土壤細菌DNA 提取及多樣性分析的T-RFLP 方法

1、微生物學通報 JAN 20, 2008, 35(1: 131136Microbiology ©2008 by Institute of Microbiology, CAStongbao基金項目: 公安部重點研究項目(No. 20038221401 *通訊作者: Tel: 010-*; : easygyy收稿日期: 2006-12-18; 接受日期: 2007-10-19生物實驗室土壤細菌DNA 提取及多樣性分析的T-RFLP 方法葛蕓英* 陳 松 胡 蘭 凃 政(公安部物證鑒定中心 北京 100038摘 要: 獲得高質(zhì)量的土壤總DNA 是土壤細菌生態(tài)學的關(guān)鍵步驟之一。實驗通過綜合應(yīng)用

2、兩個試劑盒(Soilmaster kit 和DNA IQ TM 系統(tǒng)的優(yōu)點進行土壤樣品總DNA 的提取, 結(jié)果證明該方法是一種快速、有效、靈敏、穩(wěn)定的土壤DNA 提取方法。另外嘗試將16S rDNA 序列和T-RFLP(Terminal restriction fragment length polymorphism技術(shù)引入土壤細菌DNA 群落多樣性的研究中, 證明T-RFLP 是一種有力的土壤細菌多樣性分析工具。關(guān)鍵詞: 土壤細菌, 多樣性分析, DNA 提取, T-RFLP 分析A New Method of Soil Bacterial DNA Extraction and T-RFLP

3、Analysis for DiversityGE Yun-Ying * CHEN Song HU Lan TU Zheng(Institute of Forensic Science , Ministry of Public Security , Beijing 100038Abstract : Obtaining soil bacterial DNA of good quality is a key step in soil bacterial ecology study. A quick,efficient, sensitive and stably method of DNA extra

4、ction from soil were established by combining strong-points of two kits ( Soilmaster kit and DNA IQ TM kit. In addition, the 16S rDNA gene and T-RFLP (Termi-nal restriction fragment length polymorphism were used in the analysis of soil bacterial community diver-sity and the result show that T-RFLP i

5、s a powerful tool for bacterial community study. Keywords: Soil bacterial, Diversity analysis, DNA extraction, T-RFLP 土壤是各種生物體包括人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ), 雖然土壤細菌研究一直深受各國土壤學家和生態(tài)學家的關(guān)注, 對其物理和化學性質(zhì)已進行了廣泛深入的研究, 但是對于土壤中的生物區(qū)系特別是土壤細菌的研究卻相對落后得多。比如對于土壤細菌的認識, 人們通常是通過先分離細菌再在培養(yǎng)基上培養(yǎng)、鑒定菌落的方法; 但事實上, 土壤中只有少部分細菌可以通過此方法得到, 而大部分細菌是極難

6、培養(yǎng)成功的, 這使得許多土壤細菌包含的大量遺傳信息難以被發(fā)現(xiàn)1, 2。近些年來, 把分子生物學技術(shù)運用在土壤細菌生態(tài)學的研究中, 使人們可以避開傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)過程, 通過DNA 水平上的研究, 直接探討土壤細菌的種群結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境的關(guān)系。目前已經(jīng)涌現(xiàn)出許多用于研究土壤細菌多樣性和生態(tài) 132微生物學通報2008, Vol.35, No.1學的技術(shù), 比如:ARDRA (Amplified ribosomal DNA restriction analysis , SSCP ( Single strand conforma-tion Polymorphism, RFLP(Restriction f

7、ragment length polymorphism Sequencing , DGGE (Denatur-ing gradient gel electrophoresis 和T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism 等。這些技術(shù)和方法的采用, 使得在土壤細菌多樣性、細菌種群的結(jié)構(gòu)和功能、土壤細菌的系統(tǒng)發(fā)生和分類、土壤細菌與污染土壤的相互作用及影響等多領(lǐng)域的研究上得以突破, 發(fā)揮了傳統(tǒng)方法所不能替代的作用1,2,3。其中T-RFLP 技術(shù)作為一種新興的研究微生物群體多態(tài)性的方法, 也越來越受到相關(guān)研究的重視。但是, 這

