精品資料（2021-2022年收藏）美國病理學(xué)會對于二代測序臨床診斷的實驗室標(biāo)準

1、美國病理學(xué)會（CAP）對于二代測序臨床診斷的實驗室標(biāo)準相對于桑格測序來說，二代測序的較高的通量和每個堿基所消耗較低的成本，使得其快速應(yīng)用于臨床檢測領(lǐng)域。盡管在1988年美國病理學(xué)會（CAP）沒有給出這項技術(shù)在臨床診斷上的實驗室標(biāo)準規(guī)范。但在過去的幾年，能夠提供二代測序檢測服務(wù)的實驗室相應(yīng)的不斷增加。目的：針對應(yīng)用二代測序技術(shù)的臨床診斷給出一個檢查清單用以標(biāo)準化實驗操作平臺和生物信息數(shù)據(jù)分析平臺。因為基于NGS的臨床檢測是一個新的診斷技術(shù)，而且相對于一代測序其更為復(fù)雜，所以目前亟需針對這些檢測制定新的標(biāo)準規(guī)范。設(shè)計：針對NGS制定必要的規(guī)章制度，促進這項技術(shù)更好地應(yīng)用于臨床檢測。在2011年CA

2、P成立了NGS工作組委員會，以對檢測清單的項目內(nèi)容進行仔細研究。結(jié)果：在CAP分子病理學(xué)檢測清單中總共包含針對實驗操作平臺和生物信息數(shù)據(jù)分析平臺的18項實驗室認證要求清單。結(jié)論：這項經(jīng)CAP委員會認真考慮后所給的報告陳述了對于制定新的檢測清單的重要性。其中包含文件、批準、質(zhì)保、驗證、異常日志、監(jiān)控升級、各個版本解釋及報告、附帶的發(fā)現(xiàn)、數(shù)據(jù)儲藏、可追溯性模板、數(shù)據(jù)傳送保密性等的處理。DNA測序即二代測序技術(shù)（NGS）由七十年代的化學(xué)測序法和桑格測序法逐漸演化而來。NGS與一代測序主要的不同是其可以并行的對數(shù)以百萬的DNA短片段同時測序而非僅有一種DNA片段。在九十年代中期基于熒光毛細管凝膠電泳的

3、自動化桑格測序的產(chǎn)生使得DNA測序普遍應(yīng)用于臨床診斷。而NGS更高的通量遠遠超過自動化桑格測序。二代測序的較高的通量和每個堿基所消耗較低的成本，使得其快速應(yīng)用于臨床檢測領(lǐng)域，盡管NGS各方面分析都更為復(fù)雜。包括數(shù)據(jù)獲得和儲藏的案例遠超出于1988年臨床檢驗科改善后的實驗室修正案，對于后續(xù)數(shù)據(jù)計算具有較大挑戰(zhàn)性。NGS檢測的領(lǐng)域涉及遺傳病、實體瘤、惡性血液病、傳染性疾病，人類白細胞抗原分析，非侵害性產(chǎn)前診斷，胎兒染色體異常檢測。但在過去的幾年，能夠提供二代測序檢測服務(wù)的實驗室相應(yīng)的不斷增加。盡管在1988年美國病理學(xué)會（CAP）沒有給出這項技術(shù)在臨床診斷上的實驗室標(biāo)準規(guī)范。為應(yīng)對這種需求，CAP

4、成立了NGS工作組委員會，以在這項技術(shù)發(fā)展初期制定第一套臨床檢驗標(biāo)準?？紤]到基于NGS的測序技術(shù)是在原有技術(shù)上對儀器、測序反應(yīng)試劑、生物信息分析等的改進，工作組致力于制定一套用于規(guī)范NGS臨床檢測的工作框架管理標(biāo)準以更好地采納基于NGS的檢測技術(shù)。二代測序技術(shù)由兩部分組成，實驗操作平臺和生物信息分析平臺。實驗操作平臺一般包含所有的以下流程：病人樣品采集處理，核酸提取，片段化，分子標(biāo)簽，外顯子組或基因組靶序列富集，接頭連接，擴增，文庫準備，上樣，序列讀出。序列是通過對數(shù)以百萬的DNA片段的讀取全自動化的產(chǎn)生?；瘜W(xué)實驗反應(yīng)后便是大規(guī)模的計算和生物信息分析。通過各種的算法將測到的短的序列去比對匹配人

5、類參考基因組序列。經(jīng)過圖譜比對后，與參考基因組不同的核苷酸變異被識別出來。另一個獨立進程是去逐一的或組合的根據(jù)其相應(yīng)的臨床表現(xiàn)去分析與臨床相關(guān)的變異類型。對于個別病人案例，已經(jīng)被確認的變異參考其正?；蚬δ苁軗p的注釋內(nèi)容進行評估，如早產(chǎn)轉(zhuǎn)錄因子、截斷蛋白、非同義突變對蛋白功能的影響或剪接位點的改變。為了對疾病和有害突變的關(guān)系做出明智的決定，需要根據(jù)病人的臨床癥狀結(jié)合基因組研究成果。作圖比對、變異識別、變異注釋以及一定程度上的臨床解釋包含了生物信息分析的全部工作框架。CAP NGS工作組考慮到化學(xué)實驗反應(yīng)平臺與生物信息分析平臺是相分離的，所以制定的標(biāo)準也是分開的。一部分實驗室利用國外的設(shè)備去進行

6、一部分的二代測序檢測。一個實驗室提供從實驗操作平臺到生物信息分析，他們臨床檢測的驗證可以整合起來。在CAP分子病理學(xué)檢測清單中總共包含針對實驗操作平臺和生物信息數(shù)據(jù)分析平臺的18項實驗室認證要求清單。NGS檢測項目清單包括對于流程文件建立、批準、質(zhì)保、驗證、異常日志、監(jiān)控升級、各個版本解釋及報告、附帶的發(fā)現(xiàn)、數(shù)據(jù)儲藏、版本可追溯性、數(shù)據(jù)傳送保密性等的處理。如同這份報告中描述一樣，工作組的目標(biāo)就是為NGS檢測服務(wù)提供最初的基本鑒定合格需求。可以預(yù)見的就是只要基礎(chǔ)的檢測驗證規(guī)范需求到位后，隨后便會有附加的其它專門規(guī)程。這些在注釋部分對其進行進一步解決。這項經(jīng)CAP委員會認真考慮后所給的報告陳述了對

