豐富康復(fù)訓(xùn)練對大鼠腦缺血再灌注后功能恢復(fù)及神經(jīng)元樹突生長的影

1、基礎(chǔ)研究豐富康復(fù)訓(xùn)練對大鼠腦缺血再灌注后功能恢復(fù)及神經(jīng)元樹突生長的影響程明高, 廖維靖, 楊萬同, 江城, 周琴, 蒙蘭青, 聞萬順摘要目的觀察豐富康復(fù)訓(xùn)練對大鼠缺血再灌注腦損傷功能恢復(fù)的影響, 以及損傷對側(cè)大腦皮層前肢運(yùn)動代表區(qū)第V 層錐體神經(jīng)元樹突的可塑性變化。方法雄性Wistar 大鼠32只, 體重180200g , 預(yù)訓(xùn)練后隨機(jī)分成兩組, 缺血組和假手術(shù)組, 每組16只。線栓法制作右大腦中動脈阻斷(MCAO 2h 再灌注模型。造模后缺血組隨機(jī)分成豐富訓(xùn)練組(IE 組 和獨(dú)居組(IS 組 , 假手術(shù)組隨機(jī)分成豐富訓(xùn)練組(SE 組 和獨(dú)居組(SS 組 , 每組8只。術(shù)后24h ,IE 組和

2、SE 組置于豐富環(huán)境籠飼養(yǎng), 按計劃給予跑籠、轉(zhuǎn)棒和雜技等訓(xùn)練,IS 組和SS 組置于獨(dú)居籠飼養(yǎng), 不給予任何訓(xùn)練,4組大鼠在造模后24h 、1周、2周、3周、4周進(jìn)行神經(jīng)功能評估, 觀察其恢復(fù)狀況。用G olgi 2Cox 染色方法, 觀察損傷對側(cè)大腦皮層前肢運(yùn)動代表區(qū)第V 層錐體神經(jīng)元樹突的變化。結(jié)果IE 組在各項功能評估中均優(yōu)于IS 組。3周時, 肢體放置測試IE 組與假手術(shù)組已無顯著性差異(P >0105 ;4周時, 足失誤測試IE 組與假手術(shù)組已無顯著性差異(P >0105 。G olgi 2Cox 染色,IE 組比IS 組和假手術(shù)組的樹突分支點數(shù)有明顯增加(P <

3、0101 。結(jié)論豐富康復(fù)訓(xùn)練能有效促進(jìn)缺血再灌注腦損傷大鼠的功能恢復(fù), 并促進(jìn)缺血對側(cè)與功能恢復(fù)相關(guān)的大腦皮層神經(jīng)元發(fā)生可塑性變化。關(guān)鍵詞腦缺血再灌注; 豐富康復(fù)訓(xùn)練; 康復(fù); 神經(jīng)可塑性; 錐體神經(jīng)元; 樹突; 大鼠E ffects of E nriched R ehabilitative T raining on the Functional R ecovery and Ischemia/R eperfusion in R ats C H EN G M ing 2gao , L IA O Wei 2j ing , 2et De of Medicine , Zhongnan Hos pita

4、l , W uhan Universit y , W , , AbstractObjective on the f unctional recovery and neuronal dentritic growth following Wistar rats , weighting 180200g , were randomly divided into a ischemic group (n a (n =16 after beforehand trainings. Rats were subjected to 2h of right middle cerebral artery reperf

5、usion. After surgery , the ischemic group were randomly divided into a ischemia +enrichment (IE group and a ischemia +standard housing (IS group ; the sham 2operation group were randomly divided into a sham +enrich 2ment (SE group and a sham +standard housing (SS group. After 24h reperf usion , IE a

6、nd SE group s were housed in enriched ca 2ges , and given enriched rehabilitative training according to the scheme. At the same time , IS and SS group s were housed in standard cages without any training. The f unctions of 4group s were evaluated at 24h , 1week , 2weeks , 3weeks and 4week after oper

