北冬蟲夏草發(fā)酵液中蟲草素和腺苷含量的HPLC分析

1、上海農業(yè)學報2005,21(4:5356Acta Agriculturae Shanghai文章編號:100023924(200504253204北冬蟲夏草發(fā)酵液中蟲草素和腺苷含量的HPLC分析張紅霞1,吳畏23,陳偉2,高新華2,唐樂珊2(1沈陽農業(yè)大學生物技術學院,沈陽110161;2上海市農業(yè)科學院植物保護研究所,上海201106摘要:試用高效液相色譜法同時檢測了5株北冬蟲夏草菌株發(fā)酵液中蟲草素和腺苷的含量,并系統(tǒng)地研究了各種發(fā)酵條件對蟲草素和腺苷含量的影響。結果表明,蟲草素和腺苷在所設色譜條件下得到了很好的分離,二組分的線性關系良好,回收率滿意,其中蟲草素峰保留時間為11.443min

2、,腺苷峰保留時間為9.054min;蟲草素的回收率為103.22%,RS D=4.4%,腺苷的回收率為98.42%,RS D=3.2%;蟲草素和腺苷的線性范圍分別為0.4998gm L,0.4692gm L。5株待測菌株發(fā)酵液中的菌絲干重第5天都達到了最大值,其中Cordycepsmilitaris G5124菌株的蟲草素含量第9天達最大值,腺苷含量第1天達最大值。試驗結果還表明,不同菌株發(fā)酵液中的蟲草素和腺苷含量具有明顯差異,這可能與菌株本身的遺傳特性有關。其中C.militaris G(045f菌株的蟲草素含量最高,可用作發(fā)酵生產蟲草素的高功能菌株,進一步試驗表明,當起始pH值為9時該菌株

3、的蟲草素含量達到最高。關鍵詞:北冬蟲夏草;發(fā)酵液;蟲草素;腺苷;HP LC分析中圖分類號:S432.4+4文獻標識碼:A北冬蟲夏草(Cordyceps militaris為冬蟲夏草同屬的真菌,而且它是已報道的350余種蟲草菌中惟一能大量形成蟲草素的種。其主要化學成分和藥理作用與冬蟲夏草基本相似1,2,是冬蟲夏草最理想的代用品。蟲草素和腺苷是北冬蟲夏草的主要活性成分3。據(jù)報道4,5,北冬蟲夏草發(fā)酵液對哮喘及支氣管疾病、抗腫瘤、免疫調節(jié)、增強腎衰竭病人的腎功能等方面都有很好的治療效果,且抗疲勞作用顯著。1998年以來對北冬蟲夏草子實體及其菌絲中蟲草素和腺苷含量測定的報道較多3,4,但國內外對發(fā)酵液

4、中這2種成分同時進行含量測定,并研究發(fā)酵條件對蟲草素和腺苷含量影響的報道較少。中華人民共和國藥典2005版僅對腺苷的測定方法進行敘述6,而蟲草素的測定方法目前尚無標準。本研究試用高效液相色譜法同時定量測定5個北冬蟲夏草菌株發(fā)酵液中蟲草素和腺苷的含量,并系統(tǒng)地研究各種發(fā)酵條件對蟲草素和腺苷含量的影響,擬用于制劑的質量控制和評價。本文報道該項研究結果。1材料與方法1.1材料1.2方法收稿日期:2005-09-23初稿;2005-10-17二改稿基金項目:國家農業(yè)科技成果轉化資金項目,國家級星火計劃項目3通訊作者 0.22m 微孔濾膜壓濾后檢測。另將沉淀用蒸餾水洗滌3次,置80干燥箱中烘干至恒重,稱

