反義阻斷CROC-1基因表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞生長變慢

1、    反義阻斷CROC-1基因表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞生長變慢        摘要目的：建立CROC-1基因表達(dá)被阻斷的FL-CROC-1-細(xì)胞系，研究CROC-1基因在細(xì)胞生長中的作用。方法： 運(yùn)用反義技術(shù)將新近發(fā)現(xiàn)的人泛素綴合酶樣蛋白基因CROC-1的適當(dāng)長度cDNA片斷克隆到本室改建的真核細(xì)胞表達(dá)載體pMAMneo-amp-中，經(jīng)限制性內(nèi)切酶譜分析篩選出反向插入的表達(dá)CROC-1反義RNA的重組質(zhì)粒。將此反義表達(dá)重組質(zhì)粒(pMAM-antiCROC-1)用改良的磷酸鈣法轉(zhuǎn)染人羊膜

2、FL細(xì)胞并用含G418的培養(yǎng)基篩選，測定G418抗性的FL-CROC-1- 細(xì)胞系的生長速度。結(jié)果：建立的FL-CROC-1- 細(xì)胞系在地塞米松誘導(dǎo)下CROC-1基因表達(dá)被反義抑制后，其生長速度較對照FL細(xì)胞及轉(zhuǎn)染了載體pMAMneo-amp- 的FL細(xì)胞(FL-MAMneo)的明顯要慢(P0.05)。結(jié)論：本研究成功地建立了CROC-1基因表達(dá)被阻斷的FL-CROC-1- 細(xì)胞系，并提示CROC-1基因編碼的泛素綴合酶樣蛋白在細(xì)胞生長中起正調(diào)控作用。主題詞 RNA， 反義；遍在蛋白；基因表達(dá)調(diào)控中分類號Q344.13文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1000-4718(2000)07-0577-04 Th

3、e antisense block of CROC-1 gene expression makes cells grow slowerCHEN Jian-ming, YU Ying-nian, CHEN Xing-ruo(Department of Pathophysiology, Medical School of Zhejiang University, Hangzhou 310031， China)Abstract AIM：To establish FL-CROC-1- cell line in which CROC-1 gene expression was blocked and s

4、tudy the role of CROC-1 gene in cell growth. METHODS：The appropriate length cDNA fragment of the recently identified human gene CROC-1 which encodes ubiquitin-conjugating enzyme like protein(Ubc-like protein) was cloned into the reconstructed eukaryotic expression vector pMAMneo-amp- by antisense st

5、rategy. The recombinant plasmid which can express CROC-1 antisense RNA was selected by restriction enzyme map analysis. The antisense expression recombinant plasmid pMAM-antiCROC-1 was then transfected into human amnion FL cells by a modified calcium phosphate-mediated transfection procedure and sel

6、ected with MEM medium containing 400 g/mL geneticin. Finally ,the growth rate of the G418 resistant FL-CROC-1- cell line was determined. RESULTS：When the antisense inhibition of CROC-1 gene expression was induced by dexamethasone, the growth rate of the FL-CROC-1- cell line was obviously slower as c

7、ompared with that of the control FL cell and FL-MAMneo cell which was established by transfection of plasmid pMAMneo-amp- (P0.05). CONCLUSIONS：FL-CROC-1- cell line was successfully established in this study and the result of FL-CROC-1- cell growth suppression suggests that CROC-1 gene encoded Ubc-li

8、ke protein plays a positive regulation role in cell growth.MeSH RNA, antisense； Ubiquitin;Gene expression regulation泛素(ubiquitin)存在于所有真核細(xì)胞中，是一種高度保守的76個氨基酸殘基的蛋白。細(xì)胞蛋白的泛素化修飾起靶向信號(targeting signals)的作用，可使底物蛋白發(fā)生26S蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴性蛋白水解，蛋白的這種及時的選擇性降解在細(xì)胞的許多代謝過程中起關(guān)鍵作用1。泛素需經(jīng)過E1-E2-E3酶促級聯(lián)反應(yīng)才能綴合到底物蛋白，在綴合途徑中，泛素綴合酶(u

