二硫化鈦納米片材料用于光聲成像指導(dǎo)下的腫瘤光熱治療研究

1、二硫化鈦納米片材料用于光聲成像指導(dǎo)下的腫瘤光熱治療研究中文摘要最近，有著不尋常物理化學(xué)性質(zhì)的二維納米材料在材料科學(xué)與工程領(lǐng)域被廣泛的研究。石墨烯是一種由碳原子組成呈蜂巢晶格的二維層狀材料，顯示出特殊的電子，光學(xué)，熱力學(xué)，和機械性能。作為一種石墨烯類似物，過渡族金屬二維硫化物如MoS2, MoSe2, WS2, WSe2和Bi2Se3，都是由六邊形的金屬原子夾在兩層硫族元素之間組成三明治結(jié)構(gòu)。近些年這些過渡金屬二維硫化物已經(jīng)發(fā)展成為材料科學(xué)領(lǐng)域的明星材料，并在包括納米醫(yī)藥在內(nèi)的諸多領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用。二硫化鈦是一種典型的過渡族金屬二維硫化物材料，其在電子器件領(lǐng)域或作為一種儲氫材料在最近被廣泛研究

2、。在此篇工作中，我們用自下而上的液相合成方法合成了二硫化鈦納米片，然后用聚乙二醇（PEG）修飾，在各種生理溶液中獲得很好的穩(wěn)定性，以及在體外沒有明顯的毒性。由于在近紅外區(qū)有很強的吸收，TiS2-PEG能夠被用作光聲成像的造影劑。在對攜帶腫瘤的小鼠進行全身給藥后發(fā)現(xiàn)材料能夠在腫瘤部位實現(xiàn)很高的富集。然后我們將TiS2-PEG納米片用于體內(nèi)腫瘤光熱治療，在尾靜脈注射納米材料以及外加近紅外激光照射的情況下能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤的完全消融。我們的工作表明，在經(jīng)過良好的表面修飾后，TiS2納米片能夠作為一種新的光熱制劑用于成像指導(dǎo)下的腫瘤治療。關(guān)鍵詞：二硫化鈦 光聲成像 光熱治療Two-Dimensional T

3、iS2 Nanosheets for in vivo Photoacoustic Imaging and Photothermal Cancer TherapyAbstractRecently, two-dimensional (2D) nanomaterials with unusual physical and chemical properties have been extensively explored in materials science and engineering. Graphene, a 2D single layer of carbon atoms of honey

4、comb lattice structure, as a typical example, has shown exceptional electronic, optical, thermal, and mechanical properties. As the analogues of graphene, transition-metal dichalcogenides (TMDCs) such as MoS2, MoSe2, WS2, WSe2 and Bi2Se3, consisting of hexagonal layers of metal atoms sandwiched betw

5、een two layers of chalcogen atoms, have also become a star in materials science in recent years, showing promising applications in many different areas including nanomedicine.Titanium dichalcogenides (TiS2) is a typical class of TMDC materials and has also been studied recently in electronic devices

6、 or as a hydrogen-storage material. In this study, TiS2 nanosheets, are synthesized by a bottom-up solution-phase method and then modified with polyethylene glycol (PEG), obtaining TiS2-PEG with high stability in physiological solutions and no appreciable in vitro toxicity. Due to their high absorba

7、nce in the near-infrared (NIR) region, TiS2-PEG nanosheets could offer strong contrast in photoacoustic imaging, which uncovers the high tumor uptake and retention of those nanosheets after systemic administration into tumor-bearing mice. We further apply TiS2-PEG nanosheets for in vivo photothermal

8、 therapy, which is able to completely eradicate the tumors on mice upon intravenous injection of TiS2-PEG and the followed NIR laser irradiation. Our work indicates that TiS2 nanosheets with appropriate surface coating (e.g. PEGylation) would be promising new class of photothermal agent for imaging-

9、guided cancer therapy.Keywords: TiS2 photoacoustic imaging photothermal therapy第二章 TiS2納米薄片的制備和表面修飾2.1 引言有著不尋常物理化學(xué)性質(zhì)的二維納米材料在材料科學(xué)與工程領(lǐng)域被廣泛的研究1。石墨烯是一種由碳原子組成呈蜂巢晶格的二維層狀材料，顯示出特殊的電子，光學(xué)，熱力學(xué)，和機械性能2。作為一種石墨烯類似物，過渡族金屬二硫?qū)倩锶鏜oS2, MoSe2, WS2, WSe2和Bi2Se3，都是由六邊形的金屬原子夾在兩層硫族元素之間組成三明治結(jié)構(gòu)3。近些年這些過渡族金屬二硫?qū)倩镆呀?jīng)發(fā)展成為材料科學(xué)領(lǐng)域的明