7、ation. Dentritic growth of layer V pyramidal cells of the undamaged forelimb motor cortex was examined using G olgi 2Cox procedure. R esults IE group showed better f unction than IS group in all behavioral test. There was no significant difference in limb 2placement test at 3weeks (P >0105 and in

8、 footfault test at 4weeks (P >0105 after operation between IE and SE group. The mean of basilar dentrite branching points in IE group was significantly greater than that of other group s (P <0101 . Conclusion Enriched rehabilitative train 2ing can promote functional recovery and enhance neural

9、 plasticity after cerebral ischemia/reperf usion in rats.K ey w ordscerebral ischemia/reperf usion ; enriched rehabilitative training ; rehabilitation ; neural plasticity ; pyramidal neu 2rons ; dentrite ; rat中圖分類號:R743.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:100629771(2006 0320203204本文著錄格式程明高, 廖維靖, 楊萬同, 等. 豐富康復(fù)訓(xùn)練對大鼠腦缺血再灌注后功能

10、恢復(fù)及神經(jīng)元樹突生長的影響J.中國康復(fù)理論與實踐,2006,12(3 :203206.近年來, 腦血管疾病的康復(fù)日益受到重視, 尋找有效的康復(fù)手段正成為研究的熱點。有研究表明, 康復(fù)訓(xùn)練是促進(jìn)功能恢復(fù)有效的方法, 其對缺血性腦梗死大鼠的感覺、運(yùn)動、行為能力方面的改善有明顯療效122; 缺血后豐富的生活環(huán)境也對腦缺血大鼠功能的改善有著積極的影響3。在康復(fù)治療時機(jī)的選擇上, 有研究表明, 早期適量的康復(fù)訓(xùn)練對腦卒中患者各項功能的改善有益4, 而完全制動患肢阻礙了腦缺血大鼠與運(yùn)動功能恢復(fù)相關(guān)皮層代表區(qū)的可塑性變化5。基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(30370357 。作者單位:武漢大學(xué)中南醫(yī)院康

11、復(fù)醫(yī)學(xué)科, 武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院腦血管病研究中心, 湖北武漢市430071。作者簡介:程明高(19802 , 男, 湖北應(yīng)城市人, 碩士生, 醫(yī)師, 主要研究方向:神經(jīng)康復(fù)。通訊作者:廖維靖。為了尋求更有效的康復(fù)訓(xùn)練方法及觀察其長期療效, 我們對大腦中動脈阻斷的腦缺血大鼠損傷后早期進(jìn)行豐富康復(fù)訓(xùn)練和豐富生活環(huán)境相結(jié)合的康復(fù)訓(xùn)練, 在不同時期進(jìn)行感覺、運(yùn)動及神經(jīng)功能評估, 觀察其恢復(fù)狀況, 并在治療結(jié)束后對其大腦皮層前肢運(yùn)動代表區(qū)第V 層錐體神經(jīng)元樹突可塑性進(jìn)行觀察。1材料和方法1. 1實驗動物及造模前預(yù)處理雄性Wistar 大鼠32只, 清潔級, 體重180200g , 購自湖北省實驗動物研究中心,

12、 合格證號:0037834。為使各組大鼠初始狀態(tài)一致并具備一定的運(yùn)動能力, 在造模前先對所有大鼠進(jìn)行預(yù)處理:造模前1周, 大鼠34只/籠群居于群居籠3(550×350×200mm , 造模前4d 開始進(jìn)行轉(zhuǎn)籠(10min/d 和雜技(2次/d 預(yù)訓(xùn)練。3021. 2造模與分組應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字法, 將大鼠隨機(jī)分成缺血組和假手術(shù)組各16只, 參照廖維靖等6的造模方法, 制作大腦中動脈阻斷(MCAO 2h 再灌注模型。造模后, 缺血組隨機(jī)分為訓(xùn)練組(IE 組 和獨(dú)居組(IS 組 , 假手術(shù)組也隨機(jī)分為訓(xùn)練組(SE 組 和獨(dú)居組(SS 組 , 每組各8只。大鼠置于室溫下飼養(yǎng), 自由飲水