7、于制定新的檢測清單的重要性。另外，這份報告可以作為CAP NGS檢測清單的補充，因此內(nèi)容上與2014年檢測清單需求緊密相連。NGS實驗標(biāo)準操作流程文件實驗室需要建立一個標(biāo)準操作流程文件。一個詳實的標(biāo)準操作流程文件是臨床實驗室質(zhì)量評價的主要部分。所有的DNA/RNA樣品準備、片段化、文庫準備、分子標(biāo)簽、樣品混合、合成測序相關(guān)實驗操作必須建立標(biāo)準操作流程文件，這樣才能對每一步及隨后的操作進行追蹤。這包含所有的方法、試劑、儀器、儀器軟件、之前的版本等。另外，對于質(zhì)控標(biāo)準也需要進行描述。一些案例在后面重點提出。NGS靶序列實驗（例如多基因模塊或外顯子測序）可以在測序前對感興趣的基因區(qū)域進行捕獲，關(guān)于捕

8、獲區(qū)域的詳細信息以及富集步驟都應(yīng)以文件的形式進行詳細描述。對于處理不同類型樣品的臨床實驗室，如血液、石蠟包埋的福爾馬林固定的樣本，都應(yīng)該針對不同樣品制定相應(yīng)的SOPs。用于將病人樣本合并的反應(yīng)試劑和規(guī)程必須詳細說明，并且其中應(yīng)包含測序接頭信息。用于對運行好壞的評價的質(zhì)控參數(shù)的權(quán)衡也需要文件化。常用的度量如目標(biāo)區(qū)域內(nèi)Reads數(shù)的比例，質(zhì)量符合規(guī)定的堿基比例，覆蓋度的閾值，平均測序深度。實驗室必須明文規(guī)定好樣品制備和測序的接收或拒收標(biāo)準。最重要的是明確和總結(jié)不能夠進行分析的區(qū)域（如測序深度不充分）。NGS實驗操作平臺驗證實驗室對NGS實驗平臺進行驗證，當(dāng)有所修改變動時，要對整個流程再次進行驗證，

9、確保流程中每一部分的表現(xiàn)符合要求。如在分子診斷領(lǐng)域或臨床實驗室的其他領(lǐng)域，所有的實驗室研發(fā)的測試，對NGS程序性能分析必須在內(nèi)部進行驗證后才可應(yīng)用于臨床。二代測序?qū)嶒炂脚_包含很多步驟，非常復(fù)雜。每一步驟應(yīng)分別根據(jù)經(jīng)驗綜合決定最佳條件和參數(shù)設(shè)置。這些東西設(shè)置好后，必須進行從開始到結(jié)束的全部測試的性能驗證，包括實驗平臺和生物信息分析平臺。在驗證期間需要確定的重要性能有分析的敏感性、特異性、準確度（接近真實值的程度），精確度（重復(fù)性和可靠性），檢測極限。對于任何分子實驗，針對不同的樣品類型（血液、唾液、組織），必須獨立的進行效驗。二代測序檢測是旨在對于基因組的多個大的區(qū)段進行詳細查看。因此，NGS允

10、許檢測到新的，以及已知的序列變異。因為無法證實所有的理論上可能的變異，所以必須將methods-based（其它檢測方法）和analyte-specific（特定分析物）相結(jié)合，作為驗證方法來判定檢測的性能。通過對已發(fā)表的與NGS平臺準確性相關(guān)的文章的咨詢，將有利于對自己實驗室驗證性工作的認知。在大多數(shù)情況下，考慮到桑格測序是金標(biāo)準，可以通過其確定變異位點。然而，在一些情況下變異位點驗證信息也可以通過寡核苷酸微陣列基因分型數(shù)據(jù)獲得。針對于NGS檢測，多個專業(yè)機構(gòu)已經(jīng)發(fā)布了關(guān)于分子檢測驗證的指南以供讀者參考。NGS工作組對于驗證性需求中的最小樣品數(shù)進行了廣泛深刻的討論。對于不斷發(fā)展的NGS技術(shù)以

11、及在診斷實驗室多種多樣的應(yīng)用，這種討論為時過早。而且存在的問題是設(shè)定最小樣品數(shù)對于NGS診斷來說可能會導(dǎo)致其驗證不足。工作組同時也注意到對于已經(jīng)報道的文章里NGS的驗證的樣品數(shù)量有明顯不同（20-80），這表明，individual laboratories are on a validation learning curve.。對于NGS驗證需要運行的樣品總數(shù)量主要取決于檢測的區(qū)域大?。◤募夹g(shù)特性上來說較大的檢測區(qū)域?qū)z測到更多的變異位點）。根據(jù)特異變異位點的數(shù)量進行評估，根據(jù)可能的要求，通過等位基因頻率范圍，去判定檢測的限度，根據(jù)樣品運行次數(shù)和數(shù)量去設(shè)定其精確度。出于統(tǒng)計方面考慮，NGS

12、工作組總結(jié)到關(guān)于樣品數(shù)量不能全面或普遍的應(yīng)用于二代測序的眾多實驗中（如擴增子相對于靶序列捕獲，較少基因量相對于外顯子組和全基因組，遺傳疾病相對于腫瘤相對于傳染?。?。因此我們給出多個腳本（如樣品對methods-based的處理，對樣品重復(fù)性和可靠性的評價，以及臨床樣本用于評估診斷特異性敏感度），每一項都將會需要樣品，而其數(shù)量會隨著實驗背景不同而有所變化。以下我們會突出強調(diào)對需求量及一些性能分析參數(shù)驗證的原則。通過使用methods-based評估分析的靈敏度，目的在于最大化突變序列數(shù)量，相對于金標(biāo)準增加分析的可信度。這些數(shù)值會外推到所有的堿基。對于這種methods-based，致病性變異分析

13、是無關(guān)的，因為這不受技術(shù)檢測能力影響。然而盡量多的利用基因組中的不同區(qū)段去判定基線非常重要，因為序列的背景是一個重要的影響因素。另外實驗室應(yīng)該分別對所有的與檢測相關(guān)的變異類型進行性能分析判定（如SNV，InDel，CNV，結(jié)構(gòu)變異，homopolymers）。適當(dāng)?shù)拇_定變異類型的最大數(shù)量的方法可能會包含內(nèi)部不同研發(fā)測試的累積分析，前提是用相同的鑒定工具。另外，幾個可獲取的公共數(shù)據(jù)庫可以提供外顯子組或全基因組變異位點的識別，以為臨床檢測服務(wù)。另外疾病預(yù)防控制中心和國家生物技術(shù)信息中心合作成立網(wǎng)站，以方便兩個測序基因組以及臨床靶序列數(shù)據(jù)的獲取。這些數(shù)據(jù)庫提供了變異位點的大量設(shè)置，這將有助于得到技術(shù)