10、星材料，并在包括納米醫(yī)藥在內(nèi)的諸多領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用4-7?；谶^渡族金屬二硫?qū)倩锏纳飩鞲屑夹g(shù)在最近的很多報道中被闡明8。多個課題組包括我們課題組已經(jīng)探索著使用過渡族金屬二硫?qū)倩镒鳛橐环N新的近紅外吸光材料用作腫瘤的光熱治療9。因為過渡金屬硫化物的大比表面積，過渡金屬硫化物納米薄片也能作為載藥平臺用作腫瘤的聯(lián)合治療10, 11。TiS2是一種典型的拓撲絕緣體材料，其在電子器件領(lǐng)域或作為一種儲氫材料在最近被廣泛研究12, 13。傳統(tǒng)的二硫化鈦薄片是通過化學(xué)氣相沉積法制備的。這種方式需要在基底上溫度超過500度時分解不同的鈦和硫前驅(qū)體，相對比較復(fù)雜而且昂貴。在本篇工作中，我們用自下而上溶液法大

11、規(guī)模高質(zhì)量地合成了TiS2納米薄片。然后用親水性的高分子C18PMH-PEG（聚馬來酸酐-十八烯聚乙二醇）修飾，合成TiS2-PEG。經(jīng)過修飾后的TiS2薄片獲得良好的水溶性和生理穩(wěn)定性，以其進行后續(xù)的細胞和動物實驗。2.2 實驗部分實驗試劑和器材 所有化學(xué)試劑通過商業(yè)渠道購買，未再經(jīng)過處理或者純化。所有實驗用水均為去離子水。聚乙二醇（mPEG-NH2，MW=5000）購買自浙江嘉興博美公司。油胺（OM）、碳十八烯（ODE）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、聚馬來酸酐-1-十八烯（C18PMH）從Sigma-Aldrich公司購買。乙醇、四氯化鈦（TiCl4）、硫粉

12、、三乙胺（TEA）、二氯甲烷（CH2Cl2）、氯仿（CH3Cl）等從國藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司購買。實驗所需耗材購自蘇州科益特生物有限公司。實驗步驟2.2.2.1 TiS2納米薄片的合成標(biāo)準(zhǔn)的步驟描述如下：1mmol 四氯化鈦在室溫下加入到20ml 油胺（OM）和10ml 碳十八烯（ODE）混合液的三頸燒瓶中。在氬氣保護的環(huán)境中，溶液被加熱到140 oC并且磁力攪拌約30分鐘，去除水分和氧氣。然后，溶液的溫度被迅速加熱到300 oC并在氮氣的環(huán)境中保持30分鐘。將2 mmol 的硫粉末溶于5ml的油胺溶液，然后在300 oC時10分鐘內(nèi)加入到燒瓶中。反應(yīng)在300 oC保持1小時。然后降低到室溫，

13、加入過量的乙醇后，二硫化鈦納米薄片能夠被沉淀出來，經(jīng)過離心收集，并用乙醇反復(fù)清洗。2.2.2.2 C18PMH-PEG的合成為了制備C18PMH-PEG，分別稱取10mg C18PMH和143mg mPEG-NH2（5K）溶解在5ml 二氯甲烷中，然后向溶液中加入6l 三乙胺，稱取11mg EDC加入混合溶液中，血清瓶瓶口用封口膜封好，磁力攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，用氮氣將二氯甲烷吹干，加水溶解產(chǎn)物后，將其用移液槍吸入事先準(zhǔn)備好的透析袋中，將兩端封口的透析袋放入滿是雙蒸水的大燒杯中進行透析，期間換水5次。透析完后將液體取出進行凍干。得到的產(chǎn)物為白色海綿狀。2.2.2.3 TiS2納米薄片的表

14、面修飾2ml的TiS2儲存液（5 mg/ml）經(jīng)過14800rpm離心5min后去除上清收集沉淀。向沉淀中加入乙醇清洗兩遍后，離心收集沉淀溶于氯仿。將20mg的C18PMH-PEG溶于2ml 氯仿后加入到TiS2溶液中。攪拌反應(yīng)4小時后用氮氣吹干氯仿，殘余物能夠非常容易地溶于水中。離心除去大顆粒從而獲得TiS2-PEG。 2.2.2.4 TiS2納米薄片的表征高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM，加速電壓200kV）：美國FEI公司，Tecnai F20。X-射線粉末衍射儀（XRD）：荷蘭PANalytical公司，Empyrean，Cu靶。動態(tài)光散射儀：英國Malvern公司，ZEN3690。紫

15、外可見近紅外分光光度計（UV-vis-NIR）：HORIBA公司，LAMBDA 750。2.3 結(jié)果與討論2.3.1 TiS2納米薄片的合成與表征TiS2的合成: 在油胺（OM）和十八碳烯（ODE）的混合溶液中加入TiCl4前驅(qū)體，整個過程通以氮氣并進行加熱。在此過程中，鈦前驅(qū)體溶液逐漸變成深紅色，可能是由于TiCl4和OM反應(yīng)生成了TiCl4-OM復(fù)合物。當(dāng)溫度達到300 oC時，溶于OM的硫粉加入到反應(yīng)溶液中。溶液顏色立刻變成了棕褐色，表明了TiS2快速的形成。對形成的產(chǎn)物用XRD進行分析。圖中峰位與資料卡片相一致，并且結(jié)果表明合成的TiS2為立方晶相(圖2-1a)。TEM圖片顯示合成的T

