禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體的制備和再生研究

1、收稿日期 :2000 09 07基金項(xiàng)目 :江蘇省青年基金 BQ98017, 333基金 , 863項(xiàng)目 B H 02 03 01, 歐共體資助項(xiàng)目作者簡(jiǎn)介 :林玲 , 1973 , 女 , 碩士 , 江蘇省農(nóng)科院植物保護(hù)研究所實(shí)習(xí)研究員 , 主要從事小麥病害致病機(jī)理與防治的研究 . 禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體的制備和再生研究林玲 , 史建榮 , 陳懷谷 , 石志琦 , 王裕中(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 , 南京 , 210014摘要 為建立禾谷鐮孢菌 (Fusarium graminearum Schwabe 轉(zhuǎn)化體系 , 選用禾谷鐮 孢菌株 F128為受體 , 分 別用 裂解酶、 蝸牛酶、

2、崩潰酶、 纖維素酶、 幾丁質(zhì)酶消化該菌細(xì)胞壁 , 都可獲得 一定數(shù)量的原生 質(zhì)體 . 其中產(chǎn)生原 生質(zhì) 體 效率最高的是崩潰酶 , 而且以 5g/L濃度產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量最多 , 消化 3. 54. 5h 即可獲得相當(dāng)數(shù)量的原生 質(zhì)體 . 菌量的加入以每毫升酶解液中加入 20mg 濕菌絲產(chǎn) 生的原生 質(zhì)體最多 . 所制備出 的原生質(zhì) 體的再生 方式 至少有 2種 .關(guān)鍵詞 禾谷鐮孢菌 ; 原生質(zhì)體制備 ; 再生中圖分類號(hào) Q93 335; 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A; 文章編號(hào) 1001 4616(2001 01 0088 040 引言對(duì)病原菌基因表達(dá)系統(tǒng)的研究是探討植物病原菌的致病機(jī)制 , 尋求控制植物

3、病害的有效 途徑 1, 2. 近年來(lái)對(duì)植物病原菌的遺傳轉(zhuǎn)化研究已取得較大進(jìn)展 , 其中 , 有關(guān)病原菌原生質(zhì)體 的制備和再生技術(shù)是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵 3. 禾谷鐮孢菌 (Fusarium graminearum Schwabe 是小 麥赤霉病的病原菌 , 而小麥赤霉病是影響我國(guó)長(zhǎng)江中下游、 東北麥區(qū)以及世界其他溫暖潮濕地 區(qū)重要的災(zāi)變性病害 . 近年來(lái) , 在歐美等國(guó)家小麥赤霉病發(fā)生嚴(yán)重 , 研究小麥赤霉病的致病機(jī) 理以及病害防治已成為一個(gè)熱點(diǎn) . 現(xiàn)有的關(guān)于小麥赤霉病菌致病機(jī)理的報(bào)道還不多 , 為了進(jìn)行 禾谷鐮孢菌致病性相關(guān)基因的研究 , 我們對(duì)禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體的制備方法與條件以及原生 質(zhì)

4、體再生等方面進(jìn)行了研究 . 1 材料和方法1 1 供試菌株禾谷鐮孢菌株 F128, 由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所保存 .1 2 培養(yǎng)基產(chǎn)孢培養(yǎng)基 :綠豆湯 (4g/L.液體培養(yǎng)基 :Medium A, 參考 Miller 等的方法 4, 配方為葡萄糖 20g/L, NH 4Cl 3g/L,KH 2PO 42g/L, FeSO 4 7H 2O 0. 2g/L,MgSO 42g/L, peptone 2g/L,yeast e xtrac t 2g/L, malt extract 2g/L.再生培養(yǎng)基 :PDA.1 3 細(xì)胞壁消解酶液溶菌酶 Lysozyme (上海 Promega 公司 , 崩

5、潰酶 Driselase (Sigma 產(chǎn)品 , 蝸牛 酶 Snailase(國(guó) 第 24卷第 1期2001年 南京師大學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版 J OURNAL OF NANJING NOR MAL UNIVERSITY(Natural Science Vol. 24No. 12001產(chǎn) , 纖維素酶 (Serva 產(chǎn)品 , 幾丁質(zhì)酶 (Sigma 產(chǎn)品 . 各酶均用 1mol/LNH 4Cl 配制 .1 4 原生質(zhì)體的制備步驟主要根據(jù) Wiebe 的方法 5, 并作適當(dāng)修改 , 以下過(guò)程均在無(wú)菌條件下操作 , 除注明溫度條 件外 , 其它操作溫度均為 4 . 挑取在 PDA 平板上生長(zhǎng)的菌絲團(tuán)