14、性能規(guī)范。然而當(dāng)NGS檢測中包含有除了一些更廣泛性的methods-based方法外，一個特異型分析的驗證是有必要的。由此，陽性對照對于NGS檢測所熟識的基因相關(guān)的變異位點（如CFTR基因p.F508缺失變異）引起的疾病極為重要的。特異性分析通常需要陰性樣品進行計算，去定義負數(shù)部分。在整個實驗部分methods-based方法可用于特異性計算分析，如假陽性率的判定。在臨床樣本中它對于判定假陽性數(shù)量同樣具有作用。注意到特異型分析在I類錯誤類型的比例，包括堿基識別錯誤，錯位引起的錯誤，變異識別錯誤。判定檢測限對于一個含有異質(zhì)基因類型的樣品（如腫瘤樣品、用于產(chǎn)前診斷的母親血液，鑲嵌樣品）查詢的實驗是

15、非常重要的。考慮到桑格測序過去一直是在驗證期間的金標(biāo)準，但其靈敏度低于NGS，所以對NGS的靈敏度驗證具有一定挑戰(zhàn)性。樣品混合實驗（已知等位基因頻率的稀釋）應(yīng)該至少用到3個樣品（生物學(xué)重復(fù)）。對于單通道測序儀，內(nèi)部運行的差異性可以通過用相同樣本的不同條形碼檢測（技術(shù)重復(fù)）。同源序列如假基因可以干擾變異位點識別的精確性，這對正確的去分析受影響的基因形成了巨大的挑戰(zhàn)。預(yù)先生物信息同源性分析將會有助于確定來自同源序列可能的干擾。另外，圖譜質(zhì)量可以用于確定有疑問的區(qū)域。如果這種基因包含在NGS測試中，實驗室必須設(shè)計一個方法確保被識別到的變異不是假基因序列，并證明這個方法的準確度。當(dāng)測序池中含有條碼接頭

16、樣品，實驗室必須證明整個平臺中樣品身份的保持。重新驗證和認證的程度依賴于所引進的改變的大小及其潛在的影響。例如一些微小的變化，引進新的捕獲試劑并已經(jīng)得到全面的驗證，可以通過預(yù)期達成的功效進行驗證。在這個例子中如果實驗室測序一個以前測試過的一個樣品并證明其主要運行參數(shù)未改變并獲得了一致的結(jié)果，就可認為這種變化是可接受的。相反的，一個較大的變化，如引進了一個新的測序平臺，或不同的靶序列富集方法，那就需要進行全面的從新驗證。NGS實驗平臺質(zhì)量管理體系NGS實驗平臺遵循一個文件化的質(zhì)量管理體系。CAP認可實驗室必須發(fā)展并遵循一個質(zhì)量管理計劃。CAP所有的共同的檢測清單適用于多?？茖嶒炇?，包含質(zhì)量管理的

17、各個部分和性能檢測方法。NGS實驗平臺質(zhì)控管理程序加入到NGS檢測清單部分，突出NGS實驗室執(zhí)行的特別需求。沒有兩個質(zhì)量管理規(guī)程是相似的。每一個都是根據(jù)實驗室的范疇、診斷市場、專業(yè)知識而形成的，并給與實驗室主任寬泛行動自由去設(shè)計質(zhì)量保障體系。質(zhì)量管理規(guī)程的大綱設(shè)計必須設(shè)計好，并符合設(shè)計類文件。對于NGS實驗室，一個好的質(zhì)量保障大綱應(yīng)包含以下特征：1. 質(zhì)量保障體系應(yīng)遵從工作流程。體系評價應(yīng)在二代測序、分析檢測、序列報告分析發(fā)生之前進行。2. NGS質(zhì)量體系應(yīng)該與整個機構(gòu)的質(zhì)量保障體系相協(xié)調(diào)，如果這個機構(gòu)比較大，如醫(yī)院、醫(yī)療中心，NGS的質(zhì)量體系應(yīng)適從于整個大的體系中。3. 體系應(yīng)該能夠處理在檢

18、測過程中出現(xiàn)的一般性問題。這些問題不但能夠影響檢測結(jié)果，而且使得臨床應(yīng)用與實驗室自身政策規(guī)程不一致。體系文件中應(yīng)包含對每次校正的記錄、效果、操作準則、流程的修正，以避免問題的復(fù)發(fā)。4. 質(zhì)量管理體系宗旨是確保檢測具有臨床意義。因為沒有靈敏度更高的檢測進行比較，所以這對于NGS這樣的檢測尤為重要。檢測指示和分析判斷的適宜性應(yīng)有科學(xué)的醫(yī)學(xué)證明。5. 規(guī)程中應(yīng)鼓勵實驗室工作人員對于實驗室質(zhì)量檢測的意見進行交流。對工作人員的投訴及建議進行調(diào)研必須成為質(zhì)量保障體系中的一部分。NGS結(jié)果驗證實驗室應(yīng)有一項規(guī)定來文件注明報告中的變異位點的檢測驗證。雖然NGS技術(shù)的準確性在不斷提高，但還是普遍認為基于NGS的

19、測序?qū)嶒灂a(chǎn)生假陽性和假陰性的結(jié)果。當(dāng)驗證性實驗是否要進行時，CAP選擇給開展基于NGS測序的實驗室一定的靈活性。如檢測怎樣執(zhí)行，是否建議對額外的家庭成員進行后續(xù)補充檢測，哪些可以基于二代測序哪些不可以等。例如，一些實驗室認為在實驗中測序深度達到標(biāo)準時（如基于單基因的二代測序達到1000乘），或具有較高的可信度，變異位點就沒有必要驗證確認。然而，一些實驗室認為需要另一種可替代的方法對報告中的變異位點進行驗證確認，以達到理想的置信度。另外一些實驗室可能會在預(yù)定的試用期進行驗證確認，過后根據(jù)結(jié)果再對是否進行驗證性實驗進行評估。每一個進行NGS測序的實驗室必須有一項規(guī)程，用來文件解說驗證性檢測工作，