16、iS2為二維層狀結(jié)構(gòu)，尺寸均一，直徑在100nm左右(圖2-1b)。高分辨率TEM表明TiS2有著0.254nm 的晶格間隔(圖2-1c)。除了C,O,Cu等基底上的元素，只有Ti和S的峰能夠在EDS波譜中檢測到(圖2-1d)。圖2-1.(a) TiS2的XRD分析。(b) TiS2的TEM圖。(c)TiS2的HRTEM圖。(d) TiS2的X射線能量色散光譜。 TiS2納米薄片的表面修飾與表征由于疏水性的油胺包裹在TiS2表面，基于疏水作用，兩親性的高分子如C18PMH-PEG能被用來修飾TiS2，使其獲得良好的水溶性。動態(tài)光散射數(shù)據(jù)表明TiS2-PEG最后的尺寸在大概100nm(圖2-2a

17、)。經(jīng)過表面修飾后，TiS2-PEG在包括生理鹽水，細胞培養(yǎng)液，牛血清等多種溶液中表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性(圖2-2b inset)。圖2-2. (a)PEG修飾的TiS2納米薄片在水中的動態(tài)光散射數(shù)據(jù)。(b) TiS2納米薄片的UV-vis-NIR吸收光譜。插圖: TiS2-PEG在水、PBS、培養(yǎng)基、牛血清等溶液中的穩(wěn)定性。2.3.3 TiS2納米薄片的光熱穩(wěn)定性TiS2納米薄片的UV-vis-NIR光譜顯示出其在紫外到近紅外區(qū)有著很寬的吸收(圖2-2b)。在808nm處TiS2-PEG的消光系數(shù)被測定為26.8 Lg-1cm-1，和之前報道的過渡金屬二維硫化物如WS2和MoS2等相似。TiS2

18、-PEG在近紅外區(qū)的強吸收表明它能夠作為一種優(yōu)良的光吸收試劑用于光熱治療。為了檢測TiS2-PEG的光熱穩(wěn)定性，我們用0.8W/cm2的808nm激光照射0.1mg/ml的TiS2-PEG溶液，然后測其吸收光譜，光譜未發(fā)生明顯變化，表明TiS2-PEG納米薄片在照射近紅外激光期間非常穩(wěn)定(圖2-3)。圖2-3.經(jīng)過808nm激光照射不同的時間后，TiS2-PEG的吸收光譜。2.4 本章小結(jié)我們成功地用自下而上的方法合成了TiS2納米薄片，并對其形貌與性質(zhì)進行了初步表征。實驗合成的TiS2納米薄片呈圓盤狀，尺寸均一，直徑在100nm左右。經(jīng)過C18PMH-PEG修飾后，TiS2納米薄片表現(xiàn)出良好

19、的水溶性，在各種生理溶液中亦有很高的穩(wěn)定性。從UV-vis-NIR光譜可以看出，TiS2-PEG在近紅外區(qū)有很強的光吸收。TiS2-PEG經(jīng)過808nm激光長時間照射后，吸收光譜仍然不變，表現(xiàn)出良好的光熱穩(wěn)定性，具有應(yīng)用于光熱治療的潛力。參考文獻1. Butler, S. Z.; Hollen, S. M.; Cao, L.; Cui, Y.; Gupta, J. A.; Gutierrez, H. R.; Heinz, T. F.; Hong, S. S.; Huang, J.; Ismach, A. F., Progress, challenges, and opportunities i

20、n two-dimensional materials beyond graphene. ACS nano 2013, 7, 2898-2926.2. Geim, A. K.; Novoselov, K. S., The rise of graphene. Nature materials 2007, 6, 183-191.3. Wilson, J.; Yoffe, A., The transition metal dichalcogenides discussion and interpretation of the observed optical, electrical and stru

21、ctural properties. Advances in Physics 1969, 18, 193-335.4. Wang, Q. H.; Kalantar-Zadeh, K.; Kis, A.; Coleman, J. N.; Strano, M. S., Electronics and optoelectronics of two-dimensional transition metal dichalcogenides. Nature nanotechnology 2012, 7, 699-712.5. Dines, M. B., Lithium intercalation via

22、n-butyllithium of the layered transition metal dichalcogenides. Materials Research Bulletin 1975, 10, 287-291.6. Tributsch, H., LayerType Transition Metal Dichalcogenidesa New Class of Electrodes for Electrochemical Solar Cells. Berichte der Bunsengesellschaft für physikalische Chemie 1977, 81,

23、 361-369.7. Bringley, J. F.; Liebert, N. B., Controlled chemical and drug delivery via the internal and external surfaces of layered compounds. Journal of dispersion science and technology 2003, 24, 589-605.8. Pumera, M.; Loo, A. H., Layered transition-metal dichalcogenides (MoS2 and WS2) for sensin

