抗黃曲霉毒素B1蛋黃抗體的制備及其性質(zhì)的研究

1、    抗黃曲霉毒素B1蛋黃抗體的制備及其性質(zhì)的研究陳福生李根久陳九武羅信昌周啟 摘要將黃曲霉毒B1-牛血清白蛋白(AFB1OBSA)連接物免疫注射4只(A、B、C、D)產(chǎn)蛋雞。研究了抗AFB1蛋黃抗體的產(chǎn)生進(jìn)程，除雞B外，其它3只雞從第一次注射抗原后的第90天開始有較明顯的抗體產(chǎn)生，第135天達(dá)到高峰，從第165天開始下降。在抗體產(chǎn)生高峰期，蛋黃抗體A、C、D的間接ELISA效價分別為18000、16000、16000。以蛋黃抗體A為材料，研究了抗體的特異性，結(jié)果表明：該抗體有較好的特異性。但是抗體與AFB1的結(jié)構(gòu)類似物(AFB2、AFG2、AFG1、

2、AFM1)除AFM1外都有不同程度的交叉反應(yīng)，達(dá)到50%的競爭抑制率時，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的靈敏度分別為6、25、125和2495ng/ml。 關(guān)鍵詞黃曲霉毒素B1抗體產(chǎn)蛋雞酶聯(lián)免疫分析法 中圖分類號R155.31 Studies on the preparation and characters of anti-AFB1 antibody from the yolk of laying hens Chen Fusheng Li Genjiu,Chen Jiuwu,Luo Xingchang,Zhou Qi Agro-Microbiology Key Laboratorie

3、s Huazhong Agricultural University, Wuhan430070，China AFB1O-BSA conjugates were injected into four laying hens(A,B,C and D).The yolk anti-AFB1 antibodies A,C and D produced were obviously increased after 90 days of the first injection,and reached the peak after 135 days,and started dropping after 16

4、5 days.The indirect ELISA titer of yolk antibodies A,C and D were 18000,16000 and 16000 respectively.The specificity of the antibody A was good, but a cross-reaction with AFB2,AFG1,AFG2, with an exception of AFM1,was found.The sensitivities of AFB1,AFB2,AFG1 and AFG2 were 6,25,125 and 2495 g/L respe

5、ctively. Key words:aflatoxin B1, antibody, laying hen, ELISA 前文已報道AFB1抗原的構(gòu)建1，本文將報道抗AFB1蛋黃抗體的制備及其性質(zhì)。以自制的AFB1O-BSA連接物免疫注射產(chǎn)蛋雞獲得了抗AFB1的蛋黃抗體。蛋黃中的抗體是由雞血清中的抗體轉(zhuǎn)移至蛋黃中形成的，它與血清中的抗體具有相同的特異性和靈敏度。從雞蛋中提取抗體不需采血且抗體的量較大，但是用于真菌毒素方面的研究報道甚少2。 1材料與方法 1.1試劑 AFB1OBSA連接物(免疫抗原)AFB1OBSA的摩爾比為6.31；AFB1O-OV連接物(包被抗原)AFB1OOV的摩爾比為6

6、.11，均為自制產(chǎn)品1。完全和非完全弗氏佐劑；黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1及鄰苯二胺均為Sigma公司產(chǎn)品。羊抗兔IgG:HRP酶標(biāo)二抗，瓊脂糖，Tween-20均為華美生物工程公司產(chǎn)品?？ń槊鐬槲錆h生物制品公司產(chǎn)品。其它試劑均為實驗室常用分析純試劑。 1.2實驗動物 產(chǎn)蛋雞，150天齡，1.52.0kg，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物房提供。 1.3儀器與器材 酶聯(lián)免疫檢測儀ZFQ85A型，國營華中電子管廠。 1.4方法 1.4.1免疫方法 以產(chǎn)蛋雞為實驗動物，免疫前從雞翅靜脈采血樣制備血清，與免疫抗原(AFB1OBSA)進(jìn)行瓊脂雙向擴散實驗，淘汰出現(xiàn)免疫沉淀帶的產(chǎn)蛋雞。保留不出現(xiàn)免疫沉淀帶的產(chǎn)

7、蛋雞陰性血清。在注射抗原前一周，皮內(nèi)注射卡介苗以刺激免疫系統(tǒng)，然后每隔30d，分別于第1、30、60、90、120d各注射抗原一次，每次用量1.5ml。在第1、2次注射時與等量的完全弗氏佐劑混勻，以后各次均與等量的非完全弗氏佐劑混勻后注射。于腹部肌肉、背部皮下等處多點注射，重復(fù)數(shù)為4。 1.4.2雞蛋黃抗體的提取2 從雞蛋中小心分離蛋黃，10ml蛋黃液+40ml 0.1mol/L磷酸緩沖生理鹽水(pH7.2)(以下簡稱PBS)+10ml氯仿，混勻，以4500r/min離心30min，取上清液加入PEG-8000，使?jié)舛葹?4%(140mg/g)，沉淀后離心得蛋黃抗體(以下簡稱為IgY)，溶解于