20、或為何不需要進行驗證性工作?；贜GS臨床檢測及變異位點報告的實驗室必須能夠文件證明其符合他們的驗證性實驗規(guī)定，或能夠展示出對NGS實驗不間斷的監(jiān)控證據(jù)，以保證在驗證期間所達到的基準能夠一直保持。CAP也希望在決定用何種方法進行進行驗證性試驗上給予靈活性。盡管桑格測序可能是最為普遍的驗證方法。CAP這樣做是為了檢驗科根據(jù)變異類型和頻率靈活的選擇合適的驗證性檢測方法。實驗室記錄用于實驗的方法、儀器、試劑以及需要分析的樣品可以通過實驗記錄進行確認追溯。對于文件證明復(fù)雜的實驗程序和數(shù)學(xué)算法及對二代測序分析性能解釋，實驗運行的綜合完整記錄是必不可少的。因此，首要的工作框架應(yīng)包含對已歸檔的信息的保存，包

21、括每個病人樣品分析所用的平臺，及實驗所用的試劑、引物、測序反應(yīng)，以便能夠追溯。這些記錄必須包含靶序列檢測的完成情況及其測序深度。同時也有必要記錄分析的細節(jié)，包括任何報道或網(wǎng)站對于相關(guān)參數(shù)的描述，或檢測和報告處理中一些其他信息。雖然所有的分析細節(jié)不必包含在病人的報告中，但是實驗室保存每位病人分析相關(guān)的詳細信息的文件系統(tǒng)是極為關(guān)鍵重要的。異常記錄實驗室保存來自于NGS實驗平臺SOP偏差的病人樣本的異常記錄。實驗室必須文件記錄下任何源自SOP的偏差，并對偏差及產(chǎn)生的結(jié)果進行解釋。樣品預(yù)期的偏差可能包括對收到的樣品或構(gòu)建的文庫未達最佳標(biāo)準，以及測序文庫的濃度未達最佳標(biāo)準。異常情況可能會與樣品質(zhì)量以及分

22、析過程有關(guān)，在樣本登記時，需要對樣品作出評價以便判斷這例樣品是否適合進行檢驗。如果對某一例樣品質(zhì)量有一絲擔(dān)心，應(yīng)記錄在工作單中，并就其與監(jiān)管者或?qū)嶒炇抑魅芜M行交流。實驗室主任可能會繼續(xù)進行檢測，但會將這問題傳達給主治醫(yī)師，并就此進行討論交流。這種情況的一個案例就是沒有在最佳的條件下進行樣品運輸。對于這例樣品的處理決定一般是只有當(dāng)提取的DNA充足時才會進行下一步的檢測。在實驗操作過程中，與具體步驟相關(guān)的問題應(yīng)報告給實驗室主管或主任。然后才能對檢測能否完成進行評估。當(dāng)故障排出之后，如果質(zhì)控運行及樣品結(jié)果合適，結(jié)果可以被實驗室主管解讀，檢測結(jié)果是令人滿意的。檢測問題的方方面面都應(yīng)完整的記錄在異常文件

23、里，包括故障排除，解決方案，以及相關(guān)的交流（誰與誰及日期），這些必須并入到月質(zhì)量保障報告中。有時，實驗室SOP自身需要進行修改以改善措辭，使得工序流程更清楚，或者是去除小的誤差完善操作流程。在這種情況下，所推薦的修改至少應(yīng)有兩個人的支持，包括開發(fā)此項目的實驗室主管和及實驗工程師或相關(guān)專家。在這類修改中，必須經(jīng)過實驗室主任核準，簽字署名，注明日期。本質(zhì)上這并不是一個異常記錄，而是一個對實驗描述的更正。監(jiān)控升級用以產(chǎn)生NGS數(shù)據(jù)的儀器，測序化學(xué)反應(yīng)，試劑或試劑盒等，其相應(yīng)的監(jiān)控、執(zhí)行、文件記載的升級，實驗室需加以規(guī)范。實驗室必須意識到升級，確保沒有在用廢棄掉的方法。實驗室必須出具相關(guān)政策方案去監(jiān)管

24、和執(zhí)行儀器，測序化學(xué)反應(yīng)，試劑或試劑盒等的升級。已經(jīng)驗證的可以提高片段擴增及測序的質(zhì)量、再現(xiàn)性、準確性的一些新的方法不斷地更新發(fā)展，這項規(guī)范應(yīng)解決NGS測序的實驗室去如何確保他們所用的樣品文庫制備實驗是最新的。這項規(guī)范也應(yīng)說明監(jiān)管升級所用的方法以及何時執(zhí)行一個相關(guān)的升級并在臨床應(yīng)用前進一步驗證。例如實驗室的規(guī)范應(yīng)在指定的間隔期（如一季度、半年、一年）進行監(jiān)控并執(zhí)行升級，以增強優(yōu)化實驗性能。此外，執(zhí)行完升級后可能會需要對整個實驗平臺或相關(guān)的實驗步驟進行重新驗證，相應(yīng)的設(shè)定時間間隔期會更方便。生物信息分析過程對于NGS數(shù)據(jù)的分析，各種開源代碼和商業(yè)的生物信息學(xué)算法和軟件都是可獲得的。雖然這些分析工

25、具在不斷改善，他們在診斷分析性能方面都有其強項和弱項。在操作上，適用于NGS數(shù)據(jù)的生物分析過程可以總結(jié)為3個主要步驟。第一步是產(chǎn)生一個包含核酸序列的可讀文件，每個核苷酸都標(biāo)定一個與準確性相關(guān)的數(shù)值（堿基質(zhì)量分值）。產(chǎn)生的序列文件利用特定儀器軟件分析幾個基礎(chǔ)參數(shù)，如運行時的信噪比。序列文件一般以FASTQ文件格式生成，包含每個讀取的堿基種類，自身的標(biāo)識以及每個核苷酸相應(yīng)的質(zhì)量分值。FASTQ文件已經(jīng)變成廣泛認可的格式用以NGS領(lǐng)域的信息交流。下一步主要是根據(jù)參考序列，對讀取的序列進行比對，對于一個典型的人類參考基因組序列，去確定病人的序列與參考序列之間的不同。鑒定的變異類型包含SNV、InDel