6、, 放入產(chǎn)孢培養(yǎng)基中 , 在旋轉(zhuǎn)搖 床上振蕩培養(yǎng) 6d(25 , 180r/min , 然后轉(zhuǎn)接分生孢子液至 Medium A 中 , 使起始接種濃度為 103/mL,25 , 120r/min培養(yǎng) 34h 左右 , 真空抽濾收集菌絲 , 并用 1mol/LNH 4Cl 洗 1次 , 每亳升 消化酶液加入 20mg 濕菌絲 , 在搖床上振蕩 3. 5h(28 , 100r/min.消化后的細(xì)胞懸浮液用雙 層擦鏡紙過(guò)濾 , 濾去未消化的菌絲體 . 原生質(zhì)體通過(guò) 5000r/min離心 10min 收集 , 再用 1mol/L NH 4Cl 洗滌 2次 , 最終將原生質(zhì)體懸浮于 1mol/L NH

7、 4Cl 中 , 即得到可用于轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體 . 1 5 原生質(zhì)體的形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)在光學(xué)顯微鏡 ( 400 下觀察 , 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù) .1 6 原生質(zhì)體的再生觀察吸取 12滴原生質(zhì)體懸浮液涂布在再生培養(yǎng)基平板上 , 置于 25 恒溫培養(yǎng) , 定時(shí)取出在 光學(xué)顯微鏡 ( 400 下觀察其生長(zhǎng)進(jìn)度 .1 7 菌絲干重的測(cè)定將 真空抽濾過(guò)的菌絲 , 用 1mol/L NH 4Cl 洗 1次 , 置于烘箱中 80 烘干 24h. 每個(gè)處理 3個(gè)重復(fù) . 2 結(jié)果2 1 原生質(zhì)體的制備2. 1. 1 不同酶類對(duì)原生質(zhì)體形成的影響單種酶類以崩潰酶的酶解效果最好 , 幾丁質(zhì)酶次之 , 溶菌酶最差 , 如

8、圖 1所示 . 另外用蝸牛 酶制備的原生質(zhì)體中雜質(zhì)較多 , 而用溶菌酶和纖維素酶制備的原生質(zhì)體 , 大小不均一 , 有大量 小的原生質(zhì)體 . 崩潰酶所制備的原生質(zhì)體不僅背景清晰而且大小均一 .2. 1. 2 酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響由圖 2可見(jiàn) , 當(dāng) Drisalase(5g/L處理時(shí)間達(dá) 3. 5h 后 , 即原生質(zhì)體釋放量達(dá)最高峰后趨于穩(wěn)定 . 所以 , 要獲得大量的原生質(zhì)體 , 對(duì)禾谷鐮孢菌 F128而言 , 以酶反應(yīng) 3. 54. 5h 為宜 .圖 1 不同酶制備原生質(zhì)體的效果 圖 2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響2. 1. 3 酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響由圖 3可見(jiàn) , 在相

9、同的實(shí)驗(yàn)條件 (溫度 28 , 反應(yīng)時(shí)間 3. 5h 下 , 由 Driselase 處理后原生質(zhì) 林 玲 , 等 :禾 谷鐮孢菌原生質(zhì)體的制備和再生研究體產(chǎn)生的數(shù)量隨著酶濃度的增加而增多 , 當(dāng)酶濃度為 5g/L 時(shí) , 產(chǎn)生原生質(zhì)體數(shù)量達(dá)到最高值 之后 , 酶濃度繼續(xù)增加 , 所產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量幾乎不再增長(zhǎng) . 所以 , 進(jìn)行大量原生質(zhì)體制備實(shí) 驗(yàn)時(shí) , 酶的濃度宜采用 5g/L.2. 1. 4 菌量對(duì)原生質(zhì)體形成的影響由圖 4可見(jiàn) , 每毫升酶解液中加入 20mg 濕菌絲時(shí) , 所產(chǎn)生的原生質(zhì)體最多 , 每毫升酶解液 中濕菌絲量超過(guò)或小于 20mg 時(shí)都使原生質(zhì)體產(chǎn)生的數(shù)量減少 . 因

