小鼠肝臟RNA的提取純化與鑒定

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告一、實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2011 年 11 月 21 日 10:0017:30二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：小鼠肝臟RNA的提取純化與鑒定三、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私饪俁NA提取的基本原理、應(yīng)用及操作的注意 事項(xiàng)，熟悉掌握組織中總 RNA提取方法及其檢測(cè)方法。四、實(shí)驗(yàn)原理：在真核生物，由于絕大多數(shù)基因含有內(nèi)含子，因此不能直接由基 因組克隆目的基因，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA或構(gòu)建cDNA文庫 是獲取真核生物表達(dá)基因的主要手段，此外，在利用 Northern印跡 雜交等技術(shù)分析基因表達(dá)水平時(shí)也需要提取 RNA.本實(shí)驗(yàn)要求自小鼠 肝臟提取RNA并通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)， 通過紫外 分光光度法進(jìn)行定量

2、。RNA是極易降解的核酸分子，這主要是因?yàn)?RNA酶分布廣、活 性強(qiáng)、且難以失活，痕量的 RNA酶就能夠造成嚴(yán)重的RNA降解。抑 制RNA酶活性的方法很多，但均不能徹底避免RNA酶對(duì)RNA的降解。焦磷酸二乙酯（DEPC是一種強(qiáng)烈的烷化劑，它通過和 RNA酶 的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制 RNA酶的活性。DEPC是消除 外源性RNA酶的主要方法。以0.1%DEPC處理實(shí)驗(yàn)器皿與試劑配制用 水，基本可以消除外源 RNA酶的污染。但DEPC具有致癌性，在使用 時(shí)一定要留意。DEPC處理的器皿與水必須經(jīng)高壓滅菌處理，使 DEPC 分解后方能使用。值得注意的是，DEPC具有很強(qiáng)的反應(yīng)性，能夠與包括

3、 RNA 在內(nèi)的多種生物分子以及多種化學(xué)試劑作用，因此不能直接用于抑制樣品以及試劑中的 RNA酶活性。在RNA抽提試劑中加入異硫氰酸胍，是抑制樣品來源RNA酶活性的主要方法。作為一種蛋白變性劑，異硫氰酸胍可導(dǎo)致包括 RNA 酶在內(nèi)的所有酶活性的喪失，因此 RNA純化過程中因盡可能去除異 硫氰酸胍，以防止其對(duì)酶促反應(yīng)的影響。 在使用蛋白質(zhì)變性劑的同時(shí)， 更重要的是去除樣品中的蛋白質(zhì)，防止內(nèi)源性RNA酶對(duì)樣品RNA的降解。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)， 反應(yīng)體系中不能含有烷化劑或變性劑， 此時(shí)痕量 的RNA酶也可能對(duì)RNA產(chǎn)生破壞。在這種情況下，最適宜的方法是 加入特異性的RNA酶抑制劑。這類RNA酶抑制劑本身是

4、蛋白質(zhì)，可 專一性作用于RNA酶，對(duì)RNA的逆轉(zhuǎn)錄以及體外翻譯等過程均無干 擾。抽提RNA的關(guān)鍵在于去除DNA與蛋白質(zhì)，最常用的方法是酸性 酚法。苯酚在酸性條件下可溶解 DNA而不溶解RNA同時(shí)酚又是蛋 白變性劑。 利用酸性酚試劑與氯仿的抽提， 可一步完成細(xì)胞的裂解以 及蛋白質(zhì)與RNA的分離。最后利用異丙醇沉淀，即可獲得純化的總 RNA。RNA產(chǎn)物的定量與純度檢測(cè)一般是通過紫外分光光度法。高純度 的RNA其A260/A280應(yīng)處于1.6至1.8之間，A260與RNA濃度呈正相關(guān)。 RNA的完整性可通過電泳檢測(cè)。由于 RNA為單鏈分子，二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù) 雜，必須首先利用甲醛胺變性 RNA再進(jìn)行甲醛變性

5、瓊脂糖凝膠電泳。細(xì)胞總RNA包含了三種主要組分，其中rRNA含量最高，因此在電泳 時(shí)可觀察到18S和28S rRNA的條帶。如兩條條帶清晰，且亮度之比 接近1:2,則表明RNA沒有發(fā)生降解。一般情況下泳道前緣還可觀察 到一條較為模糊且亮度較弱的條帶， 主要由5S、5.8S rRNA與 tRNA組 成。如果RNA嚴(yán)重降解，則此條帶亮度會(huì)明顯增強(qiáng)，mRNA由于含量 較少且長(zhǎng)度不均一，一般觀察不到相應(yīng)的條帶。本實(shí)驗(yàn)的要求是采用酸性酚法自小鼠肝組織抽提 RNA通過甲醛 變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA的完整性，即經(jīng)電泳因觀察到 18S與 28S rRNA的清晰條帶，最后通過紫外分光光度法對(duì) RNA進(jìn)行定