26、、CNV以及其它的結(jié)構(gòu)變異。確定的變異根據(jù)相應(yīng)基因或蛋白的功能注釋到提供信息中。另外實驗室執(zhí)行或策劃研發(fā)的獨立程序，對特定變異與給出的疾病的臨床相關(guān)性予以評價。最后，在遞交的臨床報告中，通過注釋的變異位點解讀病人的臨床表型。對于基因模塊和外顯子組或全基因組測序，大量變異位點的的排查可以通過對較高的基因型頻率來篩減，最后只關(guān)注于極有可能對病人有危害并與病癥相關(guān)的的稀有變異。當(dāng)以家庭為單位對外顯子組或全基因組進行分析時，根據(jù)受影響與不受影響的家庭成員，優(yōu)先考慮變異類型在家族中的共分離。根據(jù)人類基因組突變體數(shù)據(jù)庫（如HGMD、OMIM等）與變異相關(guān)的疾病的相關(guān)信息對變異類型進行等級劃分，形成臨床報告

27、。開發(fā)一個包含生物信息以及對變異位點進行研究注釋的綜合型診斷流水線，需要整合多個算法和軟件應(yīng)用。就本身來說，實驗室必須根據(jù)經(jīng)驗選擇算法以及軟件工具應(yīng)用到每個分析診斷中。其中多個中間過程需要已知的病人樣本和培訓(xùn)數(shù)據(jù)進行設(shè)置，去檢測算法和軟件的性能。已經(jīng)制定好的生物信息分析工具和參數(shù)設(shè)置，實驗室需執(zhí)行生物信息分析驗證，通過大量的設(shè)定的樣本判定分析的靈敏度、特異性和重復(fù)性（不同運行，不同儀器，不同操作人員之間的一致性）。用以驗證的樣品包含以前已經(jīng)確認過的變異類型。這些變異可以驗證生物信息工具及其參數(shù)的性能表現(xiàn)（例如，如果對變異的檢測是獨立的分析，應(yīng)有較高的特異性和靈敏度，或如果是二次分析進行篩選的實

28、驗，需相對較高的靈敏度），按照每個實驗室的要求和報告的臨床標(biāo)準，調(diào)整或更換工具并進一步進行評價。當(dāng)一個令人滿意的生物信息程序經(jīng)驗證并達標(biāo)后，NGS實驗結(jié)果向臨床的轉(zhuǎn)化需要實驗室將生物信息分析的過程的所有方面進行記錄描述，并對此制定一個質(zhì)量管理體系。對生物信息分析的要求在下面的討論中將著重講解。NGS生物信息分析標(biāo)準操作流程文件實驗室應(yīng)通過SOP的形式對于生物分析中NGS結(jié)果的分析注釋及報告等流程進行文件化。實驗室必須對在NGS結(jié)果的分析注釋及報告中所用到的算法、軟件、數(shù)據(jù)資料庫進行文件化。生物信息分析流程的每一組成部分的文本必須記錄并能夠追溯（版本控制）。對于每一組成部分，實驗室會用到一個基線

29、，默認安裝，在發(fā)布的個體的生物信息學(xué)工具或運行算法方面，利用可替換的配置參數(shù)定制路徑。無論哪種情況，實驗室必須以文件形式記錄所有的與默認設(shè)置不同的自定義內(nèi)容或者明確指明所用到的參數(shù)、路徑、數(shù)值等。大部分的生物信息分析通過與參考序列進行比對，參考序列的版本號及組裝的詳細信息都需要明確指出。當(dāng)描述生物信息路徑時，實驗室應(yīng)該以文件的形式記錄所有的數(shù)據(jù)分析，包括每一步輸入和輸出的文件。對于每一步的正常表現(xiàn)，實驗室應(yīng)該也制定和記錄質(zhì)控參數(shù)。例如，首要步驟，一個實驗室會決定采納一套標(biāo)準，如特定儀器質(zhì)量過濾后，通過的可讀序列數(shù)量。變異位點識別的標(biāo)準是必不可少的，用到的參數(shù)閾值包含測序深度，變異位點質(zhì)量評分，

30、等位基因讀取比率。在后期數(shù)據(jù)篩選的流程和依據(jù)也需要體現(xiàn)在SOP文件中。NGS生物信息分析流程驗證實驗室對生物信息分析的驗證生效以及當(dāng)有變動時對整個分析流程或流程的一部分性能進行從新驗證生效。從新認證的程度范圍由修改變動內(nèi)容而定。正如實驗流程一樣，在確立一個包含序列分析可讀文件的生物信息分析流程時，實驗室會經(jīng)歷一個自身不斷修正的過程。對于能夠完成從測序?qū)嶒灥缴镄畔⒎治龅恼麄€流程的實驗室，生物信息分析路徑的驗證生效應(yīng)該包含整體的驗證。一旦實驗室形成并經(jīng)驗性的確定了最佳操作，并對流程完成了充足的檢測，下一步就是再利用含有變異位點的樣品產(chǎn)生的序列執(zhí)行并文件化，進行全面的驗證。對于內(nèi)部研發(fā)的軟件工具或

31、供應(yīng)商提供的已經(jīng)鎖定的軟件工具（如對基礎(chǔ)工具沒有進行任何修改），這些步驟是必不可少的。對于實驗測序平臺，需要對充足的樣品數(shù)量進行分析，去評價其診斷分析的靈敏性，特異性和重復(fù)性。樣本數(shù)量的評估應(yīng)由實驗本身決定。一些參數(shù)如基因數(shù)量的評估，基因區(qū)域的評估，以及需要檢測的變異類型最終都應(yīng)確認控制的數(shù)量，良好的特征樣品（例如人類基因組單體型圖樣本或已知的固有的細胞系或設(shè)計的變異），或之前診斷過的樣品。眾所周知，假基因以及與靶序列高度同源的序列的出現(xiàn)對與精確的序列圖譜映射，序列比對，及相關(guān)的變異識別都有干擾。在一個給定的臨床診斷實驗中，需要對干擾的程度進行判定。盡管在生物信息分析上高度同源序列的設(shè)置調(diào)整的