10、此 , 每毫升酶解液中應(yīng)選用 20mg 濕菌絲以最大限度的獲得 F128的原生質(zhì)體 .圖 3 崩潰酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 圖 4 菌量對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 2 2 原生質(zhì)體的再生方式觀察新制備的 F128菌株的原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基中萌發(fā)至少有 2種方式 , 一種直接萌發(fā)出菌 絲狀的芽管 , 另一種為類似于芽殖酵母的分裂方式 . 芽管不斷伸長(zhǎng) , 繼而分枝 , 最終形成典型的 樹枝狀形態(tài) , 如圖 5所示 .A 用 Driselase 制備的 F128 菌株的原生質(zhì)體 B 原生質(zhì)體直接萌發(fā)出菌絲狀的芽管C 原生質(zhì)體萌發(fā)以類似于芽殖酵母的分裂方式進(jìn)行 D 由原生質(zhì)體生長(zhǎng)的典型的禾谷鐮孢菌菌絲圖

11、 5 禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體及其發(fā)育狀況 ( 400 南京師大學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版 第 24卷第 1期 (2001年 3 討論因真菌細(xì)胞壁由幾丁質(zhì)、 糖原、 蛋白質(zhì)、 半纖維素等多種成分構(gòu)成 , 真菌在形成原生質(zhì)體的 過(guò)程中 , 真菌的細(xì)胞壁被細(xì)胞壁消解酶消解出一個(gè)個(gè)小孔 , 這樣原生質(zhì)體就從這些小孔中溢出 到周圍的等滲液中 6. 裂解酶與纖維素酶消解細(xì)胞壁不完全 , 只能形成小的原生質(zhì)體 , 而崩潰 酶是一種復(fù)合酶 , 內(nèi)含昆布多糖酶 (laminarinase 、 木聚糖酶 (xylanase 和纖維素酶 (cellulase , 消 解細(xì)胞壁的能力強(qiáng) , 能完全降解禾谷鐮孢菌 F128的細(xì)胞壁

12、 , 生成的原生質(zhì)體大而均一 . 禾谷鐮 孢菌原生質(zhì)體制備所需崩潰酶的濃度要比稻瘟病菌所用的高 3, 這可能與禾谷鐮孢菌的細(xì)胞 壁結(jié)構(gòu)有關(guān) . 本研究還明確了禾谷鐮孢菌原生質(zhì)體制備時(shí)所用酶的最適濃度、 最適反應(yīng)時(shí)間以 及所用菌的量 , 所制備出的原生質(zhì)體可在 4 存活 1周以上 , 為建立轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行限制性內(nèi)切 酶誘導(dǎo)整和 (Restriction Enzyme Mediated Inte gration, RE MI 及禾谷鐮孢菌致病性相關(guān)基因的研究 奠定了基礎(chǔ) .致謝 :本所周益軍 , 張文薈老師對(duì)本文給予的關(guān)心與幫助 .參考文獻(xiàn) 1 唐國(guó)敏 . 絲狀真菌基因表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展 J. 真菌學(xué)

13、報(bào) , 1992, 11(2 :81 88.2 閆培生 , 羅信昌 , 周啟 . 絲狀真菌基因工程研究進(jìn)展 J. 生物工程進(jìn)展 , 1999, 19(1 :36 41.3 周益軍 , 范永堅(jiān) , 王金生 , 等 . 稻瘟病菌原生質(zhì)體的制 備和再生菌 株的致病 性 J.江蘇農(nóng)業(yè) 學(xué)報(bào) , 2000, 16 (2 :83 87.4 Miller J D, Greenhalgh R, Wang Y Z, et al . Trichothecene chemotypes of three Fusa rium species J. Mycologia, 1991, 83(2 :121 130.5 Wie

14、be M G, Novakova M , Miller L, et al . Protoplast production and transformation of morphological mutants of the Quorn R myco protein gungus, Fusarium graminearum A3/5, using the hygromycin Bresistance plasmid Pan 7-1J. Micol Res, 1997, 101(7 :871 877.6 Harris G M. Protoplasts from Gibberella fujikur

15、oiJ.Phytopathology, 1982, 72:1403 1407.Preparation and Regeneration of Proplasts forFu sarium garaminearum SchwabeLin Ling, Shi Jianrong, Chen Huaigu, Shi zhiqi, Wang Yuzhong(Ins ti tute of plant protection, Jiangs u Acade my of Agricultural Sciences, Nanjing, 210014, PR CAbstract:Strain F128of Fusa

16、rium graminearu m Sch wabe was selected as recipient to develop the transformation system. Enough protoplasts were obtained by digestion of the fungal cell wall with lysozyme, cellulase, snailase, chitinase, d riselase. Driselase had the highest efficiency among them. The mos t protoplasts were gai ned wi th 5g/L f