8、10ml PBS中，再以14%(140mg/g)的PEG-8000沉淀后離心以純化IgY，將IgY溶于10ml PBS中，此即為蛋黃抗體添加0.05%疊氮化鈉，4保存?zhèn)溆谩?1.4.3蛋黃抗體效價的測定 用間接非競爭酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)3。 以蛋黃抗體吸光值兩倍于陰性血清吸光值時蛋黃抗體的最大稀釋倍數(shù)作為抗體的效價。 1.4.4抗體的特異性： 用間接競爭ELISA法4。 以競爭抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的毒素濃度作為靈敏度。 2結(jié)果與分析 2.1抗體的產(chǎn)生進(jìn)程 采用多點、多次注射抗原的免疫方法免疫產(chǎn)蛋雞，從第1次注射抗原后的第30天開始每隔15天收集雞蛋，提取蛋黃抗體，按12000稀釋，

9、以間接非競爭ELISA測定吸光值(A)，以A作為縱坐標(biāo)，取樣間隔的天數(shù)為橫坐標(biāo)，如圖1所示得到抗體產(chǎn)生進(jìn)程曲線。 圖1抗體產(chǎn)生進(jìn)程曲線 從圖1可以看出，除雞B外，其它雞都能產(chǎn)生較好的抗體，抗原注射90天后才有較明顯的抗體產(chǎn)生，第135天達(dá)到高峰，從第165天開始下降。 2.2抗體的效價 在抗體產(chǎn)生高峰期，取雞A、C、D的蛋黃抗體(+)及其陰性血清(-)進(jìn)行稀釋，用間接ELISA測定效價，結(jié)果如圖2。表明雞A、C、D的蛋黃抗體效價分別為18000、16000、16000。 圖2間接ELISA測定蛋黃抗體和陰性血清的效價 2.3抗體的靈敏度和特異性 本研究是以AFB1及其結(jié)構(gòu)類似物，黃曲霉毒素B2

10、(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、黃曲霉毒素M1(AFM1)作為競爭抗原，對蛋黃抗體A的靈敏度進(jìn)行了分析，以間接競爭ELISA中抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的毒素濃度為靈敏度，結(jié)果如圖3。 圖3蛋黃抗體A的競爭ELISA抑制曲線 圖中橫坐標(biāo)各點所對應(yīng)的毒素濃度(C)分別：0.0125，0.125，1.25，12.5，125，1250，12500ng/ml。 從圖3可以得出：AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1的靈敏度分別為6、25、125、2495ng/ml和無窮大(即在圖中看不出)，數(shù)值越大靈敏度越差。 抗體的特異性是以AFB1、AFB2、AFG1

11、、AFG2、AFM1的靈敏度與AFB1靈敏度的比值來表示，分別為：1、4.2、20.8、416和無窮大，數(shù)值越大特異性越差，即蛋黃抗體A的特異性按AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1為序，順序降低。 3討論 3.1抗體的靈敏度 靈敏度是衡量抗體質(zhì)量的一個重要的指標(biāo)，表示方法很多，通常是以最低檢出量作為靈敏度，但是在實際應(yīng)用中以最低檢出量為靈敏度時存在著重復(fù)性差的缺點，這樣，在相同的實驗條件下在不同的實驗中，同一種抗體也可能出現(xiàn)多個靈敏度，這顯然是不合理的。本研究以間接競爭ELISA中，當(dāng)抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的毒素濃度為靈敏度，其重復(fù)性好、運用方便。 3.2抗體靈敏度與抗原結(jié)構(gòu)的

12、關(guān)系 黃曲霉毒素是結(jié)構(gòu)很相似的一類化合物，它們都含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰?fù)?。目前已發(fā)現(xiàn)并清楚化學(xué)結(jié)構(gòu)的黃曲霉毒素及其衍生物、異構(gòu)物多達(dá)27種，其中在食品和飼料中常見并對人畜有較大危害的主要是AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2等，它們的結(jié)構(gòu)式如圖4所示。根據(jù)結(jié)構(gòu)式結(jié)合圖3中靈敏度的分析結(jié)果，容易發(fā)現(xiàn)靈敏度主要與雙呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)有關(guān)：圖3結(jié)果表明：AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1的靈敏度分別為6、25、125和2495ng/ml；在結(jié)構(gòu)上AFB2和AFB1的區(qū)別僅是AFB1的C15=C16變成了AFB2的C15C16，而AFB1的靈敏度卻是AFB2的4.2