8、些方法成功的首要問題是能否獲得高質(zhì)量和高純度的DNA, 本文綜合兩個試劑盒(Soilmaster kit 和DNA IQ TM 系統(tǒng)的優(yōu)點進行土壤DNA 提取并且將細菌16S rDNA 序列和T-RFLP 技術(shù)應(yīng)用于土壤細菌群落多樣性的研究中。1 材料與方法1.1 主要試劑(盒及土壤樣品Soilmaster kit(EPICENTRE 公司、DNA IQ TM 系統(tǒng)(PROMEGA 公司、TaKaRa Tag HS 酶(TaKaRa 公司、Alu 內(nèi)切酶(Biolabs 公司、內(nèi)標LIZ-500(AB 公司; 土壤樣品來自于北京周圍隨機采集的土壤。 1.2 土壤樣品的采集及預處理 取距離土層表

9、面15cm 的土壤, 裝入滅菌封口塑料樣品袋中, 去除樣品中帶有的植物殘體、砂石等大顆粒后置于4冰箱保存。1.3 土壤總DNA 提取(參照Soilmaster kit 操作步驟并作適當調(diào)整(1 稱取300 mg 土壤置于1.5 mL 離心管中, 加入375 L DNA 提取液和5 L 蛋白酶K(50 mg/mL, 振蕩后37水浴保溫30 min; (2 加入75 L 裂解液, 振蕩后65保溫1h; (3 10000 r/min 離心3 min 后吸出上清至新的1.5 mL 離心管中; (4 在新管中加入90 L 去蛋白劑, 顛倒數(shù)次混勻后置于冰上8 min; (5 13000 r/min 離心

10、8 min 后, 吸出上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中備用。1.4 土壤總DNA 的純化(參照DNA IQ TM 系統(tǒng)的操作步驟(1 加入與以上所提DNA 等體積配制好的裂解液(100 L 裂解液+1 L 1 mol/L DTT, 振蕩后加入7 L 樹脂, 室溫放置5 min; (2 渦旋振蕩后將離心管放在磁架上, 小心吸去溶液; (3 用100 L 裂解液洗滌一次, 渦旋振蕩后將離心管放在磁架上, 小心吸去溶液; (4 用100 L 洗液洗滌3次, 每次渦旋振蕩使樹脂懸浮; (5 打開離心管蓋子, 室溫下空氣干燥510 min, 加入20 L 的無菌去離子水, 蓋好蓋子, 65加熱5 min; (6

11、取出離心管, 渦旋振蕩后, 立即將離心管放回磁架上, 小心吸出上清液, 20保存?zhèn)溆谩?.5 土壤總DNA 的檢測取5 L DNA 溶液, 用0.8%含EB 瓊脂糖凝膠、5V/cm 電壓電泳, 同時用DNA 作對照, 紫外光下觀察DNA 樣品譜帶與對照譜帶的位置和亮度。 1.6 16S rDNA 擴增及產(chǎn)物檢測選用通用引物擴增參試土壤樣品DNA 的16SrDNA 序列5, 正向引物63f 序列為: 5-CAGGC- CTAACACATGCAAGTC-3(5-FAM 標記, 反向引物1387r 序列為5-GGGCGGWGTGTACAAG- GC-3。擴增反應(yīng)采用25 L 體系, 模板量為2 L,

12、 陰性對照用ddH 2O 代替模板DNA 。PCR 擴增條件為: 95 5 min; 94 30s, 58 45s, 72 1.5 min, 32個循環(huán); 72 10 min 。取1 L 擴增產(chǎn)物+12 L 甲酰胺+0.2 L 內(nèi)標混勻后, 在ABI 310遺傳分析儀上進行毛細管電泳, 電泳時間為50 min 。1.7 T-RFLP 的原理T-RFLP 根據(jù)樣品中的目標區(qū)域DNA 序列的不同或變化, 進行PCR 擴增后得到目標DNA 片段, 酶切后將會產(chǎn)生不同長度的限制性片段。由于T-RFLP 方法是把目標DNA 片段的一個末端(通常是5端用熒光標記, 這樣在酶切后, 分析的目標只限于有熒光標

13、記的末端限制性片段上。酶切后產(chǎn)生長度不等的末端限制性長度片段經(jīng)過毛細管電泳分離, 并經(jīng)ABI 自動測序儀上檢測和計算后, 輸出末端限制性片段的大小和強度圖。測序儀上輸出的圖譜含有的不同波峰越多, 則表明微生物種類越豐富。通過比較不同樣品圖譜間的峰的異同, 可以為評估土壤微生物多樣性提供更敏感的數(shù)量化基礎(chǔ), 從而為比較土壤樣品之間的關(guān)系提供一種依據(jù)。1.8 產(chǎn)物酶切、檢測及分析依據(jù)PCR 產(chǎn)物檢測峰高, 取適量PCR 產(chǎn)物用Alu 進行酶切; 反應(yīng)采用10 L 體系, 37 3 h 酶切完成后65 20 min 終止反應(yīng)。取1 L 酶切產(chǎn)物+12 L 甲酰胺+0.2 L 內(nèi)標混勻后, 在ABI

