骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肺動(dòng)脈高壓的研究進(jìn)展分享

1、真誠為您提供優(yōu)質(zhì)參考資料，若有不當(dāng)之處，請(qǐng)指正。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肺動(dòng)脈高壓的研究進(jìn)展來源：創(chuàng)新醫(yī)學(xué)網(wǎng)肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension, PAH)是一組以肺血管阻力持續(xù)增加為主要特征的臨床綜合征,其病因和發(fā)病機(jī)制未明,臨床治療困難,預(yù)后較差。近年來隨著分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展,特別是干細(xì)胞的研究,給PAH的治療帶來了新的曙光。本文現(xiàn)就骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)治療PAH的進(jìn)展進(jìn)行綜述。 1 BMsCs的生物學(xué)特性早在1867年,德國科學(xué)家Cohnheim發(fā)現(xiàn)骨髓中除了造血干細(xì)胞以

2、外還有一些非造血干細(xì)胞。此后Friedenstein進(jìn)一步描述了這些呈紡錘狀貼壁生長的細(xì)胞,并發(fā)現(xiàn)在一定條件下能分化形成類似骨及軟骨的沉積物,這種細(xì)胞就是BMSCs1。骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞占有核細(xì)胞總數(shù)的0.001% 0.010%,并隨年齡的增長而減少,分析間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),20%為G0期細(xì)胞,大多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期,表明間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度的分化潛能。 BMSCs既有間質(zhì)細(xì)胞的表面抗原特征,又有內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞的表面抗原,但不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原標(biāo)志(CD14,CD34,CD45),也不表達(dá)與人白細(xì)胞抗原相關(guān)的因子(B7-1,B7-2,人白細(xì)胞抗原DR等),缺少特異的表

3、面標(biāo)志分子。 BMSCs表達(dá)的主要分子包括: 黏附分子,如 CD166、CD54、CD1o2、CD44、CD106等。 生長因子和細(xì)胞因子受體,如白介素受體(IL-1R、IL-3R、 IL-4R、IL-6R、IL-7R),y干擾素受體(IFN-yR)、腫瘤壞死因子(TNR-)等。整合素家族成員,包括CD49、CD29、CD104等。 其他,如CD90、 CD105等2。根據(jù)這些單克隆抗原陽性特征,可以對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離純化,得到純度較高的 BMSCs。 2 BMsCs的多向分化潛能 BMSCs在一定條件下可定向分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨髓基質(zhì)及星形細(xì)胞, 另外還可以向

4、外胚層內(nèi)胚層的細(xì)胞分化。Khoo等采用以生長因子刺激為基礎(chǔ)的三階段神經(jīng)元分化程序 (使 用 FGF-2/EGF/PDGF/SHH/FGF-8/ GDNF)刺激BMSCs,發(fā)現(xiàn)所形成的神經(jīng)元細(xì)胞在形態(tài)及基因表達(dá)等方面是不成熟的,能夠形成神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu),并高表達(dá)NES及NR4A23。Xing等采用聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)作為支架,分離培養(yǎng)大鼠BMSCs,并用5胞苷及0,1umol/L血管緊張素 刺激24h后完全培養(yǎng)基培養(yǎng),形成心肌樣細(xì)胞, 表達(dá)心肌細(xì)胞的標(biāo)志物抗原肌鈣蛋白I4。Li等將大鼠BMSCs接種于3D PLGA支架,培養(yǎng)3周后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)較高水平的肝細(xì)胞標(biāo)志物如白蛋白、甲胎蛋白、角蛋白1