13、進(jìn)食。飼養(yǎng)房以12h 為周期進(jìn)行明暗交替, 所有行為測試均在暗周期進(jìn)行。1. 3神經(jīng)功能評分采用Bederson 方法7進(jìn)行肢體功能的神經(jīng)缺損評分:0分, 無任何神經(jīng)功能缺失; 1分, 左前肢屈曲(即提尾懸空實驗陽性 ;2分, 側(cè)推抵抗力下降(即側(cè)向推力實驗陽性 , 伴前肢屈曲, 無轉(zhuǎn)圈行為;3分, 同2級行為, 伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)。評分13的動物列入缺血組。1. 4豐富康復(fù)訓(xùn)練豐富康復(fù)訓(xùn)練包括豐富環(huán)境和各種運(yùn)動訓(xùn)練。豐富環(huán)境籠設(shè)備參照文獻(xiàn)描述3,8置, 籠內(nèi)不同形狀、顏色、, ,2/周24h 到4周,IE ,IS 和SS 。運(yùn)動訓(xùn)練分簡單運(yùn)動和復(fù)雜運(yùn)動, 包括轉(zhuǎn)籠、轉(zhuǎn)棒、雜技訓(xùn)練, 設(shè)備制參照文獻(xiàn)

14、描述1,8210。轉(zhuǎn)籠為簡單運(yùn)動, 術(shù)后2d 開始到2周,10min/d ,5次/周。轉(zhuǎn)棒和雜技訓(xùn)練為復(fù)雜運(yùn)動。轉(zhuǎn)棒于術(shù)后2d 開始,10min/d ,5次/周。雜技任務(wù)訓(xùn)練, 術(shù)后24d 在實驗者的幫助下讓大鼠適應(yīng)此訓(xùn)練過程, 然后按訓(xùn)練計劃,4/d (第513天 , 后改為2/d (第1428天 。1. 5神經(jīng)行為功能測試分別于術(shù)后24h 、1周、2周、3周、4周進(jìn)行。測試項目如下。1. 5. 1Bederso n 神經(jīng)功能評分進(jìn)行, 方法同上。1. 5. 2肢體放置測試按照文獻(xiàn)6,11所述方法進(jìn)行肢體放置測試, 評分標(biāo)準(zhǔn):0分, 無放置;1分, 放置不完全或延遲(>2s ;2分,

15、立即正確放置。以損傷側(cè)(左側(cè) 肢體表現(xiàn)記分, 所有各項測試評分之和最大值為16分。1. 5. 3足失誤測試設(shè)備為雜技訓(xùn)練所用之網(wǎng)格平臺, 設(shè)備參照文獻(xiàn)6,829所述, 將大鼠放在平臺上2min , 使其在平臺上活動, 記錄肢體踏空次數(shù)。1. 6神經(jīng)元樹突染色使用Glaser 等12的G olgi 2Cox 液配制方法, 溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。各組動物于最后一次行為測試完成后, 用生理鹽水及4%冰多聚甲醛磷酸鹽緩沖液經(jīng)心臟灌注固定, 斷頭取腦, 置于20mlG olgi 2Cox 溶液中,37避光保存。14d 后置于30%蔗糖溶液, 浸泡25d 以增加其韌性。每組大鼠隨機(jī)挑選出6個腦標(biāo)本切片染色。根據(jù)包

16、新民13的方法定義前囟位置, 并以前囟為起點向前作冠狀切片, 片厚210mm , 在振動切片機(jī)上行200m 厚連續(xù)切片, 每個腦標(biāo)本挑選位于中間的6張, 根據(jù)G ibb 等14所述方法進(jìn)行G olgi 2Co x 染色。封片、干燥。1. 7圖像分析以缺血對側(cè)大腦皮層前肢運(yùn)動代表區(qū)(約從前囟到距前囟+210mm 皮層 2第層錐體細(xì)胞為觀察對象。用高清晰度彩色病理圖文分析儀選定要觀察的錐體細(xì)胞。被選擇觀察的細(xì)胞須要滿足以下標(biāo)準(zhǔn)15:錐體細(xì)胞需被充分染色, 且不被染色沉淀物、血管、; 錐體( , , 。1. 8統(tǒng)計學(xué)方法所得數(shù)據(jù)以(x ±s 表示, 采用SPSS 1115, 兩兩比較進(jìn)行t

