青椒堿對(duì)DEN誘發(fā)大鼠肝癌抑制作用的流式細(xì)胞光度術(shù)分析

1、    青椒堿對(duì)DEN誘發(fā)大鼠肝癌抑制作用 的流式細(xì)胞光度術(shù)分析        摘要：用二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌為動(dòng)物模型，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)觀察中藥青椒堿對(duì)肝細(xì)胞DNA合成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明治療組S期細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少，而G1期細(xì)胞增多，說明青椒堿可阻止癌前病變肝細(xì)胞由G1期向S期進(jìn)程，使其DNA合成受到抑制，阻止細(xì)胞分裂，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝癌起到治療作用。關(guān)鍵詞：DNA；流式細(xì)胞儀；二乙基亞硝胺；肝癌細(xì)胞;青椒堿 Flow Cytometric

2、 Analysis of the Schinifoline's Inhibitionon Rat Hepatoma Cell Induced by DENBai Jinwen (白錦雯), Zhang Ying(張穎), Wu Jing (吳菁)(Beijing University of Traditioanl Chinese Medicine, Beijing 100029)ABSTRACT：In this paper, rat hepatoma was induced by diethylnitrosamine(DEN). The effects of schinifoline

3、on DNA synthesis in hepatoma cell was observed by means of Flow Cytometry. It was showed that schinifoline could help to relieve the cell's quantity on S phase and increase it during G1 phase to S phase. So, schinifoline can treat experimental hepatocarcinogenisis by inhibiting hepatoma cell'

4、;s DNA synthesis and preventing the cytodiaeresis.KEY WORDS: DNA; Flow Cytometry; Diethylnitrosamine; Hepatoma Cell; Schinifoline本實(shí)驗(yàn)所用中藥青椒堿是從蕓香科青花椒的果皮經(jīng)氯仿抽提的中性成分，其內(nèi)含有四喹啉酮類結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分，該類化合物具有抗腫瘤作用1。以往的實(shí)驗(yàn)證明，青椒堿對(duì)肝癌細(xì)胞有一定的阻抑作用和逆轉(zhuǎn)作用。為進(jìn)一步探討上述作用機(jī)理，我們收集各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物肝臟分離肝細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析青椒堿對(duì)癌前病變肝細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞周期的影響。1材料與方法1.

5、1動(dòng)物Wistar大鼠15只，雌雄兼用，購(gòu)于中國(guó)中醫(yī)研究院動(dòng)物室。1.2藥物青椒堿，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)教研室提供。用1%羧甲基纖維素（CMC）配成2%混懸液。1.3動(dòng)物分組與肝癌動(dòng)物模型的復(fù)制將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照、誘癌和治療3個(gè)組。對(duì)照組不做任何處理。誘癌組與治療組分別于第1天經(jīng)腹腔一次性注射致癌啟動(dòng)劑二乙基亞硝胺(DEN，Sigma公司制品，配制成1%DEN生理鹽水溶液)200 mg/kg體重，10 d后第1次口服促癌劑50%CCl4橄欖油溶液2 mL/kg體重，隔3 d第2次口服CCl4。于實(shí)驗(yàn)第4周起自由飲服0.05%苯巴比妥水溶液30 d，治療組同時(shí)每日灌服青椒堿200 m

6、g/kg體重，共20 d。第16周取材進(jìn)行肝細(xì)胞分離。1.4肝細(xì)胞的分離、純化大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，暴露肝臟，門靜脈插管，在無菌條件下以恒溫灌流泵先后灌注沖洗液和0.05%型膠原酶溶液各10 min，按Seglen改良法分離肝細(xì)胞2。1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組肝細(xì)胞周期時(shí)相變化向裝有分離純化肝細(xì)胞的試管內(nèi)加入34 mL無Ca2+、Mg2+PBS液，離心3 min。棄去上清，約留0.5 mL細(xì)胞懸液，振蕩使細(xì)胞分散。用移液管將細(xì)胞迅速注入470%冷乙醇中，置4冰箱固定至少18 h。調(diào)整上述細(xì)胞懸液濃度至109L-1，加入RNA酶A(每樣品50 mg/L)，37水浴中孵育30 min后，立即