32、挑戰(zhàn)，可能會解決掉，但是實驗室仍需要設(shè)置一個獨立的可替代性分析方法去應(yīng)對這一領(lǐng)域的問題。NGS工作組認為全面詳盡的定義假陽性和假陰性對應(yīng)的錯誤率是不可行的。然而實驗室應(yīng)該在變異類型上對典型的實例的錯誤率進行評估。通過對照樣品、特征樣品可以對這些錯誤率進行評估。假陽性的錯誤率可以通過可替代性的測序方法進行確定。假陰性的錯誤率很難確定，因為其起源于多種情況，包括在給定靶區(qū)域內(nèi)測序深度的不足，變異的識別的缺少可能因為質(zhì)量評分設(shè)置較低，序列讀取的方向分布（正向、反向）無法滿足質(zhì)控標(biāo)準。在用一個可替代方法驗證變異識別的過程中，通過分析靶序列的側(cè)翼區(qū)域去確定這個變異識別流程能否發(fā)現(xiàn)所有可能的變異。例如，當(dāng)

33、用桑格測序確認一個變異時，可以設(shè)計引物對，不僅對變異區(qū)域進行測序，而且對側(cè)翼序列進行測序，然后就能檢測是否存在變異，查找與生物信息分析途徑鑒定結(jié)果的對應(yīng)關(guān)系。在文庫制備時，應(yīng)用分子編碼已成為NGS中的常用做法。實驗室需要確定標(biāo)簽序列在混合池中的特異性，并且確認在分析的過程中，能夠準確的識別區(qū)分標(biāo)簽序列。在索引分析和樣品合并時，接收或拒絕一條讀長需要設(shè)立一標(biāo)準。例如一些實驗室只接受具有索引的讀長，且索引序列與建庫時所用索引是一致的。對于含有索引序列的讀取量的百分數(shù)的監(jiān)測可以測試出來源于其它索引序列污染的存在。這個測試與檢測限相關(guān)，如在腫瘤樣品中確認體細胞突變，生物信息分析途徑需要其參數(shù)進行評估。

34、可以通過降低含有變異位點的樣品濃度驗證其檢測極限。對于確認變異位點的生物信息分析途徑的驗證都是專用的，除了分析含有雜合基因型的特殊樣品的檢測極限外，以上討論都是與之廣泛相關(guān)的。當(dāng)應(yīng)用外顯子或全基因組測序以確認相關(guān)的候選基因時，基于此，實驗室必須額外的對生物分析途徑進行驗證。例如，在遺傳疾病的情況下，實驗室通過對具有多種（隱性、顯性、有害變異、致病性變異）序列分析讀取設(shè)置。一旦生物信息分析途徑經(jīng)過驗證符合實驗室的要求，并已經(jīng)實施，當(dāng)分析途徑有任何改變時，需要對其重新驗證。能夠使其重新生效的實際方法是利用分析驗證過的序列文件用新參數(shù)對其重新簡單地分析。這種方法可能會產(chǎn)生相同的、或更少的、或更多的變

35、異位點，這些結(jié)果需要進一步驗證。對于外顯子組或全基因組的序列，生物分析途徑的改變也能產(chǎn)生一個新的假定的候選基因名單。作為生物分析途徑驗證或從新驗證的法規(guī)資料將會包含驗證生效記錄和臨床應(yīng)用的備用證明文件。NGS信息分析流程-質(zhì)量管理體系對于NGS信息分析途徑，實驗室應(yīng)有一份文件化的質(zhì)量控制體系。實驗室必須依據(jù)對應(yīng)的質(zhì)控標(biāo)準來監(jiān)測NGS數(shù)據(jù)分析的常規(guī)性工作。對臨床樣品分析時，與預(yù)期的質(zhì)量控制指標(biāo)的偏離需要調(diào)查，并給出解決。一些樣品包含以下這些情況：NGS數(shù)據(jù)分析的生物信息輸出可能會顯示通過質(zhì)量評分要求的序列讀取數(shù)量的不足。另一種情況，根據(jù)人類基因組突變頻率的相關(guān)信息，確定的變異的數(shù)量可能會脫離實際

36、期望值。另外的樣品具有偏高的索引序列讀取的數(shù)量，以至于無法專門的分離。這種偏差表明技術(shù)上存在誤差，或操作過程的失誤。一個合適的質(zhì)量控制系統(tǒng)提供工作流程，去查明導(dǎo)致差錯的可能的原因，并制定合適的補救措施。如與預(yù)期結(jié)果相偏差，實驗室應(yīng)記錄下來，并以文獻的形式記錄用來確定原因和修正的相關(guān)措施。遵從的證據(jù)（法規(guī)資料）不僅應(yīng)包含質(zhì)量控制監(jiān)測指標(biāo)的文件編制，還應(yīng)有關(guān)于偏差及相應(yīng)研究和補救措施的記錄描述。生物信息流程的更新實驗室有一個政策針對監(jiān)控，文件編制，補丁版本的執(zhí)行，升級和其它生物信息分析途徑的更新。檢測項目要求實驗室制定并遵循一項程序，對生物分析途徑的各部分制定和實施更新。二代測序生物分析途徑常常會

37、用到開源代碼軟件的多個程序包，處理內(nèi)容、報告分析方面的數(shù)據(jù)庫。由于這一領(lǐng)域的不斷改進演變，實驗室必須有一項政策監(jiān)控更新，版本補充。這項政策應(yīng)該注明更新的日期。例如，實驗室在相關(guān)發(fā)布后就執(zhí)行更新，或在一定的間隔期（一季度，半年，一年）后進行更新，這由更新的性質(zhì)和相關(guān)緊迫性決定。由于在這些更新后需要對生物信息分析流程重新驗證生效，后一種方法使得更新與重新驗證合并，這將是更有效的。最后實驗室保存記錄，并能清晰地以文件的形式記錄定期的監(jiān)管執(zhí)行更新。應(yīng)著重強調(diào)的是，是否更新，何時更新，是由實驗室主任決定。數(shù)據(jù)儲存實驗室有一個規(guī)定，與生物信息分析途徑產(chǎn)出的數(shù)據(jù)，中間的數(shù)據(jù)，以及最終的數(shù)據(jù)儲存有關(guān)。實驗室必