17、 檢驗, 組間比較用方差分析, P <0105表示有顯著性差異。2結(jié)果2. 1神經(jīng)行為學(xué)評價2. 1. 1Bederson 神經(jīng)功能評定IE 組與IS 組在24周始終有非常顯著性差異(P <0101 ; SE 組和SS 組在24h 、14周評分均為0分。見圖1。2. 1. 2肢體放置測試術(shù)后2周, IE 組評分高于IS 組(P <0105 ; 術(shù)后3、4周均明顯高于IS 組(P <0101 , 在這2個時間點,IE 組與SS 組和SE 組無顯著性差異。IS 組在各時間點的評分均明顯低于SS 組和SE 組(P <0101 ,IE 組在24h 、1周、2周也低于SS

18、組和SE 組(P <0101 。見圖2。2. 1. 3足失誤測試自術(shù)后1周起,IE 組足失誤得分明顯低于IS 組(P <0101 , IE 組得分在術(shù)后24h 、1周、2周、3周明顯高于SS 組和SE 組(P <0101 , 到術(shù)后4周時無顯著性差異。IS 組在各時間點均高于SS 組和SE 組(P <0101 。見圖3。2. 2G olgi 2Cox 染色圖像分析觀察指標(biāo)為樹突分支點數(shù), 即除胞體外, 樹突發(fā)出分支的點。圖像分析結(jié)果提示,IE 組樹突分支點數(shù)比其他3個組有明顯增加(P <0101 ; IS 組樹突分支點數(shù)比SS 組有明顯增加(P <0101

19、。見圖4、封三彩圖111114。402 a :與IS 組比較, P <0101。圖1IE 組與IS 組各時間點B ederson 評分的比較 a :與SS 組和SE 組比較, P <0101;b :與IS , P <0105;c :與IS 組比較, P <0101圖a :與SS 組和SE 組比較, P <0101;b :與IS 組比較, P <0101。圖3各組各時間點足失誤測試的比較IE 組比其他3組有明顯增加(P <0101 ; IS 組比SS 組有明顯增加(P <0101 。圖4各組樹突分支數(shù)比較3討論近年來, 康復(fù)訓(xùn)練在腦損傷恢復(fù)機(jī)制研究

20、中有了一定進(jìn)展, 康復(fù)訓(xùn)練的時機(jī)、方式、環(huán)境等與康復(fù)功能恢復(fù)的關(guān)系已得到較多研究。尋求各種促進(jìn)腦損傷后功能恢復(fù)的有利因素, 是目前研究的重點。多項研究顯示, 豐富環(huán)境3,16、運(yùn)動訓(xùn)練122、適當(dāng)?shù)目祻?fù)治療時機(jī)都是促進(jìn)恢復(fù)的積極因素4,17218。豐富康復(fù)訓(xùn)練正是將以上幾種積極因素結(jié)合了起來。本實驗主要觀察大鼠腦缺血24h 后,IE 組和SE 組飼養(yǎng)于豐富環(huán)境籠, 給予跑籠、轉(zhuǎn)棒、雜技等運(yùn)動訓(xùn)練, 并與IS 組和SS 組在不同時期比較感覺、運(yùn)動及神經(jīng)功能的變化。豐富訓(xùn)練組在第1周的訓(xùn)練安排上以適應(yīng)性為主, 從小的運(yùn)動量逐漸過渡到正常的運(yùn)動量。從第2周開始按實驗安排以計劃運(yùn)動量進(jìn)行訓(xùn)練, 訓(xùn)練的

