純化水細(xì)菌霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證方案(交)

1、純化水細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證方案1 概述：本本法是用于建立微生物檢查法時(shí)，根據(jù)中國(guó)藥典2005年版二部分要求，需對(duì)細(xì)菌、霉菌及酵母菌的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行驗(yàn)證。故計(jì)劃于2006年9月份對(duì)細(xì)菌、霉菌及酵母菌的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行驗(yàn)證。2 原理：根據(jù)不同的樣品，制備成供試液，再將規(guī)定量的供試液通過(guò)膜微過(guò)濾系統(tǒng)真空抽濾，將濾膜進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)形成的菌落計(jì)數(shù)，或通過(guò)采用平皿法對(duì)形成的菌落計(jì)數(shù)，從而了解供試品的微生物含量。3 菌種：大腸埃希菌CMCC（B）44102金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003枯草芽孢桿菌 CMCC（B）65301白色念珠菌CMCC（B）98001黑曲霉CMCC（B）980034 培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)

2、瓊脂培養(yǎng)基 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基 5 試劑：pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液 6 設(shè)備：MILLPORE 微膜過(guò)濾系統(tǒng)7 檢測(cè)方法：7.1菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)37培養(yǎng)18-24小時(shí)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液將培養(yǎng)物制備成菌懸液，用細(xì)菌比濁管比濁，其濁度與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相當(dāng)后，經(jīng)梯度10倍稀釋至10-5-10-7，約為50-100CFU/ml，供活菌計(jì)數(shù)及驗(yàn)證試驗(yàn)用。接種白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中25-28培養(yǎng)18-24小時(shí)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液將培養(yǎng)物制備成菌懸液，用細(xì)菌比濁管比濁，其濁度與

3、標(biāo)準(zhǔn)比濁管相當(dāng)后，經(jīng)梯度10倍稀釋至10-5-10-6，約為50-100CFU/ml，供活菌計(jì)數(shù)及驗(yàn)證試驗(yàn)用。接種黑曲霉孢子液至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)25培養(yǎng)5-7天，加入3-5ml0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸取孢子懸液，用細(xì)菌比濁管比濁，其濁度與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相當(dāng)后，經(jīng)梯度10倍稀釋至10-4，約為50-100CFU/ml，供活菌計(jì)數(shù)及驗(yàn)證試驗(yàn)用。 7.2活菌計(jì)數(shù) 分別取上述大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌10-5-10-7稀釋液各1ml加入平皿，再用不超過(guò)45的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，每個(gè)菌株各測(cè)定2皿，30-35培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)算菌落數(shù)。分別取上述白色念珠菌10-5-

4、10-6稀釋液、黑曲霉10-4稀釋液各1ml加入平皿，再用不超過(guò)45的琥珀紅瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，每個(gè)菌株各測(cè)定2皿，23-25培養(yǎng)逐日觀察計(jì)數(shù)。7.3供試液的制備取供試品10ml加入到pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90ml中，混勻后即為1：10供試液。取上述1：10供試液，加入到pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90ml中，混勻，作為1：100供試液。7.4回收率的測(cè)定薄膜過(guò)濾法：.試驗(yàn)組：取適量無(wú)菌注射用水注入開(kāi)放式濾杯中以濕潤(rùn)濾膜，后取1：100供試液100ml、50-100cfu試驗(yàn)菌同時(shí)加入濾杯中，抽濾，后將濾膜夾入到適宜試驗(yàn)菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基平皿中，共制備兩張濾膜，置規(guī)定溫度培養(yǎng)

5、規(guī)定時(shí)間，逐日觀察結(jié)果。.菌液組：取適量無(wú)菌注射用水注入開(kāi)放式濾杯中以濕潤(rùn)濾膜，后取滅菌pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml、50-100cfu試驗(yàn)菌同時(shí)加入濾杯中，抽濾，后將濾膜夾入到適宜試驗(yàn)菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基平皿中，共制備兩張濾膜，置規(guī)定溫度培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間，逐日觀察結(jié)果。.供試品對(duì)照組：取適量無(wú)菌注射用水注入開(kāi)放式濾杯中以濕潤(rùn)濾膜，后取1：100供試液100ml加入濾杯中，抽濾，后將濾膜夾入到適宜試驗(yàn)菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基平皿中，共制備兩張濾膜，置規(guī)定溫度培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間，逐日觀察結(jié)果。8 驗(yàn)證內(nèi)容、方法及限度：8.1 設(shè)備確認(rèn) 檢查驗(yàn)證所使用的設(shè)備的檢定狀，并按下列方式記錄檢查結(jié)果。設(shè)備名稱及型號(hào)產(chǎn)地檢定結(jié)論備注MILLPORE 微膜過(guò)濾系統(tǒng)美國(guó) 檢查純化水的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)測(cè)定的方法驗(yàn)證所需文件。文件名稱存放處微生物限度（細(xì)菌、霉菌、酵母菌含量）測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)操作細(xì)則三聯(lián)式Microfil過(guò)濾系統(tǒng)使用標(biāo)準(zhǔn)操作細(xì)則中華人民共和國(guó)藥典2005年版二部8.2回收率的計(jì)算按如下公式計(jì)算試驗(yàn)組的加菌回收率： 試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)試驗(yàn)組的加菌回收率 ×100% 菌液組的平均菌落數(shù)8.2試驗(yàn)限度經(jīng)