24、g and biosensing. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2014, 61, 49-53.9. Cheng, L.; Liu, J.; Gu, X.; Gong, H.; Shi, X.; Liu, T.; Wang, C.; Wang, X.; Liu, G.; Xing, H., PEGylated WS2 Nanosheets as a Multifunctional Theranostic Agent for in vivo DualModal CT/Photoacoustic Imaging Guided Photothermal T

25、herapy. Advanced Materials 2014, 26, 1886-1893.10. Yin, W.; Yan, L.; Yu, J.; Tian, G.; Zhou, L.; Zheng, X.; Zhang, X.; Yong, Y.; Li, J.; Gu, Z., High-Throughput Synthesis of Single-Layer MoS2 Nanosheets as a Near-Infrared Photothermal-Triggered Drug Delivery for Effective Cancer Therapy. ACS nano 20

26、14, 8, 6922-6933.11. Liu, T.; Wang, C.; Gu, X.; Gong, H.; Cheng, L.; Shi, X.; Feng, L.; Sun, B.; Liu, Z., Drug Delivery with PEGylated MoS2 Nanosheets for Combined Photothermal and Chemotherapy of Cancer. Advanced Materials 2014, 26, 3433-3440.12. Seayad, A. M.; Antonelli, D. M., Recent Advances in

27、Hydrogen Storage in MetalContaining Inorganic Nanostructures and Related Materials. Advanced Materials 2004, 16, 765-777.13. Chen, J.; Li, S.-L.; Tao, Z.-L.; Shen, Y.-T.; Cui, C.-X., Titanium disulfide nanotubes as hydrogen-storage materials. Journal of the American Chemical Society 2003, 125, 5284-

28、5285.第三章 TiS2-PEG在細胞內(nèi)的光熱治療3.1 引言光熱治療作為一種新的腫瘤治療模式在近些年引起了廣泛的關(guān)注1。通過使用近紅外的吸光試劑將光能轉(zhuǎn)化為熱能從而燒毀腫瘤，光熱治療相比傳統(tǒng)的腫瘤治療方式如手術(shù)、化療、放療等有著明顯的優(yōu)勢，其能夠?qū)δ[瘤進行定點殺傷而不影響正常組織，實現(xiàn)了高效率和最小的侵襲性。由于腫瘤的EPR效應(yīng)或在光熱試劑表面偶聯(lián)上靶向分子，光熱試劑經(jīng)注射進入體內(nèi)后能夠被動或主動地富集于腫瘤部位，在外加激光的情況下，能夠殺傷腫瘤細胞。最近，很多近紅外有吸收的納米材料被發(fā)展成為光熱試劑用作腫瘤治療，如金納米材料2, 3，碳基納米材料4-6，硫化銅納米顆粒7, 8，鈀納米片9

29、, 10，以及一些有機高分子聚合物11, 12和自組裝有機小分子13。我們用PEG對合成好的TiS2納米薄片進行表面修飾，使其在各種生理溶液中獲得良好的穩(wěn)定性，提高了生物相容性，對腫瘤細胞亦沒有明顯的毒性。對TiS2-PEG的表征發(fā)現(xiàn)其在近紅外光區(qū)有著很強的吸收，在這章中我們考察了TiS2-PEG在體外對4T1腫瘤細胞的光熱殺傷效果。3.2 實驗部分3.2.1 實驗試劑和器材所有化學(xué)試劑通過商業(yè)渠道購買，未再經(jīng)過處理或者純化。所有實驗用水均為去離子水。聚乙二醇（mPEG-NH2，MW=5000）購買自浙江嘉興博美公司。油胺（OM）、碳十八烯（ODE）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺

30、鹽酸鹽（EDC）、聚馬來酸酐-1-十八烯（C18PMH）從Sigma-Aldrich公司購買。乙醇、四氯化鈦（TiCl4）、硫粉、三乙胺（TEA）、二氯甲烷（CH2Cl2）、氯仿（CH3Cl）等從國藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司購買。實驗所需耗材購自蘇州科益特生物有限公司。4T1（小鼠乳腺癌細胞）從美國細胞庫（American Type Culture Collection，ATCC）購買。細胞培養(yǎng)液等相關(guān)試劑從Invitrogen公司購買。3.2.2 實驗步驟 細胞毒性實驗小鼠的乳腺癌細胞（4T1）從美國細胞庫（ATCC）獲得。從液氮中取出細胞凍存管迅速解凍后離心去除上清，將細胞用RPMI-1640

31、培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)于37，5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中。待培養(yǎng)一段時間后細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部，用胰蛋白酶將細胞消化后加入到96孔板中，每孔約含細胞2×105個，培養(yǎng)過夜后，加入經(jīng)過離心除菌處理的的不同濃度TiS2-PEG并孵育24小時。通過MTT方法測得細胞的相對活力。3.2.2.2 光熱升溫實驗將去離子水和0.06、0.12、0.25、0.5mg/ml的TiS2-PEG各取2ml加入寬度為1cm的比色皿中，用三腳架固定好紅外熱成像儀，調(diào)節(jié)808nm激光器使其功率密度為0.8W/cm2，用激光器照射比色皿的同時用紅外熱成像儀進行成像和溫度記錄。記錄各組樣品5分鐘內(nèi)的升溫過程。