5、重。計算出每100m L 發(fā)酵液中菌絲體干重(g 。0.8m L min ,檢測波長260nm ,進樣量10L ,溫度30。液系列,腺苷標準品配制成濃度為0.46,1.84,9.22,23.05,46.10,92.20g m L 的標準液系列。和腺苷含量。2結果與分析2.1蟲草素和腺苷含量的HP LC 測定由圖1的色譜結果可以看出,蟲草素和腺苷在本試驗設置的色譜條件下得到很好的分離。蟲草素峰保留時間為11.443min ,腺苷峰保留時間為9.054min 。蟲草素的回收率為103.22%,RS D =4.4%,腺苷的回收率為98.42%,RS D =3.2%;蟲草素和腺苷的線性范圍分別為0.4

6、998g m L ,0.4692g m L 。二組分的線性關系良好,回收率滿意。2.2不同培養(yǎng)時間對5個菌株菌絲體干重的影響圖2的結果顯示,發(fā)酵液中5個菌株的菌絲干重隨著時間的增長呈上升趨勢,第5天達到菌絲干重的最大值,第6、7天趨于平緩,第8天開始菌絲體干重呈下降趨勢。5個菌株的菌絲干重最大值依次如下 :45上海農業(yè)學報21卷C .militaris G 5124(1.5127g >C .militaris G (0413(1.2121g >C .militaris G 4129(1.145g >C .militaris G (045f (0.8510g >C .mi

7、litaris G 3925(0.7745g ,同時可看出不同的菌株菌絲體的干重雖然不同,但生長的趨勢近乎相同。2.3不同培養(yǎng)時間對“C .militaris G 5124”菌株培養(yǎng)液中蟲草素和腺苷含量的影響圖3的結果表明,培養(yǎng)液中的蟲草素從第1天就開始產生,第4天后呈線型上升,到第9天蟲草素含量達最大值49.54g m L ,第10天再測,蟲草素含量沒有明顯變化,這與溫魯報道的結果基本一致。腺苷第1天含量達到最大值11.45g m L ,第4天后含量減為1.55g m L ,幾乎成線型下降,第10天再測,腺苷含量沒有明顯變化,始終處于較低水平。2.4起始pH 值對北冬蟲夏草合成蟲草素和腺苷能

8、力的影響圖4的結果所示,發(fā)酵液中的蟲草素和腺苷在pH 值410范圍內具有廣泛的適應性,但不同的pH 值對發(fā)酵液中的蟲草素和腺苷含量具有一定的差異。在pH 值49時,蟲草素含量呈快速上升趨勢,而在pH 值910時呈下降趨勢,其中pH 值為9時發(fā)酵液中的蟲草素含量為最高值。在不同的pH 值下發(fā)酵液中的腺苷含量始終保持較低水平或變化不明顯。 2.5蟲草素和腺苷合成能力較高的菌株的篩選由表1結果可見,不同菌株培養(yǎng)液中的蟲草素和腺苷含量具有明顯差異,其中C .militaris G (045f 菌株發(fā)酵液中的蟲草素含量最高,為232.27g m L ,C .militaris G 4129菌株的蟲草素含

9、量最低,為0.74g m L ;C .militaris G 3925菌株腺苷含量較高,為3.75g m L ,C .militaris G 5124菌株的腺苷含量相對較低,為1.59g m L 。不同菌株的蟲草素和腺苷含量與菌絲干重未見明顯相關性(圖1和表1表1不同菌株對培養(yǎng)液中蟲草素和腺苷含量的影響T able 1E ffects of different strains on cordycepin and adenosine contents in ferm entation supernatant菌株編號C .militaris strain N o.蟲草素含量(g m L C ord

10、ycepin content腺苷含量(g m L Aden osine content 菌絲干重(g Dry weight of m ycelium G (041311.471.87 1.15G (045f 232.271.83 1.08G 512449.54 1.59 1.443討論3.1檢測北冬蟲夏草發(fā)酵培養(yǎng)液中蟲草素和腺苷含量的最佳色譜條件,色譜柱:K romasil 10025C18柱(4.6mm ×250mm ,5m ;流動相:水甲醇=8515,流速0.8m L min ;檢測波長260nm ,進樣量10L ,溫度30。發(fā)酵培養(yǎng)的第9天為蟲草素含量測定的最適時間,第12天為