7、放入冰箱中，終止RNA酶的作用。加入碘化丙啶(50 mg/L)，進(jìn)行DNA染色，并以人末梢血淋巴細(xì)胞作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，上機(jī)前以尼龍網(wǎng)過濾。BECTON FACS420流式細(xì)胞儀測(cè)定單個(gè)細(xì)胞DNA含量，得出細(xì)胞周期的百分比，t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果從細(xì)胞頻率對(duì)于DNA相對(duì)含量的組方可以看出，正常大鼠肝臟中含有三種具有不同DNA含量倍體水平的肝細(xì)胞群體。第一個(gè)峰為二倍體（2C）DNA含量，第二個(gè)峰是四倍體（4C）DNA含量細(xì)胞群（G1/G0期細(xì)胞），第三個(gè)峰為八倍體（8C）DNA含量的細(xì)胞群，第二與第三峰之間是S期，為4C8C的DNA含量細(xì)胞群。結(jié)果顯示，正常大鼠肝臟以4C肝細(xì)胞群體為主，2C及8C肝細(xì)

8、胞均較少。該結(jié)果與其他研究者的結(jié)果是一致的3。模型組肝細(xì)胞DNA含量發(fā)生明顯改變，主要表現(xiàn)在G1期與S期。4C(G1期)肝細(xì)胞比例下降，4C8C間（S期）的肝細(xì)胞明顯增多，與對(duì)照組相比有顯著差異。治療組G1期肝細(xì)胞比例有所回升，S期肝細(xì)胞數(shù)目明顯減少，與模型組相比有顯著差異(見表1)。表1G1G0組別nG1G0S對(duì)照組571.70±2.354.20±0.50模型組557.87±2.0613.90±0.80治療組564.13±1.46*6.07±1.05*與對(duì)照組比較P<0.05P<0.01；與模型組比較*P<0.05

9、*P<0.013討論DNA是細(xì)胞繁殖遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，腫瘤細(xì)胞快速增長(zhǎng)和分裂，其DNA含量增高程度可視為反映腫瘤細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)3。細(xì)胞增殖是通過細(xì)胞周期來實(shí)現(xiàn)的。我們以往的工作已證明中藥青椒堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性癌前病變肝細(xì)胞有一定的逆轉(zhuǎn)作用4，5。本實(shí)驗(yàn)用FCM的DNA分析技術(shù)探索青椒堿的抗癌機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肝細(xì)胞在正常狀態(tài)下，絕大多數(shù)處于G0期6。模型組經(jīng)DEN啟動(dòng)癌變后，CCl4和苯巴比妥作為促癌劑使得處于G1G0期的肝細(xì)胞進(jìn)入S期，G1期細(xì)胞數(shù)減少，S期細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組，提示其DNA合成旺盛。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，經(jīng)中藥青椒堿治療后的S期細(xì)胞較模型組明顯減少，而G1G0期細(xì)胞增多，說明

10、青椒堿可以阻止肝細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)程，使DNA合成受到抑制和阻斷，造成G1期細(xì)胞的堆積。一般認(rèn)為，G1期物質(zhì)代謝活躍，細(xì)胞體積增大，進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)合成，與DNA合成啟動(dòng)有關(guān)，是調(diào)控細(xì)胞增殖的重要環(huán)節(jié)。G1期可能存在一限制點(diǎn)（R點(diǎn)），細(xì)胞處于不利條件時(shí)就停止在R點(diǎn)，則細(xì)胞無法從G1期進(jìn)入S期6。已有學(xué)者論述，如細(xì)胞被阻斷在G1期，更能有效地控制腫瘤的增殖7。因而我們認(rèn)為抑制DNA合成，阻止細(xì)胞分裂，是青椒堿的抗癌作用機(jī)理之一。 *國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目，課題號(hào)：39370843作者簡(jiǎn)介：白錦雯，女，35歲，醫(yī)學(xué)碩士，講師。作者單位：北京中醫(yī)藥大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室北京100029參考文獻(xiàn)1劉鎖蘭，魏璐雪青花椒化學(xué)成分的研究化學(xué)學(xué)報(bào)，1991，26(1)：8362Seglen POPreparation of isolated rat liver cells In：Prescott DM Methods in Cell BiologyNew York：Academic Press，1987.29833叢文銘，吳孟超，張秀忠肝癌細(xì)胞核DNA含量的定量測(cè)定及其臨床意義第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1988，9(2)：1084葉百寬，張穎，何基淵，等青椒堿對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)影響的實(shí)驗(yàn)研究北京中醫(yī)藥大