38、須確立并執(zhí)行關(guān)于數(shù)據(jù)儲存的一項規(guī)定。NGS產(chǎn)生的大的數(shù)據(jù)文件以及相關(guān)的數(shù)據(jù)分析，包括流動細胞成像文件，序列堿基識別和相應(yīng)質(zhì)量評分序列讀取文件，以及隨后分析中產(chǎn)生的中間文件。通常在一段較長時間內(nèi)保存所有的文件是不實際的，所以清單要求授權(quán)實驗室確立一項關(guān)于數(shù)據(jù)儲存的規(guī)定，指定的數(shù)據(jù)文件保留時間，及最終報告之后哪些文件需要保存。NGS工作組建議，如果可行的話，實驗室保留含有質(zhì)量評分的序列文件（如FASTQ文件）或保存一個能夠再生的文件檔案（如BAM文件）。這些格式將會允許在后來重新分析。對于全基因組或其它較大的序列數(shù)據(jù)，保留FASTQ文件或標(biāo)準檔案格式較長時間將會花費較高的費用，然而，新的壓縮格式提

39、供了一個近期的解決方案。這些文件要保存多長時間是一個復(fù)雜的問題，與文件大小，實驗室文件儲存能力，法醫(yī)學(xué)考慮，地方、地區(qū)、國家對數(shù)據(jù)儲存的要求。最后必須強調(diào)數(shù)據(jù)文件的儲存時間與地方、地區(qū)、國家對數(shù)據(jù)儲存的要求保持一致。版本的可追溯性利用NGS數(shù)據(jù)文件，生物信息分析途徑的特定的版本對于每個病人的報告都是可以追溯的。用于NGS數(shù)據(jù)分析的特定版本的組成部分，從哪獲得，相關(guān)的配制（命令行參數(shù)或其它配制項）都能夠被追溯。之前已經(jīng)提到，對于應(yīng)用生物信息分析流程去分析NGS數(shù)據(jù)，尤其是主要基于開源代碼的軟件時，其經(jīng)常由多個程序包、腳本、數(shù)據(jù)庫組成。單個的軟件包或腳本性能，內(nèi)置的或外部的數(shù)據(jù)庫對于整個生物信息分

40、析的性能具有重要的影響。因此，利用特定的生物分析流程對每個病人的數(shù)據(jù)進行分析，并生成報告是極為重要的。對于內(nèi)部產(chǎn)生的腳本和軟件包，如有改動也應(yīng)以文件形式記錄，但是這些不必要出現(xiàn)在病人的報告中?？偟膩碚f，應(yīng)用特定實驗室指定的分析流程（如：NGS流程V1.0.1）作為參考是可以被接受的。對于單個的組件和配置的組合，特定實驗室指定的流程應(yīng)該是獨一無二的。因此，軟件程序包、腳本、或內(nèi)部外部的數(shù)據(jù)庫的不同的版本的改變，需要一個新的獨特的特定實驗室并對其重新驗證。異常記錄實驗室利用生物信息分析流程分析過程中，對病人案例的偏離SOP的異常日志進行保存維護。在生物信息分析流程分析過程中，與SOP有任何的差異都

41、應(yīng)該以文件從形式記錄在異常日志中，包括軟件包、腳本、版本號、數(shù)據(jù)庫、命令行或相關(guān)參數(shù)的改變。在生物信息分析流程分析過程中，任何運行失敗都應(yīng)記錄在異常日志中，包括問題，結(jié)果調(diào)查，所進行的修改，相互的交流，實驗室主任的簽署，委派人員等。異常日志要求與病人的報告保持聯(lián)系，實驗室主任可以選擇任何相關(guān)的SOP偏差與咨詢醫(yī)師進行交流。異常日志的文件化也應(yīng)并入到質(zhì)量保障月報告中。一些偏差，例如由于網(wǎng)絡(luò)、電腦或儲存失敗需從新運行的，或需要不同的參數(shù)運行一個特定的步驟，必須文件記錄其結(jié)果輸出和解釋。例如，一個實驗室可能會需要在特定工具里改變設(shè)置以充分的對一個病例的某一變異或基因區(qū)域進行充分的分析。偏差的原因的描

42、述，以及產(chǎn)生偏差的特殊部分應(yīng)記錄在異常日志中。每一個偏差應(yīng)鏈接到對應(yīng)病人案例中，由實驗室主任給出恰當(dāng)?shù)脑u價。由于有擔(dān)保，這種偏差可以包含在最終的報告中，或詳細的與咨詢醫(yī)師進行交流。在進行生物信息分析時與漏洞或故障相關(guān)的偏差需要記錄在異常日志中。漏洞、受影響的案例，提出的矯正措施，必須經(jīng)過實驗室主任審核批準，簽字，注明日期?？赡苡捎谟布蜍浖虿僮魇д`導(dǎo)致生物信息分析完全的失敗，也應(yīng)該記錄在異常日志中，并以文件形式記錄出現(xiàn)的錯誤。NGS數(shù)據(jù)傳送的保密性實驗室應(yīng)有一項規(guī)程，在NGS數(shù)據(jù)在內(nèi)部或外部的儲存、傳送時保持時，應(yīng)確保病人信息的保密和安全。二代測序產(chǎn)生的大量的數(shù)據(jù)，尤其是基因測序，含有病人的

43、姓名，出生日期，用藥數(shù)量記錄或其他的受保護的健康信息，用以對病人的身份鑒定。實驗室必須建立嚴格的程序確保病人的私人信息受到保護。實驗室必須強化一些關(guān)于基因組信息傳送給醫(yī)療保健機構(gòu)或第三方機構(gòu)（如提供云計算資源或?qū)嶒炇曳?wù)類的機構(gòu)）的規(guī)程。規(guī)程中應(yīng)包括數(shù)據(jù)加密，安全數(shù)據(jù)傳送，訪問時的用戶身份識別鑒定。實驗室應(yīng)該遵照健康保險攜帶和賬戶行為能力的標(biāo)準要求，例如與外部供應(yīng)商建立商業(yè)協(xié)議，包括嚴格的充分的評估合適的方法保障病人臨床基因組數(shù)據(jù)發(fā)送和接收的機密性。序列變異位點的解釋報告對變異位點的解釋和報告應(yīng)遵循專業(yè)機構(gòu)推薦的指導(dǎo)方針。隨著NGS技術(shù)的采用，臨床實驗室正在擴大他們的檢測項目名單，如從單基因到