9、biquitin-conjugating enzyme,Ubc, E2)起關(guān)鍵作用1。真核細(xì)胞內(nèi)最近還發(fā)現(xiàn)了一類泛素綴合酶樣蛋白(Ubc-like protein)，又名Uev(ubiquitin-conjugating E2 enzyme variant)蛋白，它們在序列及二、三級結(jié)構(gòu)上類似于泛素綴合酶，但缺乏泛素綴合酶催化活性所必需的關(guān)鍵性半胱氨酸殘基，因此，泛素綴合酶樣蛋白不具備泛素綴合活性2。人體細(xì)胞內(nèi)目前已發(fā)現(xiàn)有3種Uev，即Uev-1/Croc-1、Uev-2/hMms2及Tsg101，酵母細(xì)胞中只發(fā)現(xiàn)1種，即Mms2。泛素綴合酶樣蛋白可能是蛋白泛素化的新的調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)以E2酶

10、顯性負(fù)變異體的形式起作用2。遺傳分析發(fā)現(xiàn)酵母Mms2蛋白參與其細(xì)胞內(nèi)的無誤性復(fù)制后修復(fù)(error-free postreplication repair，error-free PRR)通路。泛素綴合酶樣蛋白可能起增加泛素綴合的底物蛋白多樣性及選擇性作用3。本文運(yùn)用反義技術(shù)建立CROC-1基因表達(dá)被阻斷的FL-CROC-1- 細(xì)胞系并對其生長速度進(jìn)行測定。材料和方法一、CROC-1反義RNA表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組有Croc-1B全長cDNA序列的重組質(zhì)粒pBluescript-C1B-pBS-C1B)由加拿大Saskatchewan大學(xué)的W. Xiao博士贈送。經(jīng)ACC (TaKaRa)酶切，

11、切出的840 bp長片斷包含Croc-1B蛋白整個開放閱讀框(open reading frame)，用Klenow片斷(Promega)將此840 bp片斷兩端填平，再用T4 DNA 連接酶(TaKaRa)在片斷兩端連上Sal 連接子(上海生工)，而后經(jīng)Sal (TaKaRa)酶切使其兩端生成Sal 粘性末端，再將其克隆到本室改建的真核細(xì)胞地塞米松誘導(dǎo)表達(dá)載體pMAMneo-amp-4多克隆位點(diǎn)的Sal切點(diǎn)上，最后經(jīng)Nhe (TaKaRa)酶切(在載體多克隆位點(diǎn)的目的片段插入的Sal 位點(diǎn)上游及插入片斷的內(nèi)部第622位堿基處分別有一Nhe 切點(diǎn))并對酶切譜進(jìn)行分析，反向插入的重組子經(jīng)Nhe酶

12、切后應(yīng)該出現(xiàn)228 bp及9 kb二條帶。二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選人羊膜FL細(xì)胞由本室提供，貼壁生長于含10%小牛血清(GIBCO BRL)及青、鏈霉素的MEM(GIBCO BRL)培養(yǎng)液中。用改良的磷酸鈣法5將構(gòu)建好的表達(dá)CROC-1反義RNA的真核細(xì)胞表達(dá)重組質(zhì)粒2030 g轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的FL細(xì)胞，在37、5%CO2條件下用含G418(400 g/mL)的MEM全培養(yǎng)液進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每隔23 d換1次液。同時用空載體pMAMneo-amp-轉(zhuǎn)染FL細(xì)胞，以建立FL-MAMneo細(xì)胞系作為載體對照。三、細(xì)胞生長曲線測定將FL、FL-MAMneo及FL-CROC-1- 細(xì)胞分別以3×104 c