21、原則是以不使動物疲勞為度。有研究顯示, 如果在損傷早期患肢承擔(dān)了過多的運(yùn)動負(fù)荷, 則反而會加重?fù)p傷18。我們采用Bederson 神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準(zhǔn)、肢體放置測試和足失誤測試評分方法, 對術(shù)后24h 各組動物行為功能進(jìn)行評分, 發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組Bederson 評分均為0分, 說明假手術(shù)對本實驗所研究的大鼠神經(jīng)行為功能沒有影響; IE 組與IS 組Bederson 評分、肢體放置測試和足失誤測試無顯著性差異(P >0105 , 提示缺血受損程度一致。本實驗采用Bederson 神經(jīng)功能評估和肢體放置測試來反映大鼠腦缺血康復(fù)訓(xùn)練后神經(jīng)行為方面的改變, 發(fā)現(xiàn)Bederson 評分IE 組與IS

22、 組在術(shù)后24周相比均有非常顯著性差異(P <0101 , 肢體放置測試IE 組與IS 組在2周時有顯著性差異(P <0105 , 在34周時有非常顯著性差異(P <0101 , 且IE 組與假手術(shù)組相比, 肢體放置測試評分3周時無顯著性差異。說明經(jīng)過豐富康復(fù)訓(xùn)練,IE 組比IS 組神經(jīng)行為方面恢復(fù)更明顯。足失誤測試能反映腦缺血大鼠協(xié)調(diào)與綜合運(yùn)動能力的改變, IE 組在14周與IS 相比均有非常顯著性差異(P <0101 , 與假手術(shù)組相比在第4周時無顯著性差異, 說明訓(xùn)練后大鼠的協(xié)調(diào)、綜合502運(yùn)動能力已有顯著改善。從以上測試結(jié)果可以看出, 豐富康復(fù)訓(xùn)練促進(jìn)了缺血再灌

23、注腦損傷大鼠各項功能的恢復(fù)。腦結(jié)構(gòu)可塑性改變是腦損傷后功能恢復(fù)的基礎(chǔ)。作為神經(jīng)可塑性的一個重要方面, 神經(jīng)發(fā)生(neuro 2genesis 在腦損傷患者的功能恢復(fù)中發(fā)揮著重要作用。神經(jīng)發(fā)生包括軸突再生和樹突分支生長。由于樹突分支的增加可以提供更多表面進(jìn)行突觸發(fā)生, 重建軸2樹連接, 因此樹突分支的增加是神經(jīng)發(fā)生的重要組成部分19。本研究中, 訓(xùn)練28d 后對大鼠損傷對側(cè)大腦皮層前肢運(yùn)動代表區(qū)第層錐體神經(jīng)元樹突生長情況進(jìn)行觀察, 發(fā)現(xiàn)樹突分支數(shù)各組比較IE 組比IS 組增加(P <0101 ,IS 組與SS 組相比有非常顯著性差異(P <0101 ,SE 組與SS 組相比也有明顯增

24、加(P <0101 。IE 組與IS 組相比樹突分支的增多, 說明豐富康復(fù)訓(xùn)練組與SS ; SS 明顯增加, 。在本研究中, 豐富康復(fù)訓(xùn)練促進(jìn)了大鼠缺血再灌注腦損傷后功能的恢復(fù), 并加強(qiáng)了損傷對側(cè)大腦皮層神經(jīng)元的可塑性改變, 以上作用可能是多種積極因素綜合作用的結(jié)果。大腦皮層缺血或局灶性、創(chuàng)傷性損傷可作為一種刺激引起大量神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化, 引起一定的自發(fā)性功能恢復(fù); 運(yùn)動訓(xùn)練可加強(qiáng)這種可塑性改變和功能的恢復(fù)8。研究顯示, 簡單運(yùn)動方式如跑籠僅可促進(jìn)腦血管生成20, 而復(fù)雜技巧訓(xùn)練如轉(zhuǎn)棒和雜技(acrobatic task 可增加腦皮層突觸數(shù)量21。豐富生存環(huán)境能使缺血