5、8、肝細(xì)胞核因子及細(xì)胞色素P4505。干細(xì)胞之所以具有多向分化潛能,與其復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。細(xì)胞因子、黏附分子、轉(zhuǎn)錄因子等因素參與,包括多潛能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Nanog和Sox2等,組成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)與干細(xì)胞多潛能性和自我更新相關(guān)的分子的表達(dá)6。如IL- 17能夠刺激BMSCs表達(dá)瘦素7。TGF-1能夠刺激BMSCs向成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞分化,而抑制其向脂肪細(xì)胞分化3。另外,表觀遺傳修飾,如組蛋白和DNA甲基化等,可以協(xié)同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子來共同維持胚胎干細(xì)胞狀態(tài)基因的表達(dá)。3 BMsCs治療PAH的機(jī)制 3.1 糾正內(nèi)皮細(xì)胞障礙 血管內(nèi)皮是一種抗血栓形成的半透膜,能夠維持正常血管張力、止

6、血、生長、分化、趨化及創(chuàng)傷修復(fù)等。內(nèi)皮細(xì)胞異常及功能障礙對(duì)于PAH的形成具有重要作用9。研究表明PAH時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷,凋亡細(xì)胞數(shù)量增加,同時(shí),由于啟動(dòng)損傷修復(fù)機(jī)制,血管平滑肌細(xì)胞異常增生,形成PAH的特有損傷叢狀損傷,血管腔狹窄甚至閉塞,血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變。BMSCs移植后在局部微環(huán)境的作用下,特別是血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)及流體剪應(yīng)力等機(jī)械刺激的協(xié)同作用下向內(nèi)皮細(xì)胞分化10,整合到血管內(nèi)皮,從而糾正內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量異常及功能障礙,這可能是治療PAH的主要機(jī)制。然而也有不同聲音,Sahara等采用未分離的骨髓細(xì)胞移植治療MCT大鼠加左肺切除的 PAH模型時(shí)。雖然見到到達(dá)內(nèi)皮層的細(xì)胞是中層

7、的十倍,但還是相當(dāng)少的細(xì)胞整合到內(nèi)皮層,原因可能是種子細(xì)胞的來源不同11,即抑制的是未分離的骨髓細(xì)胞。而Rochefort采用同位素示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn) BMSCs移植后并沒有定位于肺血管壁,而大部分定位于骨髓12,這提示可能還存在其他機(jī)制。 3.2 糾正血管舒縮物質(zhì)比例 內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的主要表現(xiàn)就是舒血管物質(zhì)如No、前列環(huán)素與縮血管物質(zhì)血栓素A2、內(nèi)皮素和五羥色胺等的比例失衡,調(diào)節(jié)血管舒縮物質(zhì)的比例是治療PAH的靶點(diǎn)。前列環(huán)素I2(PGI2)是膜磷脂釋放的花生四烯酸的代謝產(chǎn)物,主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生。PGI2是重要的血管內(nèi)皮舒張因子,還具有抑制血管中層平滑肌細(xì)胞增殖及血小板聚集作用。PG12可以促

8、使內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO,而No也能促使PGI2生成增加。 PAH時(shí)前列環(huán)素合酶(PCS)表達(dá)降低,PGI2生成減少。Takemiya等研究發(fā)現(xiàn),給野百合堿誘導(dǎo)的 PAH大鼠模型靜脈注射攜帶有PCS基因的 BMSCs后,采用同位素示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)BMSCs主要聚集在肺臟,而且治療組肺臟的前列環(huán)素水平增高且維持較長時(shí)間,治療組100%存活期超過7周, 而對(duì)照組僅為38%和44%,能夠明顯改善PAH的預(yù)后13。 3.3 糾正鉀離子通道的異常,抑制平滑肌細(xì)胞增生鉀離子通道是一種高度選擇性的蛋白通道,共有 4種類型:鈣活化型鉀離子通道、內(nèi)向性整流型鉀離子通道、串聯(lián)孔域型鉀離子通道及電壓依賴型鉀離子通道(volt

