)/分離心10min。各取上清液2.5mL，再加2.5mL雙蒸水，于700nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （3）以蘆丁為樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取五支潔凈試管，編號(hào)0至4，每支試管中加入2.5mLph=6.6的磷酸

12、緩沖溶液，由0至4分別加入蘆丁0，120，160，180，240mg，其余操作同上，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （4）測(cè)定 將上述八種原液稀釋相應(yīng)倍數(shù)之后，各取0.5mL，操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定700nm吸光度。2.3.3總抗氧化性的測(cè)定方法2.3.3.1 抗氧化性標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制(鐵氰化鉀還原法) 8 9以400ug/ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為標(biāo)準(zhǔn)繪制抗氧化性標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法如下：在2.5ml pH=6.6 磷酸緩沖溶液中加入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.9ml，用雙餾水補(bǔ)齊到1ml,加入1ml 1% 鐵氰化鉀，混合物在50恒溫條件下，加熱20min。急速冷卻，加2.5ml 10% 三氯乙