癌細胞DNA和EMA雙標記微波染色技術

1、癌細胞DNA和EMA雙標記微波染色技術g鋤JcA?360-臨床與實驗病理學雜志JCtinExpPathol1996;Nov12('),bf癌細胞DNA和EMA雙標記微波染色技術熊正文李春胡海霞蘇缸高磊巖弓.,叫癌細胞核內DNA含量測定和倍體分析,對于腫瘤的早期診斷,組織學分級,預后判定及治療方案選擇等均有重要的臨床實用內的一種糖蛋白,在腫瘤病理診斷及研究中常常需要了解DNA含量與EMA變化之間EMA雙染的方法進行了研究,現(xiàn)介紹如下.1材料和方法1.1材料選取乳腺癌,胃癌及腸癌等組織用10甲醛固定612h.常規(guī)石蠟包埋,切片4um.烤片(65)1h.常規(guī)脫蠟水化,余試劑均為國產YWY78

2、1A型醫(yī)用微波儀為浙江臨安電子儀器廠生產1.2.1切片常規(guī)脫蠟,蒸餾水洗,1tool?LHC1液(室溫)浸洗12min;1.2.21mol-LHC1(60)水解810rain(事先將HCI在60溫箱內預熱);水冼2次;1.2.4Schiff液.微波(Mw)置5檔,6rain;洗3次,每次2min;洗;l_2.7正常羊血清(1:20)封閉,Mw5檔.3min;l-2.8加EMA(1100),Mw5檔,5min;1.2.9PBS洗2次,Mw5擋.2min;l-2.10加生物素化橋抗(1:200),Mw5檔,5min;1.2.11同1.2.9;1.2.12加LSAB試劑(1:300),Mw5檔,5r

3、ain;1.2.13同1.2.9;1.2.14用DANicl2顯色液顯色710rain,水洗;1.2.15常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封片2結果細胞膜及細胞漿內EMA呈藍黑色.3討論DNA與EMA雙染原理可分為兩步:首先利用當量鹽酸水解DNA,在脫氧戊糖和嘌呤之間斷開.在戊糖的一端形成醛基,當參加SchIff液時,醛基與之結合,在Mw輻射的作用下,使Sch中的sO逸出速度加快,在短時間內形成紫紅色化合物而將細胞核內的DNA顯示出來;第二步是根據抗原抗體特異結合的原理,以EMA單克隆抗體,結臺術顯色",將細胞膜及胞漿中的EMA顯示過單染DNA和EMA發(fā)現(xiàn),該雙染技術比照好,沒有相互掩蓋.量

4、測定和倍體分析是近年腫瘤研究的熱點之一,它與腫瘤的早期診斷,預后及治療方案的性疾病與淋巴結病,自身免疫性疾病等的診斷和研究有著十分重要的意義DNA熊大部分存在干體細胞中,而且不同組織的體細胞核中的DNA含量相同,而EMA主要存在于細胞膜和細胞漿內,同一切片上進行DNA與EMA雙染,可以更直觀,準確地了解細胞I臨床與欒驗病理學雜志.,ClinExpPathot1996;Nov12(4)'361'核與細胞膜,狍漿之間的關系及其與腫瘤類型,預后及分化程度等之間的關系.DNA組織化學染色,后做EMA免疫組化染色,雙染才能成功.如果先做EMA染色,DNA染色時需用HCI水解,水解過程能使

5、DAB與HRP的反響產物溶解,從而達不到雙染的目的.33.2鹽酸水解DNA染色時,需要用鹽酸水解,其濃度,溫度和時間都要嚴格控制.對于不同的固定液,鹽酸水解的時間是不同的.以1O甲醛固定的組織為例,1tool?LHCI60"C水解810rain效果最好,如果溫度高或水解時間長,水解就會過度,DNA著色很淡;如溫度低或水解時間短,脫氧戊糖和嘌呤之間的糖鍵不能斷裂,戊糖的一端不能形成醛基,或形成很少,有時甚至不著色,結果DNA與EMA的比照染色較差.常以DAB作為HRP的顯色荊,其反響產物為棕色或棕黃色.有時顏色較淡,背景較深,與DNA的紫紅色反差小,不易觀察與照相.我們根據金屬鎳能增強

6、過氧化物酶反響敏感性的原理",對常規(guī)的染色方法進行了改良,使反響產物由棕色變?yōu)樗{黑色,與DNA的紫紅色比照明顯.改良后的顯色方法,增強了過氧化物酶的敏感性,而又不改變染色結果".織因醛基與氨基而掩蓋抗原決定簇而影響免疫組化染色的結果,需要用酶,尿素,微波金屬鹽或緩沖液和外表活性劑等來暴露抗原.本研究發(fā)現(xiàn)HCI同樣具有暴露抗原的作用,其原理可能是HCI的水解作用使交聯(lián)斷裂和溶解變性蛋白.因此,在做EMA染色時,不需再做抗原修復處理,同樣可獲得良好的染色效果.胞核內,復染會掩蓋DNA著色,不便觀察.由于EMA分布于細胞漿和細胞膜上,在圖像分析時,通過連續(xù)切片單染DNA與雙染比照,細胞核內DNA著色的圖像分析結果無明顯差異.磁波,其熱效應,化學效應和生物效應可使組化與免疫組化染色時間明顯縮短,且能獲得良好的染色結果.該雙染過程使用Mw儀,減少了長時間染色過程對DNA著色的不良影響,增強了EMA的著色深度.關鍵詞癌細胞DNA微坡標記中國圖書分類號R446參考文獻用.中年病理學梟擊r1992I21:313進殛應用.奎田屯喪虹擔化學技術與妒斷棒堆他?！奎冄杏懴舱撐膮R