實(shí)驗(yàn)四提的蘿蛋白酶的分子量的鑒定080616

1、實(shí)驗(yàn)四 提純的菠蘿蛋白酶的分子量的鑒定一 SDS-PAGE一？ 目的：1、學(xué)習(xí)和掌握電泳(PAGE和SDS- PAGE)的基本原理及電泳技術(shù)。2、熟練掌握SDS-PAGE有關(guān)試劑配制的技術(shù)。二. 原理：電泳 的概念：帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳 (electrophoresis ，簡稱EP)。用電泳技術(shù)分離、分析蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子，有較 高的分辨率，目前已成為生物科學(xué)研究中必不可少的手段之一。影響電泳的主要因素泳動(dòng)速度是一個(gè)物理常數(shù)，可用來鑒定蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)以及研究它們的一些性質(zhì)。 影響泳動(dòng) 速度的因子有顆粒的性質(zhì)、電場強(qiáng)度和溶液的性質(zhì)等。(1

2、 )顆粒性質(zhì) 一般說來，顆粒帶凈電荷量越大，或其直徑越小，或其形狀越接近球形，在電 場中的泳動(dòng)速度就快。反之，則越慢。(2 )電場強(qiáng)度 電場強(qiáng)度越高，帶電顆粒的泳動(dòng)速度越快。反之，則越慢。(3 ) pH值 對(duì)蛋白質(zhì)而言，溶液的pH值離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，其帶凈電荷量就愈大，從而泳動(dòng) 速度就越快。反之，則越慢。4 )離子強(qiáng)度溶液的離子強(qiáng)度一般在0.02-0.2mol/kg之間電泳較合適。若離子強(qiáng)度過高，則會(huì)降低顆粒的泳動(dòng)度。其原因是，帶電顆粒能把溶液中與其電荷相反的離子吸引在自己周圍形成離子擴(kuò)散層。這種靜電作用的結(jié)果，導(dǎo)致顆粒泳動(dòng)速度降低，則緩沖能力差，往往會(huì)因溶液pH 值變化而影響泳動(dòng)的速率。5 )

3、溶液粘度 泳動(dòng)度與溶液粘度是成反比例關(guān)系。因此，粘度過大或過小，必然影響泳動(dòng) 速度。(6 )電滲當(dāng)支持物不是絕對(duì)惰性物質(zhì)時(shí)，常常會(huì)有離子基團(tuán)如羧基、磺酸基、羥基等吸附 溶液中的正離子，使靠近支持物的溶液相對(duì)帶電。在電場作用下，此溶液層會(huì)向負(fù)極移動(dòng)。反之, 若支持物的離子基團(tuán)吸附溶液中的負(fù)離子，則溶液層會(huì)向正極移動(dòng)。溶液的泳動(dòng)現(xiàn)象稱為電滲。 因此，當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向與電滲方向一致時(shí)，則加快顆粒的泳動(dòng)速度；當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向與電滲方向相反時(shí)則降低顆粒的泳動(dòng)速度。(7 )焦耳熱 電泳過程中釋放的熱量與電流強(qiáng)度的平方成正比。當(dāng)電流強(qiáng)度或電極緩沖液中 離子強(qiáng)度增高時(shí)，電流強(qiáng)度會(huì)隨著增大。這不僅降低分辨率，而

4、且在嚴(yán)重時(shí)會(huì)燒斷濾紙或融化瓊 脂糖凝膠支持物。/(8 )篩孔 支持物瓊脂和聚丙烯酰胺凝膠都有大小不等的篩孔，在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒泳動(dòng)速度快。反之，則泳動(dòng)速度慢。除上述影響泳動(dòng)速度的因子外，溫度和儀器裝置等因子的影響也應(yīng)考慮。聚丙烯酰胺凝膠電泳 是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳。這種凝膠是由丙烯酰胺單體(acrylamide ,簡稱Acr)和交聯(lián)劑N , N '-甲叉雙丙烯酰胺(N , N ' -methylena bisacrylamide ,簡稱Bis),在催化劑的作用下聚合而成的。 Acr和Bis在它們單獨(dú)存在或 混合在一起時(shí)是穩(wěn)定的，但在具有自由基團(tuán)體系時(shí)，它