44、基因模塊再到外顯子組，再到全基因組。顯而易見的，實驗室將對多個關(guān)鍵的在以前報道中引起疾病的變異位點進行NGS測序。目前，大部分的基因變異的實驗報告都是遵循人類基因組變異協(xié)會命名法以及來自美國遺傳醫(yī)學(xué)協(xié)會（ACMG）的變異分類指導(dǎo)方針。術(shù)語命名的參考最初由Antonarakis和Dunnen在2001年發(fā)布，但目前已經(jīng)發(fā)生顯著地變化及附加上一些內(nèi)容。因此，建議實驗室采用這些參考指南的最新網(wǎng)絡(luò)版本。ACMG的變異分類的參考方針目前正在修訂，新版本將包含變異位點的解釋的參考內(nèi)容。建議應(yīng)用ACMG的對于遺傳疾病的分類系統(tǒng)作為參考，以提高變異位點分類的一致性。疾病和基因特異性修飾將應(yīng)該記錄在案。對于其他

45、臨床基因組檢測（腫瘤或病原體診斷），實驗室應(yīng)該對變異分類持有最佳的判斷，并采納現(xiàn)有的參考指南。在一些文獻中存在混淆的地方，如何使用副本文字進行變異的編號缺乏一致性，在臨床報告中也是如此。如由基因MUTYH產(chǎn)生的多個轉(zhuǎn)錄本，利用復(fù)雜的命名法去描述基因中的突變位點。其中兩個主要的轉(zhuǎn)錄本是hMYHa1（NM-012222.2）和hMYHa3（NM-001048171.1），由546和535個氨基酸組成的多肽。由于第3外顯子的可變剪切造成hMYHa3比hMYHa3少33個核苷酸，修剪掉第3外顯子5端11個氨基酸（GMIAECPGAPA）。大多數(shù)文獻命名突變體時用的是hMYHa3，然而一些文獻利用全長轉(zhuǎn)

46、錄本hMYHa1進行命名。當(dāng)對基因MUTYH出具檢測報告時，或來自不同實驗室對其的報告進行比較時，注明應(yīng)用哪一個轉(zhuǎn)錄本進行命名是極為重要的。實驗室已經(jīng)將這兩個最常見的轉(zhuǎn)錄本命名為p.Tyr165Cys和p.Gly382Asp。在臨床報告中，當(dāng)有名稱變化時，實驗室應(yīng)該有一套機制去監(jiān)管此類事情，并給予高度的重視。因此為了避免混淆，報告中要注釋所用轉(zhuǎn)錄本的檢索號及對應(yīng)的蛋白排列。在一個樣本中，對序列變異的觀察的精確解釋對于臨床檢測是極為重要的，因為它整合了變異對于功能基因所有可能的破壞和病人的臨床表型，以確定是否是這個變異引起的疾病。在過去的幾年里，不同的名詞術(shù)語已經(jīng)應(yīng)用到臨床報告中，這意味著測序結(jié)

47、果在不斷變化，包括致病性的，有害的，疾病相關(guān)聯(lián)的，并帶有possible，probably，likely，VUS和VOUS（未知的臨床意義，未確定的臨床意義）修飾詞。標(biāo)準的序列變異參考已經(jīng)推薦給遺傳類疾病，但對于腫瘤和傳染性病原體診斷仍然是不牢靠的。對于遺傳疾病，最普遍的應(yīng)用的分類分為5個類別，（1）致病性的，（2）可能致病性的，（3）不確定的臨床意義，（4）可能良性的（5）良性的。當(dāng)描述序列變異造成的臨床影響時，實驗室應(yīng)引起重視，并仔細的考慮疾病因果關(guān)系的證據(jù)，普通人群中的頻率，以及相關(guān)功能性研究。從大的工程項目（外顯子組變異服務(wù)器，千人基因組計劃等）里免費的獲得外顯子組或全基因組測序數(shù)據(jù)后

48、，實驗室應(yīng)該利用相關(guān)的數(shù)據(jù)庫和計算機工具（如表所示）去注釋序列改變對疾病的影響程度。對于大規(guī)模的檢測，如外顯子測序或全基因組測序，一個基因?qū)膊〉囊蚬P(guān)系的證據(jù)的評價，以及對變異類型、遺傳形式的理解是非常重要的。例如沒有確定在發(fā)病中有具體作用的一個基因的功能性缺失變異，不可以假設(shè)其引起疾病。附帶性遺傳研究報告與臨床診斷目的無關(guān)的附帶性遺傳研究報告，實驗室應(yīng)對此進行規(guī)范。當(dāng)進行單基因、基因模塊、外顯子、全基因組測序測序時，臨床上會產(chǎn)生重要的遺傳研究發(fā)現(xiàn)，但與檢測的表現(xiàn)型無關(guān)。這種現(xiàn)象同樣也會出現(xiàn)在對某種特定疾病進行特定分析的情況中。其可能會包含識別與常染色體顯性疾病，隱性疾病攜帶狀態(tài)，普遍已知的

49、藥物反應(yīng)等位基因標(biāo)記有關(guān)的變異。著手利用NGS的臨床檢測，應(yīng)該意識到這種偶然的研究發(fā)現(xiàn)的潛力，并且對于是否以及如何報告這些這些實驗檢測應(yīng)該有相關(guān)規(guī)定。最近公布的ACMG推薦規(guī)范，去報告醫(yī)學(xué)上可操作的偶然發(fā)現(xiàn)，其中包含一個最低量的基因名單，如果發(fā)現(xiàn)已知的突變位點，就應(yīng)出具其報告。實驗室可以選擇遵循ACMG的推薦，但并不是期望一定要報告在這些基因中的發(fā)現(xiàn)。實驗室就偶然的發(fā)現(xiàn)，可以制定自己的規(guī)范。如果實驗室的規(guī)范不對偶然性發(fā)現(xiàn)進行報道，或者限制對一特定疾病報告偶然的發(fā)現(xiàn)，對于此實驗室應(yīng)該清楚在檢測報告中聲明。當(dāng)決定是否透漏給病人某一遺傳信息時，道德準則也應(yīng)考慮進來。公開附帶性發(fā)現(xiàn)相關(guān)的安全等級由疾病的嚴重程度、臨床可控程度、或其它風(fēng)險效益因子決定。例如，常見的疾病風(fēng)險等位基因，2型糖尿病，相較于遺傳信息表明傾向于醫(yī)學(xué)上可以或不可以治愈的惡性腫瘤或孟德爾遺傳病而言，具有相對較低的風(fēng)險，或藥理學(xué)風(fēng)險信息具有不同后果嚴重程度。所有的這