14、310遺傳分析儀上進行電泳, 電泳時間為25 min 。葛蕓英等: 土壤細菌DNA 提取及多樣性分析的T-RFLP 方法133 用GeneScan 軟件分析各樣品, 得到各樣品所包含的末端片斷的數(shù)目及分子量大小, 即每個樣品的最終分型。依據(jù)公式Cs=2N AB /(N A +N B 人工計算出兩樣品之間的Sorenson 相似系數(shù)。其中: N AB 指A 、B 兩樣品共有的條帶數(shù)目(人為規(guī)定分子量相差±1bp 內(nèi)算是同一條帶; N A 、N B 指A 、B 兩樣品各自包含的條帶數(shù)目。1.9 提取及T-RFLP 方法穩(wěn)定性實驗按300 mg 、200 mg 、100 mg 的梯度提取同

15、一份土壤樣品的DNA, 依次編號為S6B 、S6C 、S6D; PCR 擴增后依據(jù) 1.8中的步驟進行酶切和電泳, 得到各個樣本末端酶切片段的圖譜和分型。取編號為30、31號的兩個土壤樣品的DNA 相距一個月分別進行前后兩次PCR 擴增, 并對其產(chǎn)物進行酶切, 觀察并分析其末端酶切片段的圖譜。2 結(jié)果與分析2.1 土壤總DNA 的瓊脂糖電泳結(jié)果在用紫外光檢測時, 可以看到所提取樣品的總DNA 條帶清晰完整, 基本無彌散, 分子量接近DNA 。由于DNA IQ TM 系統(tǒng)具有簡單定量功能(7 L 磁珠溶液最多只能吸附100 ngDNA, 因此在最理想的狀態(tài)下, 該方法所提取的DNA 濃度最大為5

16、 ng/L, 用一般的照相技術(shù)無法清楚拍攝, 只能用肉眼看到。2.2 PCR 擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果通用引物63f/1387R 對所提DNA 進行PCR 擴增后, 所檢土壤樣本均得到了分子量相近的主要擴增產(chǎn)物, 而陰性對照則無產(chǎn)物, 結(jié)果見圖1。依據(jù)文獻報道, 細菌目標片段的大致分子量為1300 bp 左右; 由于沒有這么大的分子量內(nèi)標, 不能得到該擴增片段的具體分子量, 不過依據(jù)其橫坐標的點數(shù)以及內(nèi)標所作曲線, 可以估算其片段的大小為1300 bp 左右, 確定為細菌的目標片段。2.3 提取及T-RFLP 方法穩(wěn)定性實驗結(jié)果S6B 、S6C 、S6D 經(jīng)過PCR 、酶切、毛細管檢測后, 得到了較為

17、一致的末端片段圖譜, 結(jié)果見圖2。30、31兩個樣品在前后相隔一個月進行的T-RFLP 實驗中, 均得到了非常相似的末端片段圖譜, 結(jié)果見圖3、4。其中橫坐標反映了DNA 片段(峰在毛細管中的電泳至檢測孔的時間, 經(jīng)過軟件計算后對應(yīng)其分子量大小; 縱坐標是DNA 片段(峰的強弱程度, 橫坐標代表了該片段分子量的大小。用GeneScan 軟件分析得到各樣品所包含的末端片斷的數(shù)目及分子量大小結(jié)果見表1。圖1 土壤細菌16S rDNA PCR 擴增結(jié)果Fig. 1 PCR amplification results of soil bacterias 16S rDNAA: 陰性對照; B 、C: 不

18、同土壤樣品A: Negative sample; B, C: Deferent soil samples.134微生物學通報2008, Vol.35, No.1 表1 分析后各樣本具體的T-RFLP 結(jié)果(bpTable 1 Details of T-RFLP fragments from every sample after analysis (bpS6BS6C S6D 30(First 30(Secend 31(First 31(Secend 103.00 103.32 103.23 104.32 104.23 104.14 104.25 104.18 104.56 104.48 112.

19、7 115.43 105.60 105.71 105.17 105.52 105.44 115.51 117.04 115.59 116.07 106.91 156.73 171.94 117.18 125.56 129.60 129.77 156.69 171.88 182.57 125.76 136.82 156.74 156.85 168.27 182.55 186.52 137.00 155.10 160.00 160.00 172.21 190.44 190.45 155.20 156.44 161.53 161.64 181.93 196.21 196.62 156.57 160.