9、age dependent K+ challnel,Kv)。其中 Kv是目前研究最多的一種。Kv對(duì)于維持膜電位以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度具有重要意義,抑制 Kv會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜電位升高而去極化,激活電壓門控鈣離子通道,使鈣離子進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)而導(dǎo)致血管收縮、平滑肌細(xì)胞增殖,并且抑制其凋亡14-15。特發(fā)性 PAH患者與繼發(fā)性PAH患者相比,其肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Kv明顯受到抑制,從而細(xì)胞鈣離子內(nèi)流增多,使肺動(dòng)脈收縮加強(qiáng),平滑肌細(xì)胞增殖1161。在減肥藥右旋酚氟拉明誘發(fā)的PAH中,發(fā)現(xiàn)不僅僅是平滑肌細(xì)胞,巨核細(xì)胞也同樣存在Kv缺陷,這種缺陷導(dǎo)致血小板釋放五羥色胺增多,再攝取減少,從而引起血管張力的增高17。

10、缺氧可抑制肺阻力血管平滑肌細(xì)胞的Kv,導(dǎo)致鈣離子通道開放增加,從而引起缺氧性肺血管收縮及平滑肌細(xì)胞增殖,改善Kv 功能能夠抑制PAH的發(fā)展18。研究表明利用腺病毒轉(zhuǎn)染的survivin磷酸化缺陷基因能夠增加鉀離子通道的表達(dá),抑制PAH的形成19,而采用載有 survivin磷酸化缺陷基因的BMSCs則可能會(huì)通過增加鉀離子通道的表達(dá)而起作用。也有研究表明, 轉(zhuǎn)載有腎上腺髓質(zhì)素基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞 (endothelium progenitorcells,EPCs)移植較單獨(dú)移植EPCs更有效的抑制野百合堿誘導(dǎo)的PAH20。 3.4 抑制炎癥反應(yīng) 目前認(rèn)為多種細(xì)胞因子參與的炎癥機(jī)制是PAH發(fā)生的重要原

11、因。缺氧、自身抗體、病原微生物等多種因素可以導(dǎo)致促炎因子表達(dá)升高,激活炎癥細(xì)胞和下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,啟動(dòng)平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的增殖過程和炎性病變, 進(jìn)而引起微血管管腔變狹與閉塞,形成PAH。干細(xì)胞移植可以抑制促炎因子的釋放,抑制炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)血管對(duì)血管活性物質(zhì)的反應(yīng)性21,從而抑制 PAH的形成。 3.5 補(bǔ)充內(nèi)源性EPCs 循環(huán)中EPCs是一小群來源于骨髓的干細(xì)胞,能夠隨著血液循環(huán)到達(dá)血管內(nèi)皮,對(duì)于修復(fù)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞具有重要意義。大量研究表明PAH時(shí)EPCs明顯減少,而去除循環(huán)中 EPCs時(shí)則可能會(huì)發(fā)生肺間質(zhì)纖維化和PAHE222-24。移植BMSCs后可能會(huì)增加循環(huán)中的EPCs,從而達(dá)到

12、抑制PAH的形成。這已經(jīng)在體外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。Zhao等取骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞,采用內(nèi)皮培養(yǎng)基培養(yǎng)710d后呈現(xiàn)典型的內(nèi)皮細(xì)胞樣改變, 包括細(xì)胞呈鋪路石樣排列,并表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物, 如Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?荊豆凝集素,血管假性血友病因子和胎兒肝激酶1(Flk-1),表達(dá)率高達(dá)65%83%25。Raida等采用重組人骨形成蛋白2(rhBMP-2)刺激BMSCs后發(fā)現(xiàn)VEGF及胎盤生長因子表達(dá)明顯增加,用培養(yǎng)BMSCs的細(xì)胞培養(yǎng)液上清刺激EPCs則能引起EPCs明顯增殖, 單用rhBMR2刺激EPCs則不能引起其增殖,但可引起其趨化性增強(qiáng)。這提示BMR2可能通過刺激 BMSCs分泌一些