5、們就聚合。聚丙烯酰胺凝膠聚合的體系有兩種，即化學(xué)聚合和光聚合。這里介紹化學(xué)聚合。化學(xué)聚合 的引發(fā)劑是過硫酸銨(NH 4 ) 2 S 2 O 3 (簡稱Ap)，催化劑是N , N , NN / -四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine ，簡稱 TEMED)。在催化劑 TEMED的作用下，由過硫酸銨(Ap)形成氧的自由基，后者又使單體形成自由基，從而引起聚合作用。TEMED 在低pH時(shí)失效，會(huì)使聚合作用延遲，冷卻也可使聚合速度變慢。一些金屬抑制聚合，分子氧阻止鏈的延長，妨礙聚合作用。這些因素在實(shí)際操作時(shí)都應(yīng)予以控制。聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)：為丙烯酰胺單位構(gòu)成的長鏈，鏈與鏈

6、之間通過甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起。鏈間縱橫交錯(cuò)，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠具有分子篩性能。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品的擴(kuò) 散運(yùn)動(dòng)，使凝膠具有良好的抗對(duì)流作用。此外，長鏈上富含酰胺基團(tuán)，使其成為穩(wěn)定的親水凝膠。 該結(jié)構(gòu)中不帶電荷，在電場中電滲現(xiàn)象極為微小。這些特點(diǎn)，使得聚丙烯酰胺特別適于作區(qū)帶電 泳的支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量主要由凝膠濃度和交聯(lián)度決定。每100毫升凝膠溶液中含有的單體(Acr)和交聯(lián)劑(Bis) 總克數(shù)稱為凝膠濃度，用T %表示。凝膠溶液中，交聯(lián)劑(Bis) 占單 體(Acr)和交聯(lián)劑(Bis)總量的百分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度，用C %表示。改變凝膠濃度(T % )和 交聯(lián)度(C % )，可

7、獲得不同密度、粘度、彈性、機(jī)械強(qiáng)度和孔徑大小的凝膠，以便適應(yīng)各種 樣品的分離。一般常用7.5 %濃度的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，而用2.4 %的分離核酸。但根據(jù)蛋白質(zhì)與核酸分子量不同，適用的濃度也不同。聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacryamide gel electrophoresis，簡稱PAGE )根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)的、不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳。連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中，緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下主要有電荷及分子篩效應(yīng)。不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中，由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中的泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、 分

8、子篩效應(yīng)還具有濃縮效應(yīng)。下面就這三種 物理效應(yīng)分別加以說明。(1) 電荷效應(yīng)：各種樣品分子按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場作用下向一定電極，以一定速度泳動(dòng)。(2) 分子篩效應(yīng)：分子量或分子大小和形狀不同的樣品分子，通過一定孔徑分離膠時(shí)，受阻礙程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。分子量小，形狀為球形的分子在電泳過程中受到阻力較小，移動(dòng)較快，反之，分子量大，形狀不規(guī)則的分子，電泳過程中受到的阻力較大， 移動(dòng)較慢。這種效應(yīng)與凝膠過濾過程中的情況不同。(3) 濃縮效應(yīng)： 待分離樣品中的各組分在濃縮膠中會(huì)被壓縮成層，而使原來很稀的樣品得到高 度濃縮。其原因如下： 由于兩層凝膠孔徑不同，樣品向

9、下移動(dòng)到兩層凝膠接口時(shí)，阻力突然加大，速度變慢，這樣就 在兩層凝膠交界處使待分離的樣品區(qū)帶變窄，濃度升高。 在聚丙烯酰胺凝膠中，雖然濃縮膠和分離膠用的都是Tris HCI緩沖液，但上層濃縮膠的pH為6.7 ，下層分離膠的pH為8.9 。 HC1是強(qiáng)電解質(zhì)，不管在哪層膠中，HCI幾乎都發(fā)生電離，C1 -布滿整個(gè)膠體。待分離的樣品加在頂部，浸在pH8.3的Tris- 甘氨酸緩沖液中。 電泳一開始，有效泳動(dòng)率最大的 CI -迅速跑到最前邊，成為快離子(前導(dǎo)離子)。在pH6 . 7條件下解離度僅有0.1-1 %的甘氨酸有效泳動(dòng)率最低，跑在最后面，成為慢離子(尾隨離子)。這樣，快離子和慢離子之間就形成了