25、損傷大鼠有更多機(jī)會參與各種活動以及與其他大鼠接觸, 并且促進(jìn)一些神經(jīng)營養(yǎng)因子3,22的表達(dá), 從而改善缺血大鼠的結(jié)局。缺血損傷大鼠神經(jīng)可塑性的敏感期是損傷后的早期階段, 本研究中康復(fù)訓(xùn)練正是選擇了在可塑性較強(qiáng)的缺血早期開始。綜上所述, 豐富康復(fù)訓(xùn)練確實能促進(jìn)缺血再灌注腦損傷大鼠功能的恢復(fù), 并加強(qiáng)大腦皮層功能相關(guān)皮層的可塑性改變。豐富康復(fù)訓(xùn)練的作用可能是多種積極因素綜合作用的結(jié)果, 關(guān)于這幾種因素相互間的影響, 及各種因素對大鼠功能改善貢獻(xiàn)的大小還需要進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn)1徐莉, 李玲, 陳景藻, 等. 康復(fù)訓(xùn)練對大鼠腦梗死神經(jīng)功能恢復(fù)的影響J.中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志, 2000, 22(2

26、 :86-88.2BiernaskieJ , Corbett D. Enriched rehabilitative training promotes improved forelimb motor function and enhanced dendritic growt h af 2ter focal ischemic injury J .J Neurosci , 2001, 21(14 :5272-5280.3DahlqvistP , Ronnback A , Risedal A , et al. Effect s of postischemicenvironment on transc

27、ription factor and serotonin receptor expression after permanent focal cortical ischemica in rat sJ.Neurosci , 2003, 119(3 :643-652.4裘濤, 陳眉, 洪雪琴, 等. 早期康復(fù)訓(xùn)練對腦卒中患者各項功能恢復(fù)的影響J.浙江實用醫(yī)學(xué), 2004, 9(6 :414-415. 5Taub E , Uswatte G , Elbert T. New treat ment s in neurorehabilitati 2on founded on basic research

28、J .Nature Riviews Neuroscience , 2002,3(3 :228-236.6廖維靖, 劉淑紅, 范明, 等. 線栓阻斷大鼠大腦中動脈制作缺血性腦損傷模型的改良J.中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志, 2002, 24(6 :349-352.7BedersonJB , Pitt s L H , Tsuji M , et al. Rat middle cerebral artery occlusion :evaluation of t he model and development of a neurologic examinationJ.Stroke , 1986, 17(3

29、:472-476.8江城, 廖維靖, 楊萬同, 等. 豐富康復(fù)訓(xùn)練對腦缺血大鼠行為功能表J.2006, 21(3 :200-, . 中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 21(3JonesTA , Chu CJ , Grande LA , et al. Motor skills t raining en 2hances lesion 2induced structural plasiticity in t he motor cortex of a 2dult rat sJ.J Neurosci , 1999, 19(22 :10153-10163.11OhlssonAL , Johansson BB

30、. Environment influences functional out 2come of cerebral infarction in rat sJ.Stroke , 1995, 26(4 :644-649.12G laser EM , van der Loos H. Analysis of t hick brain sections by ob 2verse computer microscopy :applicationof a new , high clarity G olgi 2Nissl stainJ.J Neurosci Met hods , 1981, 4:117-125

31、.13包新民, 舒斯云. 大鼠腦立體定位圖譜M .北京:人民衛(wèi)生出版社, 1991.14G ibb R , K olb B. A met hod for vibratome sectioning of G olgi 2Coxstained whole rat brainJ.J Nurosci Met hods , 1998, 79(1 :1-4. 15K olb B , Ladowski R , G ibb R , et al. Does dendritic growt h underlyrecovery from neonatal occipital lesions in rat sJ.Behav Brain Res , 1996, 77:125-133.16BrionesTL , Suh E , Jozsa L , et al. Behaviorally 2induced ultrastruc 2tural plasticity in t he hippocampal region after cerebral ischemia