20、00 162.46 167.57 190.41 201.06 201.18 160.11 167.03 167.26 171.70 196.77 203.19 203.32 167.10 171.34 171.11 181.31 201.36 208.96 209.23 171.36 172.50 181.69 187.31 203.06 212.18 212.36 172.48 181.40 187.23 196.26 208.87 236.88 227.75 181.37 182.44 194.03 197.40 212.87 256.04 237.37 182.47 192.39 196

21、.10 199.43 236.82 256.92 192.59 195.12 197.25 200.00 256.21 195.10 196.37 199.55 201.15 196.3 199.77 200.81 205.30 199.57 200.81 203.15 207.85 205.01 205.10 205.25 211.10 207.70 207.78 207.82 213.66 210.62 210.82 211.41 228.59 213.21 213.40 213.59 255.62 255.54 255.55 228.46255.61圖2 S6B 、S6C 、S6D 樣品

22、的酶切末端片段的檢測圖譜Fig. 2 Electropherograms of the bacterial community T-RFLP profiles from soil samples (S6B 、S6C 、S6D葛蕓英等: 土壤細菌DNA 提取及多樣性分析的T-RFLP 方法135 圖3 30號樣品兩次擴增產(chǎn)物的酶切末端片段的檢測圖譜Fig. 3 Electropherograms of asynchronous T-RFLP profiles of the bacterial community from No.30 soil samples圖4 31號樣品兩次擴增產(chǎn)物的酶切末端

23、片段的檢測圖譜Fig. 4 Electropherograms of asynchronous T-RFLP profiles of the bacterial community from No.31 soil samples由圖2可以看出, S6B 、S6C 、S6D 三個樣本的T-RFLP 片段主要集中在100 bp300 bp 之間, 且其中包含的DNA 片段(峰的數(shù)量(分別是16條、14條和15條和大小基本一致; 三份樣本之間的Sorenson 相似系數(shù)分別是0.93、0.84、0.90。由圖3、4可以看出, 30、31號兩個樣品前后相距一個月所進行的T-RFLP 實驗的結(jié)果顯示峰的

24、強度、數(shù)目和大小都很接近, 其中30號樣品的前后的結(jié)果在片段數(shù)目上保持一致, 均為23條; Sorenson 相似系數(shù)為0.96。而31號樣品的前后的結(jié)果在片段數(shù)目上也基本一致, 分別為24、22條; Sorenson 相似系數(shù)為0.91。以上結(jié)果表明盡管S6B 、S6C 、S6D 樣本原始的提取土壤重量不一樣, 但獲得的末端片段的圖譜非常接近, 說明這三個樣本中細菌群落的組成非常相近。因此證明即使在提取樣本極微量的情況下, 采用該研究中建立的提取方法提取的DNA 質(zhì)量穩(wěn)定, 可以很好地代表土壤中微生物的真實性和異質(zhì)性。另外在T-RFLP 分析中, 雖然需經(jīng)過PCR 、限制性酶切以及毛細管電泳

25、等分子生物學步驟, 但得到的結(jié)果非常相似, 即使是前后相距一個月的實驗結(jié)果; 因此在本研究中所建立起來的T-RFLP 方法具有很高的重復性和穩(wěn)定性。3 結(jié)論與討論建立高效、可靠的微生物總DNA 提取方法是進行微生物分子生態(tài)學研究的基礎(chǔ), 但由于在土壤中存在的腐殖物質(zhì)等容易干擾DNA 的擴增和檢測, 這些污染可能抑制PCR 中的聚合酶活性4、干擾限制136 微生物學通報 2008, Vol.35, No.1 性內(nèi)切酶的消化 5等, 所以 DNA 的純化是獲取高純 度微生物總 DNA 的關(guān)鍵步驟, 傳統(tǒng)的 CsCl-梯度離 心、Sephadex 凝膠層析等方法對 DNA 的損耗較多, 且操作復雜。

26、 評價一種土壤 DNA 提取方法是否有效, 除了 通常要求的提取片段無降解比較完整外, 還需要能 夠有效去除土壤中大量存在的影響后續(xù)實驗的物質(zhì), 如腐殖酸、腐殖酸似物、酚類化合物、重金屬離子 等; 能在單位樣本量中比較徹底地提取出微生物 DNA; 提取方法應(yīng)具廣普性, 對土壤中大多數(shù)微生 物能夠有效等 6, 且提取的 DNA 需要更好地代表了 土壤微生物的真實性和異質(zhì)性。 本研究中采用的方法綜合運用了兩個試劑盒, 即應(yīng)用了 Soilmaster kit 的高效裂解功能和 DNA IQTM 系統(tǒng)的簡單、快速、高效的純化作用, 將提取 時間縮短至 3 h, 且將 DNA 的提取、純化及簡單定 量融

