抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體對(duì)肝癌的放射增敏作用(1)

1、抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體對(duì)肝癌的放射增敏作用(1)】 目的: 觀察抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體(VEGF mAb)與不同劑量放射聯(lián)合對(duì)肝癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用. 方法: 將SMMC7721肝癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下,成瘤動(dòng)物分為單純放射20 Gy組、放射20 Gy 抗體組、放射30 Gy 抗體組和對(duì)照組,腹腔給予抗VEGF mAb 50 g/只，隔日1次,共6次,放射劑量一次性給予.測(cè)量腫瘤直徑并計(jì)算瘤體積,抗體給藥結(jié)束后2 wk處死動(dòng)物,免疫組化法測(cè)腫瘤微血管密度(MVD). 結(jié)果: 放射能抑制腫瘤生長(zhǎng),減少腫瘤MVD,放射與抗體結(jié)合對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用更顯著，且放射30 Gy 抗體比放射20 Gy

2、 抗體效果更好.單純放射20 Gy組、放射20 Gy 抗體組和放射30 Gy 抗體組的瘤質(zhì)量抑制率分別為75.3%,83.9%和94.7%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 結(jié)論: 抗VEGF mAb對(duì)放射治療肝癌移植瘤有增敏作用,是肝癌綜合治療的有效途徑之一.【關(guān)鍵詞】 肝腫瘤;放射療法;抗VEGF單抗;放射增敏0引言放射治療腫瘤的目的是盡可能提高腫瘤的放射劑量以殺滅瘤細(xì)胞,但同時(shí)正常組織和器官所受輻射量也相應(yīng)提高,增加了放射治療的副反應(yīng),因而限制了通過提高放射劑量來控制腫瘤的作用.肝癌是放射欠敏感腫瘤,而正常肝組織對(duì)放射線較敏感.單純放射治療肝癌的療效并不理想1.有報(bào)道2抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascul

3、ar endothelial growth factor, VEGF)抗體可以抑制肝癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng),我們觀察抗VEGF mAb與不同放射劑量聯(lián)合對(duì)肝癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用,以了解兩者聯(lián)合應(yīng)用的機(jī)制與方法.1材料和方法1.1材料Balb/cnu/nu小鼠20只(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),56 wk齡,雄性,體質(zhì)量19.022.0 g, SPF層流柜分籠飼養(yǎng); SMMC7721人肝癌細(xì)胞株（武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心）; Monoclonal antiVEGF antibody, produced in mouse, clone 26503.11（Sigma公司）;培養(yǎng)箱（37,50 mL

4、/L CO2）,倒置顯微鏡(XDP1,上海光學(xué)儀器廠),Varian 23EX醫(yī)用直線加速器（美國）,RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液（含100 mL/L胎牛血清,青霉素1105 U/g,鏈霉素100 mg/L）,胰蛋白酶,免疫組化SABC法相關(guān)試劑（武漢博士德公司）.1.2方法1.2.1癌細(xì)胞培養(yǎng)SMMC7721人肝癌細(xì)胞株于25 mL培養(yǎng)瓶中繁殖傳代,細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿瓶壁后移入250 mL培養(yǎng)瓶繼續(xù)傳代繁殖,取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞胰酶消化,2000 r/min離心2 min,收集細(xì)胞用生理鹽水懸浮,顯微鏡下以細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞密度,生理鹽水定容細(xì)胞密度為21010/L.1.2.2癌細(xì)胞種植參考文獻(xiàn)3方法,

5、裸鼠于飼養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)1 d后種植癌細(xì)胞,取裸鼠右后肢大腿外側(cè)皮下為種植點(diǎn),1 mL注射器抽取0.2 mL細(xì)胞懸液（含4106個(gè)細(xì)胞）注入種植點(diǎn)皮下.1.2.3動(dòng)物分組及腫瘤生長(zhǎng)觀察腫瘤種植后1 wk, 可觀察到全部動(dòng)物有明顯皮下腫塊形成,第10日腫塊直徑約5 mm.將動(dòng)物隨機(jī)分為4組,即單純放射20 Gy組、放射20 Gy 抗體組、放射30 Gy 抗體組和對(duì)照組,每組5只.用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫塊長(zhǎng)徑（a）及橫徑（b）,隔日測(cè)量1次,腫瘤體積(V)=ab2/2.1.2.4抗體給予及放射治療以0.2 m針式濾器過濾除菌的PBS液溶解抗VEGF mAb至100 mg/L,于腫瘤種植后10 d分組后腹腔注射