6、量與 純度檢驗(yàn)，計(jì)算RNA產(chǎn)物的濃度與含量。五、主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 ：1、Tissue Rupto,購自 QIAGEN2、塑料器皿，應(yīng)用 0.1%DEP(浸泡12h, 121C高壓滅菌15min，干 燥即可使用。3、無RNA酶水：用去離子水配制 0.1%的DEPQ購自SAGON 37C 保溫12h, 121 C高壓滅菌15min。4、Trizol試劑：酸性酚試劑，購自Takara公司。5、氯仿6、異丙醇7、75%乙醇，購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。& 5X甲醛變性電泳緩沖液： MOPS 0.1M(pH 7.0),乙酸鈉40mM ,EDTA 5mM（pH8.0）。9、RNA電泳用加樣緩沖

7、液：50%甘油，1mM EDTA（pH8.0）, 0.25%溴酚藍(lán)。六、實(shí)驗(yàn)方法與步驟：（一）RNA的抽提1. 引頸處死小鼠，迅速取出肝組織約50100mg于勻漿管，加入Trizol 試劑1ml,充分勻漿，室溫放置10分鐘。2. 12000rpm 離心 10min，取上清。3. 加入氯仿0.2ml,劇烈震蕩15s,4C放置10min,12000rpm離心15min, 取上清。 氯仿的主要作用是將酚從溶液中萃取出來。 離心后溶液分為 三相，即上層的水相， 下層的有機(jī)相以及中間的變性蛋白，小心吸取 上層水相，絕不能有中層蛋白混入。4. 加入異丙醇0.5ml,震蕩混勻，4C放置10min,12000

8、rpm離心10min, 棄上清。 加入 50%的異丙醇可以導(dǎo)致核酸沉淀， 用量應(yīng)于步驟 3上清 液的體積相當(dāng)。5. 1ml 75%乙醇洗滌沉淀，并8000rpm離心5min。（若管壁仍有殘 留液體，繼續(xù)離心，吸取殘留液體） 乙醇洗滌的目的是去除沉淀中 殘留的鹽分。6. 沉淀空氣干燥5min,溶解于70ul DEPC-H2O留樣2山其余-70C保 存?zhèn)溆谩＃ǘ┳贤夥止夤舛确y(cè)定純度和含量采用nanodrop儀器測(cè)定RNA的純度和含量，打開儀器，做好blank,處理試驗(yàn)樣品，取1卩l(xiāng)樣品測(cè)定，讀取數(shù)值。(三) RNA的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)1. 制備瓊脂糖凝膠：將瓊脂糖1g溶于1X TBE

9、100ml冷卻至60 C。 加入至1 X甲醛變性凝膠電泳緩沖液，加入10mlEB混合均勻并灌制膠 板。由于甲醛具有揮發(fā)性，不能直接加熱， 必須對(duì)凝膠單獨(dú)加熱融化 后加入。2. 取2"RNA溶液，加入甲酰胺8山65C變性5分鐘，迅速冰浴冷卻，點(diǎn)樣。加熱后迅速冷卻的目的是防止RNA復(fù)性。3. 150V電泳30分鐘，紫外光下觀察電泳結(jié)果。七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)紫外分光光度法檢測(cè)濃度：3883.5ng/ “A260:97.088A280:47.770260/280 : 2.03260/230 : 1.11(2)電泳檢測(cè)我的結(jié)果28s18s5s八、討論：(1)經(jīng)nanodrop儀器測(cè)定的260/

10、280=2.03，大于2.0，說明已有部 分 RNA 降解了。原因可能有家氯仿萃取離心取上清時(shí)吸到了中層的 蛋白質(zhì)，取出組織后未立即抽提和保存， 作過程中未使用口罩等工具， 又需要進(jìn)行揮發(fā)乙醇等操作，空氣及口中的 RNA 分解酶會(huì)分解 RNA 導(dǎo)致測(cè)量值偏高。 260/230=1.11，說明有雜質(zhì)，純度不高，可能有蛋 白質(zhì)和胍鹽殘留，胍鹽殘留可能是乙醇洗滌不完全。(2)電泳結(jié)果拖帶現(xiàn)象嚴(yán)重，可能是RNA嚴(yán)重降解，被DNA等污染， 也有由于電極緩沖液配置問題，跑膠時(shí)，溫度過高，導(dǎo)致效果較差的 原因。九、實(shí)驗(yàn)思考題 ：1、為何無RNA沉淀：勻漿不完全時(shí)，基因組 DNA分子仍然很大，溶液粘稠。變性的蛋白質(zhì)和基因組DNA 一起形成絮狀凝集物容易包裹 RNA使之不能 有效地釋放到溶液中。2、RNA抽提率低的原因：樣品均化或裂解不完全：勻漿不完全時(shí)，RNA分子易被蛋白質(zhì)和基因組DNA復(fù)合物包裹，不能被有效釋放。終RNA不完全溶解：未溶解的RNA丟失。3、A260/A280 比率小于 1.65 或大于 2.0表示何意：小于 1.65：在分光光度計(jì)測(cè)量前用水而不是用 TE緩沖液稀釋RNA樣品。低離子強(qiáng)度和低pH溶液會(huì)增加280 nm處的光吸收值。樣品勻漿化