32、每隔30s取一次溫度值，繪制出不同濃度TiS2-PEG溶液以及超純水5分鐘內(nèi)的升溫曲線。3.2.2.3 光熱殺傷實驗小鼠的乳腺癌細胞（4T1）從美國細胞庫（ATCC）獲得。從液氮中取出細胞凍存管迅速解凍后離心去除上清，將細胞用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)于37，5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中。待培養(yǎng)一段時間后細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部，用胰蛋白酶將細胞消化后加入到96孔板中，每孔約含細胞2×105個，培養(yǎng)過夜后，與0.0125、0.025、0.05、0.1mg/ml的TiS2-PEG孵育6h，然后用0.8W/cm2的808nm激光照射5min。通過MTT測得細胞相對活力。 光

33、熱成像實驗4T1細胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37，5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中。待細胞生長狀態(tài)良好并基本鋪滿培養(yǎng)皿底部后，用胰蛋白酶消化后，取適量細胞懸液加入4個35mm的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞生長鋪滿培養(yǎng)皿底部后，加入不同濃度的TiS2-PEG并孵育4小時，對照組加入同體積的PBS。然后用0.8W/cm2的808nm激光照射5分鐘。照射完后用PBS清洗兩遍，并用臺盼藍染色30分鐘，再經(jīng)PBS洗過后用Leica光學(xué)顯微鏡進行成像。3.2.3 儀器表征高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM，加速電壓200kV）：美國FEI公司，Tecnai F20。X-射

34、線粉末衍射儀（XRD）：荷蘭PANalytical公司，Empyrean，Cu靶。動態(tài)光散射儀：英國Malvern公司，ZEN3690。紫外可見近紅外分光光度計（UV-vis-NIR）：HORIBA公司，LAMBDA 750。激光器：北京海特光電科技有限公司。紅外熱成像儀：Irsight Systems公司。3.3 實驗結(jié)果與討論 TiS2-PEG的細胞毒性在使用PEG修飾的TiS2納米薄片用于體內(nèi)的成像和治療前，我們先用MTT實驗檢測了它的細胞毒性。不同濃度的TiS2-PEG與細胞孵育24h后，可以觀察到即使TiS2-PEG的濃度高至0.1mg/ml，對于4T1細胞也沒能觀察到明顯的毒性，表

35、明該納米材料有著低細胞毒性和良好的生物相容性(圖3-1)。該材料顯示出的良好生物安全性為接下來的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。圖3-1. 細胞毒性試驗。4T1細胞與不同濃度的TiS2-PEG孵育24h后的細胞相對存活率。細胞相對存活率由標(biāo)準(zhǔn)的MTT方法測得。3.3.2 TiS2-PEG的光熱治療3.3.2.1 升溫曲線的測定TiS2-PEG的光熱升溫曲線如圖所示，水和不同濃度的TiS2-PEG用0.8W/cm2的808nm激光照射，用紅外熱成像儀記錄其5分鐘內(nèi)升溫過程(圖3-2b)。實驗發(fā)現(xiàn)，去離子水的升溫不明顯，而隨著TiS2-PEG濃度的增加，升溫的幅度也變大(圖3-2a)。這是因為TiS2-PEG在近

36、紅外光區(qū)有很強的吸收，能夠?qū)⒐饽苻D(zhuǎn)化為熱能，從而導(dǎo)致溶液溫度的升高。圖3-2. TiS2-PEG 的升溫實驗。(a) 水和不同濃度的TiS2-PEG在0.8W/cm2的808nm激光照射后的光熱升溫曲線。(b) 水和不同濃度的TiS2-PEG在0.8W/cm2的808nm激光照射后的熱成像圖。3.3.2.2 TiS2-PEG對腫瘤細胞的光熱殺傷然后我們使用TiS2-PEG作為光熱材料在激光照射的情況下用于體外的腫瘤細胞殺傷。4T1細胞和不同濃度的TiS2-PEG孵育6小時，然后加以0.8W/cm2的808nm激光照射。MTT實驗結(jié)果表明，隨著TiS2-PEG濃度的增加，更多的腫瘤細胞被殺死(圖

37、3-3a)。在與0.1mg/ml TiS2-PEG孵育并以0.8W/cm2激光照射5分鐘后視野中幾乎全是死細胞，表明大部分腫瘤細胞在激光照射期間都被殺死了(圖3-3b)，此結(jié)果與MTT實驗中的數(shù)據(jù)亦相吻合。該實驗表明TiS2-PEG能夠作為一種非常有效的光熱試劑。圖3-3. (a)細胞和不同濃度的TiS2-PEG孵育6h后，以0.8W/cm2激光照射5分鐘后的細胞相對存活率。(b)經(jīng)過不同濃度的TiS2-PEG孵育和激光照射，用臺盼藍對細胞進行染色并拍下光學(xué)照片。3.4 本章小結(jié)在本章中，我們探究了TiS2-PEG對4T1腫瘤細胞的毒性，經(jīng)過PEG修飾的TiS2即使在濃度較高時亦未見明顯的細胞