6、抗VEGF mAb, 50 g/只,隔日1次,共6次.單純放射組及對(duì)照組同樣途徑給予等體積量PBS.第4次給予抗VEGF mAb后的第2日行放射治療,放療機(jī)房紫外線消毒,受照動(dòng)物四肢以細(xì)繩固定在小木板上,照射野大小3 cm3 cm,源皮距100 cm,6 MeV電子線,劑量率4 Gy/min,單純放射組劑量20 Gy,放射 抗體組劑量分別為20 Gy和30 Gy,全部放射劑量一次性給予.1.2.5瘤體稱質(zhì)量抗體給藥結(jié)束后繼續(xù)觀察腫瘤生長(zhǎng)2 wk,于腫瘤種植后34 d處死動(dòng)物,仔細(xì)分離腫塊周邊皮膚及非腫瘤組織,瘤體稱質(zhì)量,瘤質(zhì)量抑制率(%)=（1實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量）100.1.2

7、.6免疫組化微血管密度(MVD)測(cè)定將腫瘤組織切成3 mm厚片狀,40 g/L甲醛固定24 h,脫水石蠟包埋,切片厚5 m.免疫組化SABC法:一抗為多克隆兔抗鼠CD34抗體,工作濃度1100稀釋.即用型HighSABC免疫組化試劑盒,具體操作按試劑盒說明進(jìn)行,DAB染色,蘇木素復(fù)染,樹膠封片.選血管內(nèi)皮細(xì)胞染色密集區(qū)于高倍鏡(200)下計(jì)數(shù)染色細(xì)胞,每片計(jì)數(shù)5個(gè)視野取平均值.作者：鄭青平,陳龍華,石玉生 【關(guān)鍵詞】肝腫瘤;放射療法;抗VEGF單抗;放射增敏Radiosensibility of human hepat 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論

8、文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,應(yīng)用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析處理腫瘤體積變化數(shù)據(jù),多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)處理瘤質(zhì)量抑制數(shù)據(jù)和MVD數(shù)據(jù),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1放射和抗VEGF mAb對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用SMMC7721人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)增殖及傳代能力強(qiáng),裸鼠皮下種植成瘤率高,20只動(dòng)物全部成瘤.種瘤后10 d動(dòng)物分組時(shí)各組腫瘤體積無顯著性差異,放射治療前給予抗體4次,腫瘤生長(zhǎng)呈現(xiàn)減慢趨勢(shì),但與非抗體組差異不顯著.放射治療后,單純放射組及放射20 Gy 抗體組

9、腫瘤仍緩慢生長(zhǎng),但放射30 Gy 抗體組腫瘤生長(zhǎng)完全被抑制,腫瘤縮小.種瘤后20 d單純放射組、放射20 Gy 抗體組和放射30 Gy 抗體組腫瘤體積顯著小于對(duì)照組,且放射與抗體聯(lián)合組優(yōu)于單純放射組,此顯著性差異一直持續(xù)至動(dòng)物處死(種瘤后34 d),放射30 Gy 抗體組腫瘤體積小于放射20 Gy 抗體組（表1）.表1放射和抗VEGF mAb對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用(略)bP0.01 vs對(duì)照組;cP0.05 vs單純放射組;eP0.05 vs放射20 Gy 抗體組.2.2瘤質(zhì)量抑制率和MVD單純放射組、放射20 Gy 抗體組和放射30 Gy 抗體組在動(dòng)物處死時(shí)的瘤質(zhì)量抑制率分別為75.3%,83

10、.9%和94.7%,均有明顯抑制腫瘤質(zhì)量增長(zhǎng)作用.放射30 Gy 抗體組瘤質(zhì)量明顯低于單純放射組和放射20 Gy 抗體組.各處理組MVD低于對(duì)照組,放射與抗體聯(lián)合較單純放射組MVD低,MVD在放射20 Gy 抗體組與放射30 Gy 抗體組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2).表2瘤質(zhì)量抑制率與微血管密度(略)bP0.001 vs對(duì)照組;cP0.05 vs單純放射組;eP0.05 vs放射20 Gy 抗體組.3討論SMMC7721肝癌裸鼠移植瘤細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)與人肝癌細(xì)胞特性類似3,移植瘤生長(zhǎng)迅速,未經(jīng)治療的腫瘤生長(zhǎng)速度快,單純放射治療能延緩其生長(zhǎng)速度,聯(lián)合抗VEGF mAb后抑制腫瘤生長(zhǎng)效果更明顯,但