10、一個(gè)不斷移動(dòng)的接口。在pH6.7條件下帶有負(fù)電荷的樣品，其有效泳動(dòng)率介于快慢離子之間，被夾持分布于接口附近，逐漸形成一個(gè)區(qū)帶。由于快離子快速向前移動(dòng)，在其原來停留的那部分地區(qū)成了低離子濃度區(qū)，及低電導(dǎo)區(qū)。因?yàn)殡娢惶荻萔、電流強(qiáng)度I和電導(dǎo)率S之間有如下關(guān)系：V=l/S所以在電流恒定條件下低電導(dǎo)區(qū)兩側(cè)就產(chǎn)生了較高的電位梯度，使樣品和甘氨酸慢離子加速前 進(jìn)，追趕快離子。在這個(gè)追趕中被逐漸地壓縮聚集成一條更為狹窄的區(qū)帶。這就是所謂的濃縮效應(yīng)。當(dāng)樣品分子和慢離子都進(jìn)入分離膠后，pH從6.7變?yōu)?.9 ，甘氨酸解離度劇增，有效遷移率迅速加大到超過所有樣品分子， 從而趕上并超過所有樣品分子。 此時(shí)，不連續(xù)的

11、高電位梯度 不再存在。于是此后的電泳過程中，樣品在一個(gè)均一的電位梯度和 pH條件下，僅按電荷效應(yīng)和 分子篩效應(yīng)而被分離。與連續(xù)系統(tǒng)相比，不連續(xù)系統(tǒng)的分離條帶清晰度及分辨率大大提高，因此已成為目前廣泛使用的分離分析手段。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí).它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因 素。1967年，Shapiro等人發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecyl sulfate ，簡稱SDS)，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量M r ,而與所帶電荷和形狀無關(guān)。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量M r的原理是：SDS是

12、一種陰離子表面激活劑，在蛋白質(zhì)溶液里加入 SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原； SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。在一定條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比例為1.4 SDS/1g蛋白質(zhì)。由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電， 使各種蛋白質(zhì)的SDS-復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)原有的電荷 量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)表明，它們?cè)谒芤褐械男螤?，近似于?茄煙形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一

13、樣，約為1.8nm，而長軸則隨蛋 白質(zhì)的M r成正比的變化。基于上述原因，蛋白質(zhì) -SDS復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率，不再 受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只與 橢圓棒的長度 有關(guān)，也就是蛋白質(zhì)Mr的函數(shù)。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì) M r應(yīng)注意以下問題：1 .如果蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物不能達(dá)到1.4 SDS / lg蛋白質(zhì)的比率并具有相同的構(gòu)象，就不能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。影響蛋白質(zhì)和 SDS結(jié)合的因素主要有以下3個(gè)：（1）二硫鍵是否完全被還 原：只有在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被徹底還原的情況下，SDS才能定量地結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上去，并使之具有相同的構(gòu)象。一般以巰基乙醇作還原劑。在有些情況

14、下，還需進(jìn)一步將形成的巰 基烷基化，以免在電泳過程中重新氧化而形成蛋白質(zhì)聚合體。（2）溶液中SDS的濃度：溶液中SDS的總量，至少要比蛋白質(zhì)的量高 3倍，一般需高達(dá)10倍以上。（3）溶液的離子強(qiáng)度：溶 液的離子強(qiáng)度應(yīng)較低，最高不能超過0.26，因?yàn)镾DS在水溶液中是以單體和分子團(tuán)的混合體而存在，SDS結(jié)合到蛋內(nèi)質(zhì)分子上的量，僅決定于平衡時(shí)SDS單體的濃度而不是總濃度，在低 離子強(qiáng)度的溶液中，SDS單體具有較高的平衡濃度。2 .不同凝膠濃度適用于不同的 M r范圍，Weber的實(shí)驗(yàn)指出，在5%的凝膠中，M r為25 000-200 000的蛋白質(zhì)，其Mr的對(duì)數(shù)與遷移率 呈直線關(guān)系；在10 %的凝