11、腺苷測定的最佳時間。發(fā)酵培養(yǎng)液中的蟲草素和腺苷在pH410范圍內具有廣泛的適應性,但在pH 值為9時,檢測的蟲草素含量為最高,北冬蟲夏草的554期張紅霞等:北冬蟲夏草發(fā)酵液中蟲草素和腺苷含量的HP LC 分析中國菌物學會首屆藥用真菌產業(yè)發(fā)展暨學術研討會論文集:“提高蛹蟲草培養(yǎng)物中蟲草素含量的研究”。 65上海農業(yè)學報21卷這種性質與溫魯報道的結果基本一致。3.2發(fā)酵液中5個菌株的菌絲干重,第8天開始菌絲干重呈下降趨勢,究其原因可能是菌株在有限的營養(yǎng)濃度內,菌絲體達到最大增長限度后,自身開始產生或外溢一些代謝副產物和中間產物,并伴隨著菌絲體自溶現(xiàn)象所致9。3.3本文首次報道了不同培養(yǎng)時間對C.m

12、ilitaris G5124菌株培養(yǎng)液中蟲草素和腺苷含量的影響,但在培養(yǎng)液中蟲草素的含量為什么隨著時間的增長而增加,而腺苷的含量為什么隨著時間的增長而減少,這一現(xiàn)象是否能用Suhadolink等的試驗結果作以解釋,即腺苷是蟲草素(32脫氧腺苷的直接前體或部分腺苷的減少主要用于32脫氧腺苷的合成前體10,這一原因還有待于我們按照Suhadolink等的方法重復試驗,再作進一步的研究證明。3.4試驗首次發(fā)現(xiàn)了不同菌株培養(yǎng)液中的蟲草素和腺苷含量具有明顯差異,這一結果意味著菌株產生蟲草素和腺苷的水平與菌株自身的遺傳特性密切相關。研究結果還證明了C.militaris G(045f菌株是一株用于發(fā)酵生產

13、蟲草素的高功能菌株,它對于蟲草素和腺苷的規(guī)?；崛」に嚪浅５挠袃r值,本試驗為進一步研究開發(fā)蟲草素提供了相關參數(shù)。參考文獻1李祝,劉愛英,梁宗琦.蟲草菌素的生物活性及檢測方法J.食用菌學報,2002,9(1:5762.2張平,朱述均,錢大順,等.北冬蟲夏草功能成分及保健作用分析J.江西農業(yè)科學,2003,(6:105107.3陳千良,甘志杰,孫文基.HP LC法測定人工蛹蟲草子實體中蟲草素J.西北大學學報,2003,10(5:569571.4郭澄,朱杰,張銳,等.高效液相色譜法測定人工蟲草菌絲中腺苷和蟲草素含量J.中國中藥雜志,1998,23(4:632633.5劉煒.冬蟲夏草發(fā)酵2蟲草菌絲體N

14、.中國食品報,2003-5-13.6國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(2005版一部M.北京:化學工業(yè)出版社,2005,75.7方中達編.植病研究方法(第三版M.北京:中國農業(yè)出版社,1998,137140.8姜明蘭,鐘文田.北冬蟲夏草人工栽培技術研究J.遼寧農業(yè)科學,1995,(1:5456.9俞大紱,李季倫編.微生物學(第二版M.北京:科學出版社,1978,428431.Analysis of Cordycepin and Adenosine Contents inFermentation Supernatant of Cordyceps militaris by HP LCZH ANG H ong2xia1,W U W ei2,CHE N W ei2,G AO X in2hua2,T ANG Le2shan2(1School o f Biotechnology,Shenyang Agricultural U