13、ells/mL種于24孔培養(yǎng)板，每種細(xì)胞6組，每組4個復(fù)孔，用含G418(G418工作濃度為200 g/mL, 適用于FL-MAMneo及FL-CROC-1- 細(xì)胞)或不含G418(適用于FL細(xì)胞)的MEM全培養(yǎng)液(含地塞米松，工作濃度為10-5 mol/L，用于誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pMAM-antiCROC-1表達(dá)CROC-1反義RNA)于37、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，從第2 d開始每天計數(shù)，共計6 d。結(jié)果一、CROC-1反義RNA表達(dá)重組質(zhì)粒pMAM-antiCROC-1的建立從pBS-C1B上切出的840 bp長Croc-1B cDNA片斷，重組到pMAMneo-amp-多克隆位點(diǎn)的Sa

14、l 切點(diǎn)上后得到的重組質(zhì)粒，經(jīng)Nhe 酶切，酶切產(chǎn)物瓊脂糖膠電泳后發(fā)現(xiàn)，其中的一個重組質(zhì)粒出現(xiàn)228 bp及9 kb二條帶，說明該重組質(zhì)粒就是反向插入的表達(dá)CROC-1反義RNA的表達(dá)重組質(zhì)粒pMAM-antiCROC-1(見1、2)。     Fig 1Physical map of theCROC-1 antisense RNA expression recombinant plasmid pMAM-anti CROC-1The 840 bp length CROC-1 cDNA fagment was inserted into the Sal s

15、ite of the plasmid pMAMneo-amp- in antisense orientation1CROC-1反義RNA重組表達(dá)質(zhì)粒pMAM-antiCROC-1的物理譜<"t57802 (2177 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309191422185" 261 163>Fig 21% agarose gel electrophoretic analysis of the recombinant plasmid digested with restriction endonucleas

16、esLane 1: GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder(MBI); lane 2: recombinant plasmid digested with Nhe (show 9 kb and 228 bp fragments); lane 3: recombinant plasmid digested with Sal(show 840 bp fragment); lane 4: parental plasmid pMAMneo-amp- digested with Sal; lane 5: DNA /Hind III Marker(MBI)2重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后

17、1%瓊脂糖凝膠電泳分析二、FL-CROC-1- 細(xì)胞系的建立pMAM-antiCROC-1、pMAMneo-amp-分別轉(zhuǎn)染的FL細(xì)胞，經(jīng)G418篩選培養(yǎng)，3周后分別得到10多個抗G418的細(xì)胞集落，而后換以維持性培養(yǎng)液(G418 200 g/mL)繼續(xù)培養(yǎng)并擴(kuò)大成FL-CROC-1-、FL-MAMneo細(xì)胞系，凍存?zhèn)溆?。三、?xì)胞生長曲線測定結(jié)果     Fig 3 The growth curve of FL celll, FL-MAMneo cell and FL-CROC-1- cellFrom the fourth day on , the gr

18、owth rate of FL-CROC-1- cell was obviously slower than that of the control FL cell and FL-MAMneo cell(P0.05).Results are the average cell number from tetramerous samples that are counted3FL、FL-MAMneo及FL-CROC-1- 細(xì)胞的生長曲線細(xì)胞計數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，頭3 d內(nèi)CROC-1基因表達(dá)被阻斷的FL-CROC-1- 細(xì)胞系的生長速度與對照FL及FL-MAMneo細(xì)胞的生長速度無明顯差異，從第4 d開始

19、，F(xiàn)L-CROC-1- 細(xì)胞系的生長速度較對照FL及FL-MAMneo細(xì)胞的明顯要慢，統(tǒng)計分析結(jié)果差異明顯(P0.05)(見3)。討論CROC-1基因最初是因其編碼產(chǎn)物能轉(zhuǎn)錄激活人c-fos原癌基因啟動子而被克隆分離6。人CROC-1/UEV-1基因位于染色體20q 13.2，CROC-1基因通過替換剪接至少可以編碼4種不同的變體，即Croc-1A、Croc-1B、Mac4及Cra6，這4種變體羧基末端90個氨基酸殘基相同，但氨基末端各不相同，氨基末端的差異性可能與蛋白-蛋白的特異性相互作用有關(guān)。Croc-1A和Croc-1B分別為170、221氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，兩者羧基末端的140個氨基酸