38、活性影響，表明該材料有著良好的生物相容性。光熱升溫的實驗發(fā)現(xiàn)隨著材料濃度的增大，升溫的效果也越明顯。表明該材料可以作為潛在的光熱試劑用作光熱治療。將4T1細胞與不同濃度的TiS2-PEG孵育后，外加808nm激光照射，顯示出明顯的腫瘤細胞殺傷效果，并呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系。體外細胞實驗獲得了良好的腫瘤光熱治療效果，為進行進一步體內(nèi)腫瘤光熱治療奠定了基礎(chǔ)。參考文獻1. Huang, X.; El-Sayed, I. H.; Qian, W.; El-Sayed, M. A., Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infra

39、red region by using gold nanorods. Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 2115-2120.2. El-Sayed, I. H.; Huang, X.; El-Sayed, M. A., Selective laser photo-thermal therapy of epithelial carcinoma using anti-EGFR antibody conjugated gold nanoparticles. Cancer letters 2006, 239, 129-135.3.H

40、uang, X.; Jain, P. K.; El-Sayed, I. H.; El-Sayed, M. A., Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers in medical science 2008, 23, 217-228.4.Zhou, F.; Xing, D.; Ou, Z.; Wu, B.; Resasco, D. E.; Chen, W. R., Cancer photothermal therapy in the near-infrared region by using sin

41、gle-walled carbon nanotubes. Journal of Biomedical Optics 2009, 14, 021009-021009-7.5.Robinson, J. T.; Welsher, K.; Tabakman, S. M.; Sherlock, S. P.; Wang, H.; Luong, R.; Dai, H., High performance in vivo near-IR (> 1 m) imaging and photothermal cancer therapy with carbon nanotubes. Nano research

42、 2010, 3, 779-793.6.Yang, K.; Zhang, S.; Zhang, G.; Sun, X.; Lee, S.-T.; Liu, Z., Graphene in mice: ultrahigh in vivo tumor uptake and efficient photothermal therapy. Nano letters 2010, 10, 3318-3323.7.Zhou, M.; Zhang, R.; Huang, M.; Lu, W.; Song, S.; Melancon, M. P.; Tian, M.; Liang, D.; Li, C., A

43、chelator-free multifunctional 64Cu CuS nanoparticle platform for simultaneous micro-PET/CT imaging and photothermal ablation therapy. Journal of the American Chemical Society 2010, 132, 15351-15358.8.Zha, Z.; Wang, S.; Zhang, S.; Qu, E.; Ke, H.; Wang, J.; Dai, Z., Targeted delivery of CuS nanopartic

44、les through ultrasound image-guided microbubble destruction for efficient photothermal therapy. Nanoscale 2013, 5, 3216-3219.9.Tang, S.; Huang, X.; Zheng, N., Silica coating improves the efficacy of Pd nanosheets for photothermal therapy of cancer cells using near infrared laser. Chem. Commun. 2011,

45、 47, 3948-3950.10.Fang, W.; Tang, S.; Liu, P.; Fang, X.; Gong, J.; Zheng, N., Pd NanosheetCovered Hollow Mesoporous Silica Nanoparticles as a Platform for the ChemoPhotothermal Treatment of Cancer Cells. Small 2012, 8, 3816-3822.11.Yang, K.; Xu, H.; Cheng, L.; Sun, C.; Wang, J.; Liu, Z., In Vitro an

46、d In Vivo NearInfrared Photothermal Therapy of Cancer Using Polypyrrole Organic Nanoparticles. Advanced Materials 2012, 24, 5586-5592.12.Zha, Z.; Yue, X.; Ren, Q.; Dai, Z., Uniform polypyrrole nanoparticles with high photothermal conversion efficiency for photothermal ablation of cancer cells. Advan

47、ced Materials 2013, 25, 777-782.13.Yu, J.; Javier, D.; Yaseen, M. A.; Nitin, N.; Richards-Kortum, R.; Anvari, B.; Wong, M. S., Self-assembly synthesis, tumor cell targeting, and photothermal capabilities of antibody-coated indocyanine green nanocapsules. Journal of the American Chemical Society 2010

48、, 132, 1929-1938.第四章 TiS2-PEG在活體上的光聲成像和光熱治療4.1 引言光聲技術(shù)具有比近紅外技術(shù)更好的生物組織穿透性，同時具有無副作用、分辨率高等特點1。光聲成像系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)內(nèi)源性的結(jié)構(gòu)成像，在光聲試劑的輔助下更能夠得到對比度更高的圖像。目前它已經(jīng)被用于生物醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域2-6。細胞水平的實驗已經(jīng)證明TiS2-PEG可以作為很好的光熱試劑用作腫瘤細胞的治療。在這章中，我們利用材料本身具有的光學(xué)性質(zhì)，通過尾靜脈將材料注射到小鼠體內(nèi)，利用光聲斷層掃描儀對腫瘤部位進行光聲成像。由于TiS2-PEG在腫瘤部位有很高的富集，所以腫瘤的光聲成像效果非常明顯。目前，很多納米材料