27、為一體。研究中也嘗試單獨使用 Soilmaster kit 進行少量土壤 DNA 的提取, 即完全采用該試劑盒的 裂解和純化步驟; 結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取的效率較低, 有些 極微量的土壤樣品不能成功被提取, 可能原因之一 是土壤成分差異很大, 致使 DNA 初提液中所含雜質(zhì) 不同, 有些雜質(zhì)的存在改變了該試劑盒設(shè)定的純化 過程中吸附過柱和洗脫的最適條件, 致使 DNA 洗脫 效率低, 損失較大; 再由于土壤樣品中細菌的量本 身很低, 而該試劑盒最后所需的洗脫體積較大 (50 L, 所以導致所提 DNA 濃度太低無法進行后 續(xù)實驗操作。 DNA IQTM 純化過程非常簡單, 省卻 而 了許多純化試劑盒所需

28、的反復離心的過程, 將純化 時間縮短至 10 min, 且可以進行簡單定量。該 DNA 提取方法對于大多土壤樣品的最小檢出量為 100 mg, 這是現(xiàn)如今很多文獻報道的土壤微生物 DNA 提取 方法很難達到的靈敏度; 靈敏度的提高可以將采樣 點縮小, 很好地避免采樣中由于垂直或水平距離差 異造成的微生物群落上的差異。當然土壤中細菌的 數(shù)量受氣候和營養(yǎng)成分的影響很大, 所以該研究中 建立起來的 DNA 提取方法的靈敏度也會有所變化。 從文中的實驗結(jié)果可以看出, T-RFLP 分析具有 很多優(yōu)點, 例如分析精細(每個土壤樣品能得到二十 幾個末端片段, 較 DGGE、 SSCP 或 ARDRA 等方

29、法 有更強的分析能力; 易于自動化(儀器直接檢測后以 數(shù)字化的形式直接輸出結(jié)果, 減少了分析時人為誤 差; 另外通過 ABI 自動測序儀對任何一末端限制性 片段的測序, 并與 Internet 中的數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行比 較分析, 可以確定樣品所包含的微生物在系統(tǒng)中分 類地位 1 、 7, 從而可以做系統(tǒng)發(fā)育的推斷。T-RFLP 技術(shù)這三個明顯的優(yōu)勢使其必然成為一種理想的群 落對比分析的方法。該技術(shù)目前已被成功的應(yīng)用到 了菌種的鑒定、各種微生物群落的比較分析、多樣 性及結(jié)構(gòu)特征的研究等方面。 Clement 等 8也是利用 T-RFLP 技術(shù)分析了三種不同的細菌群落, 包括鹿腸 道、沙地以及被污染

30、沙地中的微生物群落。詹鑾峰 等 9為了協(xié)助慢性腹瀉病原學診斷, 利用 T-RFLP 方 法對 30 例慢性腹瀉患者和 22 例健康人進行腸道菌 群分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn) 30 例腹瀉患者均發(fā)現(xiàn)腸道菌群紊 亂, 建立了一種新的快速檢測分析人體腸道菌群的 方法。因此我們相信, 隨著該方法的進一步完善和 相關(guān)儀器的普及, 對大規(guī)模普查各類土壤細菌群落 的組成分布, 以及快速尋找目的細菌等研究具有重 要的意義, 并將發(fā)揮更大的作用。 綜上所述, 本研究中建立起來的從土壤中直接 提取 DNA 的方法是一種快速、 高效、 穩(wěn)定的方法, 該 方法無需特殊儀器, 整個過程可在較短的時間內(nèi)完 成; 在本研究中選用 16S rDNA 序列以及 T-RFLP 技 術(shù)相結(jié)合的方法對土壤細菌群落進行研究, 結(jié)果證 明該方法在土壤多態(tài)性研究方面是一種有效的手段, 重復性好, 穩(wěn)定性高。為檢測土壤微生物的群落結(jié) 構(gòu)、微生物的多樣性和功能微生物的代謝途徑研究 提供了一種可行的方法。 參 考 文 獻 1 Tiedje JM, Asuming Brempong S, Nsslein K, et al. Opening the black box of soil microbial diversity. Applied Soil Ecology, 1999, 1