13、生長因子來誘導(dǎo)EPS增殖及趨化的。 3.6 促使新生血管形成 肺微循環(huán)血管閉塞、血管床減少是PAH的重要原因之一。BSMCs移植后可能通過產(chǎn)生血管生長因子等來刺激新生血管形成,從而改善肺微循環(huán),達(dá)到降低肺動(dòng)脈壓的目的。新生血管的形成是一種復(fù)雜的過程,是多種分子與細(xì)胞相互作用的結(jié)果,不僅包括內(nèi)皮細(xì)胞、循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞,還包括VEGF、BMP2、ICAM等, BSMCs移植可以修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷,并通過分泌細(xì)胞因子及生長因子等引起血管新生,Sanz等26的研究表明了這一點(diǎn)。Duffy等發(fā)現(xiàn),在血管形成的早期,BMSCs能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移,降低內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,且這種作用呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴

14、關(guān)系。提示BMSCs在新生血管形成、穩(wěn)定與成熟方面發(fā)揮著重要的作用27。 4 BMSCs治療PAH的臨床應(yīng)用我國浙江醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的Wang 等28選擇特發(fā)性PAH患者31例,診斷依據(jù)臨床評(píng)估、右心導(dǎo)管、超聲心動(dòng)圖、螺旋CT、肺血管造影、及肺通氣灌注掃描、肺功能測試,心功能NYHA2-3級(jí),平均肺動(dòng)脈壓力大于30mmHg、6分鐘步行距離測試大于等于50m。每例患者抽取250ml外周血,通過Ficoll密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞,培養(yǎng)在纖連接蛋白包被的培養(yǎng)皿中,采用含20%人血清及血管內(nèi)皮生長因子50ng/ml的M199培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。5d后90%的細(xì)胞顯示DiI-acLDL陽性。31例

15、患者隨機(jī)分為治療組與對(duì)照組,治療組在傳統(tǒng)治療的基礎(chǔ)上以(1.1 0.6) 107個(gè)細(xì)胞制成 10ml細(xì)胞懸液靜脈注人,共16例;對(duì)照組15例進(jìn)行傳統(tǒng)治療。隨訪12周,治療組組6分鐘步行距離平均增加48.2m,而對(duì)照組增加5.7m,兩組之間差別顯著。治療組平均肺動(dòng)脈壓、肺血管阻力和心輸出量明顯改善,且未發(fā)生嚴(yán)重事件。該研究顯示靜脈注射自體EPCs細(xì)胞是可行的、安全的,并且具有增加IPAH患者運(yùn)動(dòng)能力和改善肺動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)的益處。此后,Patel等29報(bào)道了2例,其中一例是44歲高加索人,慢阻肺合并PAH患者,接受干細(xì)胞移植后在數(shù)天內(nèi)癥狀改善明顯,然而隨后數(shù)月內(nèi)逐漸惡化,盡管癥狀逐漸惡化,他的6分

16、鐘步行距離及心臟彩超檢查結(jié)果均保持較移植前改善狀態(tài),2 年后準(zhǔn)各接受再次移植。另一例是78歲老年高加索男性,慢阻肺合并PAH患者,接受干細(xì)胞移植后癥狀并無明顯改善,但移植3個(gè)月后彩超檢查右心舒張末壓41mmHg,較基礎(chǔ)55mm Hg明顯減低, 隨訪一年無明顯變化。這與Zhao等報(bào)道的結(jié)果明顯不同,由于臨床報(bào)道較少,具體原因有待于繼續(xù)觀察。eward等報(bào)道8例嬰兒惡性骨硬化癥患者同種異體干細(xì)胞移植后并發(fā)重度PAHE3。彐,G gg等也報(bào)道1例36歲女性移植物抗宿主反應(yīng)患者發(fā)生 PAH31,這也為干細(xì)胞移植的安全性提出了挑戰(zhàn)。 5 問題與展望盡管近年來對(duì)BMSCs的研究取得了很大進(jìn)展,但仍然存在以下問題尚待解決: 目前很多結(jié)果均來自動(dòng)物實(shí)驗(yàn),臨床數(shù)據(jù)較少且結(jié)果不一,為進(jìn)一步