15、膠中，Mr為10 000-70 000蛋白質(zhì)，其M r的對(duì)數(shù)與遷移率 呈直線關(guān)系；在15 %的凝膠中，M r為10 000-50 000蛋白質(zhì)，其M r的對(duì)數(shù)與遷移率呈直線關(guān)系；3.33 % （以上各種濃度的凝膠， 其交聯(lián)度都是2.6%）的凝膠可用于 M r更高的蛋白質(zhì)?？筛鶕?jù)所測Mr范圍選擇最適凝膠濃度，并盡量選擇 Mr范圍和性質(zhì)與待測樣品相近的蛋白質(zhì) 作標(biāo)準(zhǔn)蛋白。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率 （蛋白質(zhì)的電泳遷移距離除以染料遷移距離即為相對(duì)遷 移率）最好在0.2-0.8 之間均勻分布。在凝膠電泳中，影響遷移率的因素較多，而在制膠和電泳過程中，很難每次都將各項(xiàng)條件控制得 完全一致，因此用SDS凝膠電

16、泳法測定 Mr，每次測定樣品必須同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而不得利用 另一次電泳的標(biāo)準(zhǔn)曲線。3. 有許多蛋白質(zhì)，是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的， 它們?cè)赟DS和疏基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對(duì)于這一類蛋白質(zhì)，SDS-凝 膠電泳測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的M r，而不是完整分子的 M r。為了得到更全面的資料，還必須用其它方法測定其 M r及分子中肽鏈的數(shù)目等，與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 的結(jié)果相互參照。4 .不是所有的蛋白質(zhì)都能用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定其 Mr，已發(fā)現(xiàn)電荷異常或構(gòu)象 異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì) （如某些糖蛋白）以及一些

17、結(jié)構(gòu)蛋白（如膠原蛋白等） 用這種方法測定出的 Mr是不可靠的。如組蛋白F1,它本身帶有大量正電荷，盡管結(jié)合了正 常量的SDS，仍不能完全掩蓋其原有電荷的影響。它的Mr是21 000，但SDS-凝膠電泳測定的結(jié)果卻是35 000。因此，要確定某種蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，最好用兩種方法互相驗(yàn)證，則更 為可靠。三. 實(shí)驗(yàn)材料純化的菠蘿蛋白酶樣品，低分子量 標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品四. 儀器設(shè)備夾心式垂直板電泳槽直流穩(wěn)壓電電泳儀微量移液器（帶吸嘴）、電子天平。電爐等五. 玻璃器皿及其他試驗(yàn)用品100 mL 燒杯，50 mL 燒杯，1000 mL 燒杯、玻棒，移液管 10 mL、5mL、2mL、0.5mL，漏 斗，濾紙，

18、 試劑瓶（1000 mL、500 mL、250 mL等）、大玻璃培養(yǎng)皿、 具塞刻度試管10mL 藥匙、稱量紙、泡沫、洗耳球、洗瓶。六. 實(shí)驗(yàn)試劑（1 ）30%凝膠貯液：取30g x2=60g丙烯酰胺（Acr八1.6g甲叉雙丙烯酰胺（Bis）,（先 用約100毫升蒸餾水溶解，如溶解不了 ,可加熱30 o C-50 o C 溶解,再用量筒定容 至 200ml，然后過濾，后置于棕色瓶。4 C下保存?zhèn)溆茫?（2）10%過硫酸銨（AP）溶液： 取1g過硫酸銨溶解后，定容至10ml ，現(xiàn)配現(xiàn)用. 1 mol/L HCI :500ml:取濃 HCI 42 ml:,加蒸餾水至 500 ml）（4）分離膠緩沖溶