20、殘基相一致。人各種類型細(xì)胞中至少能表達(dá)這4種變體中的1種7。Croc-1蛋白雖然在序列和結(jié)構(gòu)上與E2酶相似，但因其在類似于E2酶催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)內(nèi)缺乏關(guān)鍵性半胱氨酸殘基而不具備泛素綴合活性。人結(jié)腸癌HT-29-M6細(xì)胞經(jīng)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)發(fā)生分化時其CROC-1基因表達(dá)降低，而外源性人CROC-1基因在HT-29-M6細(xì)胞中的表達(dá)則可抑制細(xì)胞的分化及有絲分裂激酶cdk1活性，SV40-轉(zhuǎn)化的無限增殖性人胚胎腎細(xì)胞中CROC-1基因高表達(dá)，說明CROC-1基因在哺乳動物細(xì)胞增殖和分化中起作用。在已分析的所有腫瘤細(xì)胞系中CROC-1基因的表達(dá)皆增高，研究發(fā)現(xiàn)CROC-1基因與腫瘤細(xì)胞的無限增殖化表型形成

21、有關(guān)79。本研究運(yùn)用反義技術(shù)阻斷CROC-1基因功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CROC-1基因表達(dá)被阻斷的FL-CROC-1- 細(xì)胞系其生長速度較對照FL及FL-MAMneo細(xì)胞的明顯要慢。培養(yǎng)基中存在的G418及地塞米松并不會對細(xì)胞生長產(chǎn)生影響，因?yàn)橹晦D(zhuǎn)染載體的FL-MAMneo細(xì)胞在G418及地塞米松存在下與FL對照細(xì)胞的生長速度無明顯差異。本研究結(jié)果提示CROC-1基因編碼的泛素綴合酶樣蛋白在細(xì)胞生長過程中起正調(diào)控作用。CROC-1基因能功能性互補(bǔ)芽生酵母mms2缺陷所導(dǎo)致的對各種DNA損傷劑的敏感性及自發(fā)性突變率的升高，說明CROC-1及MMS 2在不同生物中功能是保守的9。已知CROC-1基因的編碼

22、產(chǎn)物能轉(zhuǎn)錄激活人c-fos原癌基因啟動子，c-fos原癌基因的表達(dá)為細(xì)胞抵抗各種DNA損傷劑所必需的，而這很可能是通過無誤性復(fù)制后修復(fù)通路來進(jìn)行的6。CROC-1基因是否與酵母MMS2基因一樣，參與人體細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)過程、維持基因組的穩(wěn)定性，我們將對其作進(jìn)一步研究。基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金資助 (No. 39830210)陳建明(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 浙江 杭州 310031)余應(yīng)年(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 浙江 杭州 310031)陳星若(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 浙江 杭州 310031)參考文獻(xiàn)1陳建明，余應(yīng)年. 真核泛素綴合途徑研究進(jìn)展J.中國病理生理雜志

23、, 2000, 16(2): 175178.2陳建明，余應(yīng)年. 泛素綴合酶樣蛋白的研究概況J. 國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊，1999, 21(6): 333337.3Hofmann RM, Pickart CM. Noncanonical MMS2-encoded ubiquitin-conjugating enzyme functions in assembly of novel polyubiquitin chains for DNA repairJ. Cell, 1999, 96(5): 645653.4Hu W W, Yu Y N, Chen X R, et al. Isolating the cDNA fragment inhibiting nontargeted mutagenesis in vero cell by antisense technologyJ. Chinese Science Bulletin, 1999, 44(6): 533537.5薩姆布魯克 J,弗里奇 E, 曼尼阿提斯T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南M. 第2版. 北京:科學(xué)出版社,1992. 792793.6Rothofsky ML, Lin SL. CROC-1 e