13、倍。AFM1與AFB1的區(qū)別僅是雙呋喃環(huán)中的C14上多了一個羥基，使AFM1與抗AFB1的抗體不結(jié)合；AFG1與AFB1的氧雜萘鄰?fù)泻艽蟛煌请p呋喃環(huán)沒有差別，AFB1的靈敏度是AFG1的20.8倍，AFG2和AFB1的區(qū)別除了氧雜萘鄰?fù)系淖兓?，雙呋喃環(huán)上的C15=C16變?yōu)镃15C16，AFB1的靈敏度卻是AFG2的416倍，其它幾只雞的蛋黃抗體與雞A的情況基本一致。這些都說明了雙呋喃環(huán)是影響靈敏度的主要因素，這與Pestka的報道相同5。 圖4幾種黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)式* 引自美國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)委員會資料5 3.3抗體的特異性 抗體的特異性反映目標(biāo)抗原和非目標(biāo)抗原對抗體的競爭結(jié)合能力。

14、特異性可以用抗體與非目標(biāo)抗原和目標(biāo)抗原反應(yīng)的靈敏度之比值來衡量，比值越大特異性越差。從理論上特異性越高則抗體對目標(biāo)抗原的識別能力越強而與非目標(biāo)抗原的交叉反應(yīng)越小，這樣在檢測時出現(xiàn)假陽性的概率也越?。坏菍嶋H上即使是單克隆抗體也或多或少會與非目標(biāo)抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，完全沒有交叉反應(yīng)的抗體是不存在的6。就真菌毒素而言，在實踐中抗體的交叉反應(yīng)還有一定的應(yīng)用價值。Gendloff等人在制備抗T2毒素的單克隆抗體時，篩選得到了一系列產(chǎn)生不同特異性抗體的克隆子，他們將特異性差(即與T2毒素類似的其它鐮刀菌毒素有廣泛交叉反應(yīng))的抗體用于檢測鐮刀菌毒素的總量，而特異性較強的抗體用于分析鐮刀菌毒素中的某幾種或某一

15、種毒素，將這些結(jié)果綜合分析，就可得到每種毒素的含量7。本研究得到的抗AFB1OBSA的雞蛋黃抗體對AFB1有較好的特異性，同時也與AFB1的結(jié)構(gòu)近似物AFB2、AFG1、AFG2、AFM1有不同程度的交叉反應(yīng)，其中以與AFB2的交叉反應(yīng)最明顯。以蛋黃抗體A為例，AFB1的靈敏度為6ng/ml，AFB2的靈敏度是25ng/ml，這就是說以蛋黃抗體A運用競爭ELISA檢測樣品的黃曲霉毒素時，假設(shè)有a和b兩個樣品，a樣品含有6ng/ml的AFB1而b樣品只含有25ng/ml的AFB2，但是檢測結(jié)果反映的是兩樣品都含有6ng/ml的AFB1，對b樣品而言這是一個假象即假陽性，其實b樣品只含有25ng/

16、ml的AFB2并不含有AFB1；但是從實踐意義來看，25ng/ml的AFB2對人畜的危害已接近或超過6ng/mlAFB1的毒性，因而這個假陽性應(yīng)該說是"合理的"，是"有應(yīng)用價值的"。 * 湖北省科學(xué)技術(shù)委員會重點課題(No.962P0810) 作者簡介：陳福生，男，博士，講師 李根久湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，430064 作者單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室，武漢430070 參考文獻(xiàn) 1.陳福生，李根久.黃曲霉毒素B1抗原的構(gòu)建.衛(wèi)生研究，1998，27(增刊):133137 2.Clarke J R,Marquardt R R ,Oosterveld,

17、et al.Development of a quantitative and sensitive ELISA for Ochratoxin A using antibodies from the yolk. J Agric Food Chem,1993,41:17841789 3.程知義，周佳敏 編著.醫(yī)用實驗病毒學(xué)，北京：人民軍醫(yī)出版社，1981,69120 4.Tsai G L,Cousin M A.Partial purification and characterization of mold antigens commonly found in food.Appl Envirom Microbiol,1993,8:26632571 5.Pestka J J,Gaur P K,Chu F S.Quantitation of aflatoxin B1 and aflatoxin B1 antibody by an Enzyme-Linked lmmunosorbent Microassay.Appl Envirom Microbiol,1980,10271031 6.Pestka J J