19、液（1.5mol/L T ris -H Cl 緩沖液，pH8.8 ）:取 18.15g x2=36.3g Tris 溶解后，力卩 1mol/L HCl 溶液約 48ml X 2=96 ml ,調(diào) pH 至 8.8, 定容至 200ml.（ T ris為三羥甲基氨基甲烷或緩血酸銨）.（5）濃縮膠緩沖液（0.5mol/L Tris - HCl 緩沖液,pH6.8）: 取 6g X 2=12g Tris 溶解后， 加 1mol/L HCl 溶液 40x2=80 ml, 調(diào) pH 至 6.8, 定容至 200ml.（6）10%SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液：取5gSDS加水定容至50ml.（加熱溶解）（

20、7）電極緩沖液（0.1%SDS - 0.05mol/L Tris - 0.384mol/L 甘氨酸緩沖液,pH 值 8.3）: 取6gTris,28.8g 甘氨酸（氨基乙酸）和1gSDS加水溶解后，調(diào)p H值至8.3 ，定容至1 L （配好的試劑p H 8.3 ）（8）樣品溶解液：取SDS 2g ，巰基乙醇 5 ml，甘油10ml，溴酚藍(lán)0.1g , 0.5mol/LT ris - HCl緩沖液,p H 6.8（即上述的濃縮膠緩沖液）10ml ，加蒸餾水25ml ，（最 后的總體積為50 ml）,裝于棕色瓶。（9）染色液（0.1%考馬斯亮藍(lán)-45%甲醇-10%冰乙酸溶液）：1g考馬斯亮藍(lán)R25

21、0，力卩 入450 ml甲醇、100ml冰乙酸，用水定容至1000 ml 。（10）脫色液（7.5 %冰乙酸-5%甲醇溶液）：取75ml冰乙酸，50ml甲醇，加水定容至1000ml七實(shí)驗(yàn)步驟1? 清洗玻璃板；2? 安裝好電泳槽（玻璃板）；3? 加入dH20于兩層玻璃之間，檢查玻璃底是否漏水；4?取1g過硫酸銨溶解后，定容至10ml 5?用小燒杯按下表配下層膠（分離膠）,膠濃度12%,混勻，灌膠，高度離梳子約1.52 cm , 然后覆蓋一層dH2O，膠與水分層后，傾倒去水；7? 配上層膠（濃縮膠），膠濃度5%，混勻，灌膠，插入梳子；8? 在凝膠過程中，液面下降，要補(bǔ)充膠液，凝膠時(shí)間約10-20分

22、，凝好膠，拔掉梳子；9? 加入稀釋的電極緩沖液，浸泡至上槽（低玻璃面），但不能高過下槽（低玻璃面），注 意不能漏水；10? 加熱樣品（沸水浴數(shù)處理3-5分鐘）；11? 微量移液器點(diǎn)樣，隔孔點(diǎn)樣，20-35卩l(xiāng)菠蘿蛋白酶樣品，20卩l(xiāng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，注意 不要交叉污染；12? 上槽（低玻璃面）接（），下槽（高玻璃面）接（+ ）;13? 恒電壓電泳： 濃縮膠，180V，約2h ;分離膠，200V，約2h ；14? 取膠，做好記號(hào)（左f右）15? 染色（新制染色液只需染50攝氏度0.3h ），回收染色液。樣品遷移距離前沿（染料）遷移距離16? 脫色：加脫色液50攝氏度23h處理，或常溫脫色數(shù)天,即可看到條帶，測遷移率。17? 畫電泳圖譜，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)蛋白、待測樣品的相對(duì)遷移率18? 用低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求待測樣品亞基的相對(duì)分子量。 電泳遷移率與多肽鏈分子量的常用對(duì)數(shù)有下列關(guān)系：lg M r a b R式中Mr為相對(duì)分子質(zhì)量，a、b都是常數(shù)。實(shí)際測定時(shí)，以幾種