49、如金納米材料7, 8，碳納米管9, 10，石墨烯11-13等都已經(jīng)實現(xiàn)了活體的腫瘤治療。我們在光聲成像的指導(dǎo)下，嘗試著將TiS2-PEG用于活體水平的腫瘤光熱治療。通過尾靜脈注射TiS2-PEG進帶有4T1腫瘤的小鼠體內(nèi)，外加808nm激光照射，記錄腫瘤的生長情況以及小鼠的生存率，觀察TiS2-PEG在活體水平的腫瘤光熱治療效果。結(jié)果表明，經(jīng)過光熱治療的腫瘤能夠全部被殺滅，顯示出TiS2-PEG作為光熱試劑的良好性能。4.2 實驗部分4.2.1 實驗試劑與器材所有化學(xué)試劑通過商業(yè)渠道購買，未再經(jīng)過處理或者純化。所有實驗用水均為去離子水。聚乙二醇（mPEG-NH2，MW=5000）購買自浙江嘉興

50、博美公司。油胺（OM）、碳十八烯（ODE）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、聚馬來酸酐-1-十八烯（C18PMH）從Sigma-Aldrich公司購買。乙醇、四氯化鈦（TiCl4）、硫粉、三乙胺（TEA）、二氯甲烷（CH2Cl2）、氯仿（CH3Cl）等從國藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司購買。實驗所需耗材購自蘇州科益特生物有限公司。4T1（小鼠乳腺癌細胞）從美國細胞庫（American Type Culture Collection，ATCC）購買。細胞培養(yǎng)液等相關(guān)試劑從Invitrogen公司購買。實驗用雌性BALB/c小鼠購買自南京彭升生物科技有限公司，所有小鼠都在蘇州大

51、學(xué)動物中心批準(zhǔn)的協(xié)議下使用。4.2.2 實驗步驟4.2.2.1 腫瘤模型建立4T1細胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細胞可用作腫瘤接種時，將培養(yǎng)基吸去，加入胰酶消化，離心后用PBS清洗，最后將細胞重懸于約30l的無血清培養(yǎng)基中。將該30l懸浮有106個4T1細胞的無血清RMPI-1640培養(yǎng)基皮下注射到每只小鼠的背部。腫瘤生長一周，其體積大概為60mm3時，可進行后續(xù)實驗。4.2.2.2 體內(nèi)光聲成像用光聲計算機斷層掃描儀進行光聲圖像采集。實驗中用戊巴比妥鈉（50mg/kg）對小鼠進行麻醉。通過使用水熱系統(tǒng)使小鼠體溫維持在37.5 oC。在成像前，將T

52、iS2-PEG尾靜脈注射進帶有腫瘤的小鼠體內(nèi)。 體內(nèi)光熱治療在尾靜脈注射TiS2-PEG（2mg/ml, 200l, dose=20mg/kg）進荷瘤小鼠12小時后，用808nm的近紅外激光以0.8 W/cm2的功率照射5分鐘。對照組小鼠分別注射相同體積的生理鹽水并加以激光照射和注射TiS2-PEG但不加激光照射。腫瘤表面的溫度用熱成像儀記錄。腫瘤的體積用游標(biāo)卡尺每隔一天進行測量。腫瘤體積=腫瘤長度×腫瘤寬度2/2。相對腫瘤體積以V/V0表示（V0是治療開始前的腫瘤體積）。4.2.2.4 組織切片分析尾靜脈注射TiS2-PEG 30天后，分別取治療組和對照組3只小鼠進行CO2窒息后解

53、剖，收集主要的組織器官，進行固定，石蠟包埋后切成8微米左右的薄片，并用蘇木素/伊紅（H&E）染色。用光學(xué)顯微鏡對各器官進行拍照。4.2.3 儀器表征高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM，加速電壓200kV）：美國FEI公司，Tecnai F20。X-射線粉末衍射儀（XRD）：荷蘭PANalytical公司，Empyrean，Cu靶。動態(tài)光散射儀：英國Malvern公司，ZEN3690。紫外可見近紅外分光光度計（UV-vis-NIR）：HORIBA公司，LAMBDA 750。激光器：北京海特光電科技有限公司。紅外熱成像儀：Irsight Systems公司。光聲斷層掃描儀：Endra公司 N

54、exus128, Ann Arbor, MI。4.3 實驗結(jié)果與討論4.3.1 TiS2-PEG用于活體水平的光聲成像光聲成像是一種非創(chuàng)傷性的成像模式，與傳統(tǒng)的光學(xué)成像模式相比，它能夠提供更高的體內(nèi)空間和深度分辨率(圖4-1b)。我們發(fā)現(xiàn)有著近紅外強吸收的TiS2-PEG能夠被用作良好的光聲成像造影劑(圖4-1a)。帶有4T1腫瘤的雌性Balb/c小鼠通過尾靜脈注射TiS2-PEG。然后在0,2,4,8,12,24小時等時間點采集腫瘤的光聲成像圖片(圖4-1c)。在注射TiS2-PEG之前，只能看到腫瘤內(nèi)主要的血管。注射TiS2-PEG后能夠觀察到很強的光聲信號并分散在整個腫瘤中，說明了納米薄