11、單純放射或放射20 Gy加抗體組腫瘤仍呈逐漸加速的生長(zhǎng)趨勢(shì).雖然放射和抗VEGF mAb均能抑制肝癌移植瘤生長(zhǎng),但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示放射30 Gy加抗體是較好的聯(lián)用方式,瘤體生長(zhǎng)停滯并有縮小,對(duì)瘤質(zhì)量和瘤體積的抑制都優(yōu)于低劑量放射組.放射是以腫瘤細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療措施,通過對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺滅來控制其生長(zhǎng).放射在殺滅瘤細(xì)胞的同時(shí)又誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF升高,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞抗拒放射線攻擊,促進(jìn)腫瘤血管形成4;或通過提高腫瘤細(xì)胞基質(zhì)分解酶活性,增強(qiáng)瘤細(xì)胞的侵襲力5,因而放射誘導(dǎo)了腫瘤的保護(hù)機(jī)制,降低瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性.抗VEGF mAb抑制VEGF的表達(dá)和血管形成,使腫瘤賴以生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的血管形成不足,

12、本身具有抗腫瘤作用;又能通過降低VEGF表達(dá)使血管內(nèi)皮細(xì)胞失去免受放射線攻擊的保護(hù),增強(qiáng)瘤細(xì)胞的放射敏感性,因而抗VEGF mAb與放射起到了協(xié)同抑瘤作用6,此協(xié)同作用并不是各自作用的簡(jiǎn)單合并,而是起到了效應(yīng)的放大.研究表明7,抗VEGF mAb的抑瘤作用是暫時(shí)的,停止抗體后腫瘤又會(huì)恢復(fù)原來的生長(zhǎng)活性.因而抗VEGF mAb須與具有細(xì)胞毒作用的治療措施聯(lián)合才能起到協(xié)同作用8.抗VEGF mAb放射增敏的機(jī)制可能比較復(fù)雜,Winkler等9發(fā)現(xiàn),抗VEGF mAb能誘導(dǎo)腫瘤血管出現(xiàn)一個(gè)“血管正?；拇翱谄凇?在此期間內(nèi),腫瘤血管與正常血管功能相似,腫瘤氧水平高,提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)放射的敏感性,因此

13、在窗口期內(nèi)給予放射才能起到協(xié)同抗腫瘤作用. “血管正?；翱谄凇背霈F(xiàn)在抗體治療的1 wk左右,我們也選擇這一時(shí)期給予放射治療,收到了預(yù)期的結(jié)果.血管形成是一個(gè)復(fù)雜的過程,有多種生長(zhǎng)因子參與其中;放射治療又涉及時(shí)間劑量分割方式的不同,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果只是其中可行性組合之一.放射與抗VEGF mAb聯(lián)合治療肝癌取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果,是肝癌綜合治療方法的一條新思路.【參考文獻(xiàn)】1 殷蔚伯,谷銑之. 腫瘤放射治療學(xué)M. 3版. 北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2002:783-784.2 解乃昌,李國威,王志亮,等. 抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝癌的生長(zhǎng)抑制作用J. 中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志, 2002

14、, 9(4):242-245.3 鄭紅,王琳,李靜芳. 裸鼠皮下人肝癌移植瘤模型的建立J. 昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,24(3):39-41.4 Abdollahi A, Lipson KE, Han X, et al. Su5416 and su6668 attenuate the angiogenic effects of radiationinduced tumor cell growth factor production and amplify the direct antiendothelial action of radiation in vitroJ. Cancer Res,2

15、003,63(13):3755-3763.5 Kaliski A, Lassau N, Maggiorella L, et al. Antiangiogenic effect and tumor growth control achieved by an MMPinhibitor combined to radiation in vivo, targeting radioinduced MMP2 enhancement and VEGF modulationJ. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2004, 60(Suppl):368-369.6 Damiano V,

16、 Melisi D, Bianco C, et al. Cooperative antitumor effect of multitargeted kinase inhibitor ZD6476 and ionizing radiation in glioblastomaJ. Clin Cancer Res,2005,11(15):5639-5644.7 單巖,張謙,吳國華. 抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體對(duì)小鼠腎母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 25(16):1534-1535.8 Steiner HH, Karcher S, Mueller MM, et al. Autocrine pathways of the vascular endothelial growth factor (VEGF) in glioblastoma multiforme: Clinical relevance of radiationinduced increase of VEGF levelsJ. J Neuro