55、片在腫瘤內(nèi)有效的富集。這一現(xiàn)象可能是由于腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng)。圖4-1. 腫瘤光聲成像。(a)水和TiS2-PEG的光聲圖片。(b)尾靜脈注射TiS2-PEG后的光聲成像示意圖。(c)尾靜脈注射TiS2-PEG后，不同時間點的腫瘤光聲成像圖。 TiS2-PEG用于小鼠腫瘤的光熱治療然后，我們使用TiS2-PEG作為光熱試劑用作體內(nèi)腫瘤治療。帶有4T1腫瘤的小鼠分別尾靜脈注射TiS2-PEG溶液（2mg/ml，200l）和生理鹽水。注射完24小時后，將小鼠身上的腫瘤用0.8W/cm2功率的808nm激光照射5分鐘。用紅外熱成像儀記錄這些腫瘤的溫度變化。由于TiS2-PEG的強近紅外吸收以及高

56、腫瘤富集，注射TiS2-PEG的小鼠的腫瘤溫度在激光照射下5分鐘內(nèi)升高到65左右。注射生理鹽水的對照組在相同條件下腫瘤的表面溫度只有一點變化(圖4-2a)。我們同時對TiS2-PEG的體內(nèi)腫瘤光熱治療效果進行評估。當(dāng)腫瘤體積達到60mm3后，接種有4T1腫瘤的小鼠被分成4組，每組5只。治療組小鼠通過尾靜脈注射TiS2-PEG。24小時后將小鼠用0.8W/cm2的808nm激光照射5分鐘。其他三個對照組分別為注射PBS照激光組，注射PBS不照激光組以及注射TiS2-PEG不照激光組。實驗發(fā)現(xiàn)治療組小鼠的腫瘤在1天后小時，原始腫瘤位置留下黑色的疤痕，并于十天后脫落(圖4-2d)。每2天測量各組小鼠

57、腫瘤的體積。治療組小鼠的腫瘤完全消融，而其他組的腫瘤都生長得很快(圖4-2b)。三個對照組的小鼠都在16天內(nèi)死亡，而經(jīng)過光熱治療的實驗組小鼠都存活超過60天(圖4-2c)。我們的實驗結(jié)果表明TiS2-PEG是一種非常高效的光熱試劑，能夠被用作體內(nèi)的腫瘤治療。圖4-2. 體內(nèi)光熱治療。(a)經(jīng)過尾靜脈注射TiS2-PEG溶液(2 mg/mL, 200 l)和0.8W/cm2的808nm激光照射5分鐘的荷瘤小鼠紅外熱成像圖。(b)經(jīng)過不同治療后各組小鼠腫瘤的生長曲線。相對腫瘤體積與原始體積進行歸一化。治療組小鼠在尾靜脈注射TiS2-PEG后照射0.8W/cm2的808nm激光5分鐘。另外三組用作對

58、照組：注射生理鹽水組；注射TiS2-PEG但不照激光組；照激光但不注射TiS2-PEG組。(c)經(jīng)過各種處理后各組小鼠的生存曲線。(d) 尾靜脈注射TiS2-PEG后，照射激光前和照射激光10天后小鼠的照片。4.3.3 TiS2-PEG對小鼠的毒性研究我們探究了TiS2-PEG納米薄片的體內(nèi)潛在毒性。在經(jīng)過尾靜脈注射TiS2-PEG和光熱治療后監(jiān)測Balb/c小鼠的行為。在60天內(nèi)沒觀察到一只老鼠死亡或者任何毒性的標(biāo)志。將小鼠處死后收集主要的器官進行HE染色作組織學(xué)分析(圖4-3)。我們的實驗結(jié)果表明在我們實驗的劑量上TiS2-PEG對小鼠沒有表現(xiàn)出明顯的毒性。圖4-3. 實驗組和對照組小鼠主要器官切片的H&E染色圖。4.4 本章小結(jié)在本章中我們主要研究了TiS2-PEG在小鼠活體水平的腫瘤光聲成像和光熱治療。以及TiS2-PEG對小鼠的毒性進行了初步研究。我們的研究發(fā)現(xiàn)TiS2-PEG能夠在小鼠腫瘤部位實現(xiàn)很高的富集，獲得了很好的腫瘤光聲成像效果。在外加激光的照射下，TiS2-PEG表現(xiàn)出很強的腫瘤殺傷能力，實驗組未見腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。我們同時研究了TiS2-PEG對小鼠的潛在毒性，小鼠各組織器官未見異常，表明TiS2-PEG對小鼠沒有明顯的毒性。為TiS2-PEG的